CN110117557A - 一种生防菌hn-2及提取物在制备抑制病原真菌制剂上的应用 - Google Patents

一种生防菌hn-2及提取物在制备抑制病原真菌制剂上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物领域，公开了一种生防菌HN‑2及提取物在制备抑制病原真菌制剂上的应用。所述生防菌HN‑2为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HN‑2，保藏编号为CCTCC NO:M 2018382。其菌株及从其菌株发酵液中提取得到的提取物对有很强的抑制芒果炭疽病病原真菌的能力，其抑菌效果好，抑菌率高。只需对菌株发酵液经过简单的处理即可直接获得有效成分，制备方法简单，成本低廉，具有开发成拮抗芒果炭疽病病原真菌的新型生物农药的价值。

Description

一种生防菌HN-2及提取物在制备抑制病原真菌制剂上的应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别是一种生防菌HN-2及提取物在制备抑制病原 真菌制剂上的应用。
背景技术
芒果炭疽病是芒果生长期及储藏期的主要病害之一。它是由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloesporioides Penz)侵染所引起的真菌病害，主要危害芒果的 嫩稍、叶片、花和果实，造成稍枯、落花落果等。目前主要的防治措施为抗病 品种的种植以及化学农药的使用。常用的化学药剂主要为：多菌灵、咪鲜胺和 代森锰锌等。代森锰锌为保护性农药，其杀菌范围广且不易产生抗性。但锰锌 制剂会引起作物微量元素积累中毒。咪鲜胺可以抑制麦角甾醇生物合成，兼具 保护和铲除作用，可对多数子囊菌和半知菌病害有显著防效。咪鲜胺属于低毒 杀菌剂，对哺乳动物和鸟类均低毒(姚庚西，2015)。多菌灵为苯并咪唑类化合 物，是一种高效低毒的内吸性农药，具有保护和治疗的作用。但高浓度的多菌 灵会对植物和动物产生危害，在美国和欧盟国家多菌灵为禁用药(魏中华、徐 娟等，2015)。同时，长期使用化学药剂，不仅化学药剂的残留会对环境造成危 害，还会导致芒果炭疽病病原真菌产生变异从而使药剂失效。
脂肽类物质是芽孢杆菌通过非核糖体途径合成的一类具有广谱抑制病原菌 的活性化合物，该种活性成分具有低毒高效、不容易产生抗药性等特点，具有 较好的生防潜力，是近年的研究重点，如何从从自然界中挖掘产生该类物质的 菌株和如何提高芽孢杆菌产生脂肽类物质的产量也是研究的热点。
发明内容
本本发明提出一种生防菌HN-2及提取物在制备抑制病原真菌制剂上的应 用。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种生防菌HN-2在制备抑制病原真菌的制剂上的应用，所述生防菌HN-2 为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HN-2，其保藏编号为CCTCC NO:M 2018382。
一种生防菌HN-2的提取物在制备抑制病原真菌的制剂上的应用，所述的提 取物是从权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌HN-2中提取得到的。
进一步，所述的病原真菌为芒果炭疽病病原真菌。
进一步，所述的提取物为贝莱斯芽孢杆菌HN-2发酵液离心后所得的上清 液，通过正丁醇萃取、酸沉淀和/或硫酸铵沉淀得到的脂肽类物质。
进一步，所述的发酵液的制备方法为：将保存的生防菌菌株HN-2接种于 LB培养基上28℃活化培养，培养2天，挑取适量生防菌HN-2加入到液体的LB 培养基中，摇床28℃，180转/分钟摇菌48小时，即得发酵液。
进一步，所述的正丁醇萃取的操作方法为：发酵液离心去除菌体，即得即 无菌体发酵液；加入正丁醇萃取，分离得到上层正丁醇层，去除正丁醇溶剂即 得提取物。
进一步，所述加入的正丁醇与无菌体发酵液的体积比为1:1。
进一步，所述的酸沉淀的操作方法为：发酵液离心去除菌体，保留上清液， 加入盐酸滴定至PH值为2，密封后冷藏，之后离心，弃去上清液，得到沉淀即 可。
进一步，所述的步骤(2)中，滴定所用的盐酸的摩尔浓度为2mol/L；冷 藏的条件为4℃冷藏12小时，离心时控制转速10000转/分钟，离心10分钟。
进一步，所述的硫酸铵沉淀的操作方法为：发酵液离心去除菌体，保留上 清液，加入硫酸铵粉末，充分反应后，离心，弃去上清液，得到沉淀即可。
本发明的有益效果：
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HN-2是从豇豆中分离筛选得到的， 已经于2018年06月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉大 学，保藏编号为CCTCC NO:M 2018382。其菌株及从其菌株发酵液中提取得到 的提取物对有很强的抑制芒果炭疽病病原真菌的能力，其抑菌效果好，抑菌率 高。只需对菌株发酵液经过简单的处理即可直接获得有效成分，制备方法简单， 成本低廉，具有开发成拮抗芒果炭疽病病原真菌的新型生物农药的价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施 例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述 中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付 出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为HN-2菌株对芒果炭疽病病原菌的抑制效果；
图2不同浓度的正丁醇提取物对芒果炭疽病病原真菌的抑制效果；
图中，(1)为对照组，(2)为终浓度20μg/mL；(3)为终浓度为50μg/mL， (4)终浓度为100μg/mL，(5)终浓度为250μg/mL，(6)终浓度为500μg/mL；
图3正丁醇提取物对对芒果炭疽病病原真菌菌丝的影响；
图中，(1)为空白对照组；(2)HN-2发酵液正丁醇提取物
图4正丁醇提取物对芒果果实表面防效
图中，A:无处理对照组B：只接种PDA固体培养基E：左边涂抹HN-2正丁 醇提取物并接菌，右边涂抹无菌水并接菌。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清 楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是 全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造 性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、3种贝莱斯芽孢杆菌HN-2提取物的制备
(1)正丁醇萃取法制备化合物
将保存的生防菌菌株HN-2接种于LB培养基上28℃活化培养，培养2天， 挑取适量生防菌HN-2加入到液体的LB培养基中，摇床28℃，180转/分钟摇菌 48小时，即得到发酵液，利用高速离心机，10000转/分钟离心10分钟去除菌体， 保留上清液即得无菌体发酵液。
按无菌体发酵液与正丁醇为1:1的比例加入正丁醇，使两种溶液充分混合后 静止过夜(12小时)，用分液漏斗萃取得到上层正丁醇，利用旋转蒸发仪，蒸出 有机溶剂正丁醇即得到本申请所述的化合物。
(2)盐酸沉淀法制备化合物
参照实施例1的方法制得无菌体发酵液，用2mol/L的盐酸滴定，调节发酵 液PH值,使PH值调节到2时停止滴加盐酸，封口放入4℃冰箱冷藏过夜(12 小时)，再利用高速离心机4℃，10000转/分钟，离心10分钟，弃去上清液，得 到沉淀，沉淀即是本申请所述的化合物。
(3)硫酸铵饱和沉淀法制备化合物
参照实施例1的方法制得无菌体发酵液，菌液10000转/分钟离心10min，缓 慢加入硫酸铵粉末，沉淀蛋白，4℃静置过夜(12小时)，待充分反应后，离心 得到沉淀，即为本申请所述的化合物。
为了便于保存，上述实施例中所得的粗提物利用冷冻干燥机进行干燥得到 干粉末再进行保存。
二、HN-2菌株对芒果炭疽病病原真菌的抑菌试验
将芒果炭疽病病原真菌接种到9cm PDA培养平板上，在距离中央位置2.5cm 的地方对称放置两个牛津杯，并在牛津杯中接种HN-2菌株，重复三组。将培养 皿正置并放于28℃暗箱中培养。待芒果炭疽病病原菌长至整个培养皿的2/3时 进行抑菌观察。其结果如图1所示。抑制率计算公式为：
其中
I——真菌菌丝抑制率；
D0——空白对照组真菌菌落增长直径；
D1——药剂处理组真菌菌落增长直径。
试验结果表明：按公式(1)进行计算，可算得HN-2菌株对芒果炭疽病病 原真菌的抑制率为48.01％。
三、生防菌HN-2抑菌活性成分粗提取方法及对真菌孢子萌发影响测试 (1)纸碟法对真菌孢子平板测试
将芒果炭疽病病原真菌活化后，接种在100mL，CMC液体培养基中，28℃， 180转培养3-5d。用四层纱布过滤掉菌丝得到芒果炭疽病病原真菌孢子悬浮液。 将孢子悬浮液与融化后冷却到40℃的PDA固体培养基按体积比为1：1进行混合， 倒平板冷却后即为芒果炭疽病病原真菌孢子悬浮液平板。再分别将HN-2发酵液 的硫酸铵沉淀、酸沉淀和正丁醇提取物经冷冻干燥后形成的粉末按浓度为 50mg/mL配成溶液后滴加10μL在直径为6mm的滤纸片上，待滤纸片干燥后在孢 子悬浮液平板上距离中央2.5cm处对称放置滤纸片，在孢子悬浮液平板中央放置 滴加了10μL无菌水的直径为6mm的滤纸片。培养皿倒置放入28℃暗箱中培养48h 后进行抑菌观察，重复三组。
抑菌试验结果表明，HN-2菌株发酵液通过酸沉淀法、硫酸铵沉淀法和正丁 醇萃取法提取出的活性物质对芒果炭疽病病原真菌均有抑制效果。酸沉淀提取 物对该菌的抑菌圈大小为12.82±0.26mm；硫酸铵提取物对该菌的抑菌圈大小为 13.57±0.17mm；正丁醇萃取提取物对该菌的抑菌圈为20.93±0.45mm。由此可 见，正丁醇提取物的抑菌活性最好。(数据见表1和图2)
表1：三种提取方式对芒果炭疽病病原真菌抑制效果数据
四、HN-2发酵液正丁醇提取物对芒果炭疽病病原真菌半最大效应浓度(EC50) 试验
分别将100μL浓度为1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL 和50mg/mL的HN-2发酵液正丁醇提取物加到10mL融化冷却到50℃左右的 PDA固体培养基中混匀(即终浓度分别为20μg/mL，50μg/mL，100μg/mL， 250μg/mL和500μg/mL)，倒平板(直径为9cm)。将活化后芒果炭疽病病原真菌 接种到平板上。对照组为不添加正丁醇提取物的10mL PDA培养基平板。待对 照组芒果炭疽病病原菌长至整个培养皿的2/3时进行观察和测量数据。真菌菌丝抑制率按公式(1)进行计算，通过SPSS软件进行数据分析，其EC50值为70.62 μg/mL，95％置信区间为30.408-163.978μg/mL(数据见表2和图3)。
表2：正丁醇提取物对芒果炭疽病病原真菌的EC50
五、显微镜观察生防菌HN-2发酵液正丁醇提取物对芒果炭疽病病原真菌的影 响
将芒果炭疽病病原真菌接种于50mL PDA中，在28℃下培养3d后，加入100μL浓度为50mg/mL的正丁醇提取物，即正丁醇提取物的浓度为100μg/mL， 共同培养8h。用无菌水重悬细胞3次，在显微镜下观察，如图3所示。通过试 验发现未经处理的芒果炭疽病菌正常生长，菌丝结构完整且粗细均匀，能产生 分生孢子。经过HN-2发酵液正丁醇粗提物处理后的菌丝生长异常，有大量明显 的菌丝顶端畸形膨大，形成囊泡结构，凝结成团，出现扭曲，断裂。产孢受到 抑制。
六、HN-2提取物对芒果果实保护试验
选取新鲜、大小均匀的灭菌水清洗过表皮的绿色未成熟芒果分为两部分， 在其中的一边涂抹HN-2菌株正丁醇提取物(终浓度10mg/mL)，另一边只涂 抹无菌水。再用无菌接种针轻轻刺破表皮，接入新鲜的芒果炭疽菌菌饼共六个 (直径为6mm)。以涂抹灭菌水和只接种PDA培养饼的芒果为对照，每组3个 处理，每次处理重复三次。在25℃下恒温保湿4d，通过观察并记录芒果果实 感病情况(图4)，分析HN-2正丁醇粗提物对芒果炭疽病害的表面防效。判断 芒果病害程度可采用五分制标准(彭永宏，1997)，病害程度：1-无任何病斑,2 -果皮病斑面积小于25％,3-果皮病斑面积为25-50％,4-果皮病斑面积为 50-75％,5-果皮病斑面积为75-100％。
试验结果表明：芒果果实表面只接种了芒果炭疽菌的芒果发病严重，表现 为菌丝蔓延，果实腐烂表面变黄变黑。病斑面积大于50％，属于四级病害程度。 HN-2发酵液正丁醇粗提物涂抹处理的芒果表面菌丝没有蔓延，果实形态正常， 未出现腐烂变黑症状，病斑面积小于25％，属二级轻微病害；说明直接涂抹HN-2 正丁醇粗提物对芒果炭疽菌真菌有明显的抑制作用。
七、7Luria-Bertani培养基成本核算
Luria-Bertani培养基配方(L)：胰蛋白胨(索莱宝)10g，酵母粉(索莱宝) 5g，NaCl(广化)10g，Ph7.0。胰蛋白胨(索莱宝，500g)180元，酵母粉(索 莱宝，500g)200元，NaCl(广化)15元，1L Luria-Bertani培养基：胰蛋白胨 3.6元，酵母粉2元，NaCl0.3元，合计5.9元，可得脂肽类提取物157mg，即 0.038元/mg。而常用的Landy培养基由于组分过多需要的药品药剂多，经核算 1L需要成本9.8元，提取的脂肽类物质210mg，即0.046元/mg。两者活性无差别。综上所述：Luria-Bertani培养基发酵得到的脂肽类物质最为经济。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生防菌HN-2在制备抑制病原真菌的制剂上的应用，所述生防菌HN-2为贝莱斯芽孢杆菌HN-2，其保藏编号为CCTCC NO:M 2018382。
2.一种生防菌HN-2的提取物在制备抑制病原真菌的制剂上的应用，所述的提取物是从权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌HN-2中提取得到的。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的病原真菌为芒果炭疽病病原真菌。
4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的提取物为贝莱斯芽孢杆菌HN-2发酵液离心后所得的上清液，通过正丁醇萃取、酸沉淀和/或硫酸铵沉淀得到的脂肽类物质。
5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的发酵液的制备方法为：将保存的生防菌菌株HN-2接种于LB培养基上28℃活化培养，培养2天，挑取适量生防菌HN-2加入到液体的LB培养基中，摇床28℃，180转/分钟摇菌48小时，即得发酵液。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的正丁醇萃取的操作方法为：发酵液离心去除菌体，即得即无菌体发酵液；加入正丁醇萃取，分离得到上层正丁醇层，去除正丁醇溶剂即得提取物。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述加入的正丁醇与无菌体发酵液的体积比为1:1。
8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的酸沉淀的操作方法为：发酵液离心去除菌体，保留上清液，加入盐酸滴定至PH值为2，密封后冷藏，之后离心，弃去上清液，得到沉淀即可。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的步骤(2)中，滴定所用的盐酸的摩尔浓度为2mol/L；冷藏的条件为4℃冷藏12小时，离心时控制转速10000转/分钟，离心10分钟。
10.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的硫酸铵沉淀的操作方法为：发酵液离心去除菌体，保留上清液，加入硫酸铵粉末，充分反应后，离心，弃去上清液，得到沉淀即可。
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