CN104195069A

CN104195069A - 一株防治稻瘟病的枯草芽孢杆菌2012syx04

Info

Publication number: CN104195069A
Application number: CN201410357380.4A
Authority: CN
Inventors: 王�琦; 沙月霞; 李燕; 付学池
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2014-07-24
Filing date: 2014-07-24
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2034-07-24
Also published as: CN104195069B

Abstract

本发明公开了一种防治稻瘟病的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其应用。本发明的枯草芽孢杆菌具有对稻瘟病的广谱且高效的防效，可用于各种品系水稻的稻瘟病防治，尤其是叶瘟和穗瘟的防治。

Description

一株防治稻瘟病的枯草芽孢杆菌2012SYX04

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株防治稻瘟病的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其应用。

背景技术

水稻是世界上重要的粮食作物，产量占据世界粮食总产量的1/4以上，占据中国粮食总产量一半以上，是全世界一半以上的人口所依赖的主食。稻瘟病(RiceBlast)是由子囊菌Magnaporthe oryzae(T.T.Hebert)Yaegashi&Udagawa(无性态：Pyricularia oryzae)引起的一种突发性强、易于流行的世界性真菌病害。该病一年四季均可对水稻造成危害，其危害遍及水稻的各个部位，有苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、枝梗瘟和谷粒瘟等。稻瘟病分布广泛，全球85个国家均有发生，也是我国南北稻区危害最严重的水稻病害之一。稻瘟病在全球每年造成10～30％的水稻产量损失，每年的产量损失可以养活全世界6千万人口。

目前对该稻瘟病菌的防治主要采用抗病品种的选育和化学防治，化学药剂长期使用不但增加农产品的农药残留还会造成生态环境严重污染，破坏生态系统平衡，威胁食品安全。枯草芽孢杆菌不仅能够有效控制植物病害，同时对人畜安全、植物病原菌不易产生抗性、促进植物生长等优点。值得一提的是枯草芽孢杆菌可以在化学农药不能施用的时期(譬如水稻黄熟期)防治稻瘟病的突发危害，最大限度减轻稻瘟病造成的产量损失，不会增加水稻有毒物质残留，更不会污染环境。

稻瘟病菌孢子是主要的侵染器官，孢子成熟后产生芽管，附着胞附在表面，芽管以自然孔口或以侵染栓从水稻表皮直接进入。其中，附着胞的形成是成功侵入的关键步骤之一，它必须产生足够的压力才能够机械穿透寄主角质层完成侵入过程，而黑色素就是产生附着胞压力的前提，附着胞与寄主表面接触一侧非常小的区域内沉积黑色素，最后形成附着胞孔，完成侵入过程。枯草芽孢杆菌通过成功定殖至植物根际、体表或体内，同稻瘟病菌竞争植物周围的营养、分泌抗菌物质抑制病原菌菌丝生长、分生孢子的萌发、使附着胞畸形和淡化黑色素，同时诱导水稻防御系统抵御稻瘟病菌的入侵，从而达到生防的目的。枯草芽孢杆菌与稻瘟病菌之间主要存在溶菌和抑菌现象，可以产生几丁质酶、糖脱酶、细胞壁降解酶等促使稻瘟病菌菌丝细胞壁溶解，特别是那些衰老的甚至接近死亡的菌丝更容易发生溶解。在湿度较大以至淹水的嫌气状态，引起的溶菌更为重要。水稻叶部试验证明，枯草芽孢杆菌的表面活性剂缺失突变体可以使病原菌的生物膜形成紊乱，从而提高芽孢杆菌抑制病原菌的能力。Leelasuphakul等(2006)鉴定了枯草芽孢杆菌B.subtilis NSRS89-24培养滤液对稻瘟病有非常好的防治效果，提纯出的抑菌活性物质葡聚糖酶和少量的几丁质酶，致使稻瘟病菌的菌丝细胞壁溶解，从而降低了稻瘟病菌的致病性。穆长青等(2006)研究枯草芽孢杆菌B.subtilis B-332的芽孢菌体悬浮液及发酵上清液对稻瘟病菌的抑制作用主要表现在使其芽管及成熟菌丝体的生长点膨大致畸，最后破裂、细胞质溢出、菌丝体崩溃。分析原因，主要由于枯草芽孢杆菌所分泌的某种物质而起作用的结果，通过该物质与稻瘟病菌中的酶或是代谢产物相互作用，从而影响了菌丝的正常生长，造成菌丝体发生畸变而受到抑制。张芬等(2011)报道枯草芽孢杆菌T429的发酵液温室盆栽条件下对叶瘟的防治效果达到69.40％。宋成艳等(2011)测定了1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对寒地水稻穗颈瘟的防效在77％以上。

利用酶工程和蛋白质工程技术，开展农作物近采收期以蛋白质为有效成分的新型枯草芽孢杆菌生防制剂的研究与应用，可以最大限度地挽回水稻产业在近采收期因为突发病害造成的产量损失。枯草芽孢杆菌防治稻瘟病的研究与应用是水稻生产可持续发展的需要，可以满足联合国世界粮食组织关于粮食安全发展的要求，但是本领域中还缺少对水稻稻瘟病具有广谱且高效防效、抗菌活性物质产量高的枯草芽孢杆菌菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对不同品种水稻的稻瘟病，尤其是叶瘟和穗瘟具有较好防治作用，并兼具促生、促产作用的枯草芽孢杆菌菌株。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

在第一方面，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌2012SYX04(Bacillussubtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2014年05月21日，保藏编号为CGMCC No.9189。

在第二方面，本发明提供了一种菌剂，其包含如第一方面所述的枯草芽孢杆菌2012SYX04。

在第三方面，本发明提供了一种防治稻瘟病的方法，其包括将如第一方面所述的枯草芽孢杆菌2012SYX04或如第二方面所述的菌剂施用于水稻作物。

在本发明的防治稻瘟病的方法中，所述菌剂为所述枯草芽孢杆菌2012SYX04的培养液。

在本发明的防治稻瘟病的方法中，所述稻瘟病为苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、穗瘟、枝梗瘟和/或谷粒瘟。其中，优选地，所述稻瘟病为叶瘟和/或穗瘟。

在第四方面，本发明提供了如第一方面所述的枯草芽孢杆菌2012SYX04或如第二方面所述的菌剂在防治稻瘟病中的用途。

在本发明的防治稻瘟病的用途中，所述稻瘟病为苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、穗瘟、枝梗瘟和/或谷粒瘟。其中，优选地，所述稻瘟病为叶瘟和/或穗瘟。

本发明的有益技术效果为：

1、与现有的防治稻瘟病的枯草芽孢杆菌相比，本发明的枯草芽孢杆菌防治效率更高，这体现在可用更少的芽孢量获得相似或更好的防效。

2、与现有的防治稻瘟病的枯草芽孢杆菌相比，本发明的枯草芽孢杆菌具有更广谱的防治效果，其对我国南方和北方不同品系的水稻均有很好的稻瘟病防治效果。

3、与现有的防治稻瘟病的枯草芽孢杆菌相比，本发明的枯草芽孢杆菌对水稻叶瘟和穗瘟的防治效果较好。

4、与现有的防治稻瘟病的枯草芽孢杆菌相比，本发明的枯草芽孢杆菌对水稻促生、促产效果较好。

附图说明

图1是枯草芽孢杆菌2012SYX04菌株在NA培养基平板上的培养形态。

图2是枯草芽孢杆菌2012SYX04菌株与稻瘟病菌P131的平板对峙图片。

图3是枯草芽孢杆菌2012SYX04菌株发酵培养液与稻瘟病菌P131的平板对峙图片。

图4是枯草芽孢杆菌2012SYX04对稻瘟病菌的离体叶片筛选图片。

图5是枯草芽孢杆菌2012SYX04菌株防治稻瘟病大田试验图片。

图6是枯草芽孢杆菌2012SYX04菌株生防活性物质检测图片。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

实施例1：枯草芽孢杆菌2012SYX04菌株的筛选及发酵培养

(1)样品采集：采集样品为水稻晚熟品种叶片，地点为重庆市江津区慈云镇。连同水稻的根系一起拔出，用聚乙烯塑料袋装好，带回实验室分离。

(2)枯草芽孢杆菌分离：剪水稻健康叶片放入75％酒精的三角瓶中震荡洗涤2次后倒掉酒精，加入无菌水浸泡，然后吸取稀释液涂布于NA培养基平板上，待吹干后，在30℃的恒温培养箱中倒置培养48h。挑取单菌落，采用梯度划线分离的方法对挑取的单菌落进行纯化，将已纯化的菌株保存于NA斜面培养基备用。

肉汤培养基(NA)：蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，琼脂15g，pH7.3±0.1，121℃灭菌20min。

(3)枯草芽孢杆菌的筛选：选取健康水稻叶片，剪取5cm长叶段，放入芽孢量是1×10⁸CFU/mL的待测菌发酵液中，振荡定殖1h，得到定殖后叶片；在培养皿底部铺设滤纸，再在湿润的滤纸上放置灭菌牙签，在牙签上放置定殖后叶片，定殖培养20h后，用新的灭菌牙签轻刺叶段表面，不伤及叶段角质层，每个叶段刺伤5个点，再用移液枪吸取稻瘟病菌孢子悬浮液分别接种在刺伤的5个点上，得到接种后叶片，在人工气候箱培养48h后调查接种点稻瘟病病斑数量和测量病斑面积，选取接种点无病斑或者病斑颜色浅且面积小的芽孢杆菌低温保存备用。

LB液体培养基：酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000mL，pH7.4～7.6，121℃灭菌30min。

番茄燕麦培养基：燕麦片30g，加水800mL，在沸水浴上加热1h，纱布过滤后加入番茄汁150mL加水补足1000mL，加琼胶17-20g，熔化后分装灭菌(121℃，20min)。

经鉴定，该枯草芽孢杆菌菌株特征如下：菌落粗糙，不规则圆形，菌落外缘呈现放射状波纹，白色，不透明，无润泽度。革兰氏阳性菌，菌体杆状，芽孢椭圆到柱状，0.7～0.8×2.0～3.0微米，单个或链状排列，着色均匀，无荚膜，运动。

发明人已将本菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2014年05月21日，保藏编号为CGMCC No.9189。实施例2：枯草芽孢杆菌2012SYX04菌株的生物活性测定：

(1)枯草芽孢杆菌2012SYX04菌株对稻瘟病菌P131的抑菌测定：在番茄燕麦平板培养基上中央放置稻瘟病菌菌饼，菌饼两侧相距2cm处采用牙签划线方式接种制备好的2012SYX04和稻瘟病菌饼作对峙培养，以无菌水划线为对照，置于培养箱28℃黑暗培养，每处理设3次重复。12d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表1。

(2)枯草芽孢杆菌2012SYX04发酵培养液对稻瘟病菌的抑菌测定：在番茄燕麦培养基平板中央放置稻瘟病菌菌饼，菌饼两侧相距2cm处采用打孔器打孔，孔中加入2012SYX04的发酵液和稻瘟病菌饼作对峙培养，分别以无菌水和无菌LB液体培养基为对照，置于培养箱28℃黑暗培养。每个处理设3次重复。12d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表1。

表1枯草芽孢杆菌2012SYX04菌株与稻瘟病菌的对峙培养(％)

注：表中的实验数据为三次重复的平均值。

(3)枯草芽孢杆菌2012SYX04离体叶片防效测定：选取健康水稻叶片，剪取5cm长叶段，放入芽孢量是1×10⁸CFU/mL的枯草芽孢杆菌2012SYX04发酵液中，200rpm/min，28℃振荡定殖1h，得到定殖后叶片；在培养皿底部铺设滤纸，再在湿润的滤纸上放置5根灭菌牙签，在牙签上放置定殖后叶片，定殖培养20h后，用新的灭菌牙签轻刺叶段表面，不伤及叶段角质层，每个叶段刺伤5个点，再用移液枪吸取稻瘟病菌孢子悬浮液分别接种在刺伤的5个点上，得到接种后叶片，在人工气候箱培养48h后调查接种点稻瘟病病斑数量和面积，计算防治效果。接种后的培养皿放在人工气候箱培养，参数设置是28℃，RH(湿度)70％，每天光照时间4h，光照强度为4400Lux，结果见表3。

稻瘟病叶瘟室内调查分级标准：按国际水稻所稻瘟病抗性评价分级标准(表2)(枯草芽孢杆菌等生物农药对寒地水稻稻瘟病的防治效果.农药,52(2):132-135，2013.)。

表2为稻瘟病叶瘟室内调查分级标准

生防效果计算公式：

表3枯草芽孢杆菌2012SYX04对稻瘟病菌离体叶片防效测定

处理	发病率/％	病情指数	防治效果/％
				2012SYX04	36.7	2.3	89.6
稻瘟病菌(P131)	100	22.2	/

注：数据为三次重复的平均值

(4)枯草芽孢杆菌2012SYX04菌株对水稻秧苗的促生能力：选取健康且长势一致的水稻种子放入枯草芽孢杆菌2012SYX04的发酵培养液中浸种1h后取出放在铺有滤纸的培养皿内，在28℃，RH为70％的人工气候箱培养，48h后调查种子露白数量，每个处理重复3皿。另外，选取健康且长势一致的水稻种子放入枯草芽孢杆菌2012SYX04的发酵培养液中浸种1h后播种于水稻育秧池中，生长1个月后调查水稻秧苗的根长和株高，结果见表4。

表4枯草芽孢杆菌2012SYX04对水稻秧苗的促生能力

处理

发芽率

P(％)

根长

P(％)

株高

P(％)

2012SYX04

45.3aA

15.6

4.8aA

6.7

24.8aA

7.4

CK

39.2bB

--

4.5bB

--

23.1bB

--

注：数据为三次重复的平均值

(5)枯草芽孢杆菌2012SYX04菌株对水稻的促产能力：取健康且长势一致的水稻种子放入枯草芽孢杆菌2012SYX04的发酵培养液中浸种1h后播种于水稻育秧池中，分别在插秧期、分蘖期、齐穗期、黄熟期喷雾枯草芽孢杆菌2012SYX04的发酵培养液，收割时将水稻植株连根系一起拔起，调查水稻植株的株高、穗长、分蘖数、平均每穗的重量和千粒重，计算枯草芽孢杆菌2012SYX04对水稻的促产效果，结果见表5。

表5枯草芽孢杆菌2012SYX04对水稻植株的促产能力

注：数据为三次重复的平均值

(6)枯草芽孢杆菌2012SYX04菌株的大田防治效果试验：分别在辽宁省东港市隆阳农业科技园、盘锦市大洼县平安镇小房村和福建省上杭县畲族乡中坊村进行枯草芽孢杆菌2012SYX04的田间药效试验，芽孢量是1×10⁸CFU/mL，对照药剂75％三环唑可湿性粉剂施用量是50～80g/亩兑水40～50kg；平均每个试验小区面积是45m²，4个重复小区，分别调查枯草芽孢杆菌2012SYX04对叶瘟和穗瘟的防治效果，结果见表7和表8。

表6为稻瘟病穗瘟调查分级标准

级数	调查标准
		0	无病
1	发病率低于1％
		3	发病率为1～5％
5	发病率为6～25％
		7	发病率为26～50％
9	发病率为51～100％

生防效果计算公式：

表7枯草芽孢杆菌2012SYX04菌株对叶瘟的大田防治效果测定

注：数据为三次重复的平均值

表8枯草芽孢杆菌2012SYX04菌株对穗瘟的大田防治效果测定

注：数据为三次重复的平均值

(7)枯草芽孢杆菌2012SYX04菌株生防活性物质检测

生物膜的检测：挑取单菌落接种到液体LB培养基上，30℃，180rpm过夜摇培，按1:1000比例加入到含有Msgg培养基的12孔组织培养板中，在23℃下培养，3天后观察生物膜形成情况，结果见表9。

淀粉酶的检测：取新活化的单菌落接种于含有0.2％可溶性淀粉培养基平板上，培养48h，形成明显菌落后，在平板上滴加卢哥式碘液染色10min，用70％乙醇洗板，能产生淀粉酶的菌株，在黑色的背景下，其菌落生长处周围可形成无色的透明圈，如果有透明圈表明菌株可以产生淀粉酶，每个处理3个重复，结果见表9。

蛋白酶的检测：将活化的待测菌株穿刺接种于1％脱脂牛奶胚琼脂培养基平板上，30℃培养24、48、72h后观察外围透明圈的产生，出现透明圈表明有蛋白酶的产生，每个处理3个重复，结果见表9。

几丁质酶的检测：将活化的待测菌接种于胶体几丁质酶检测培养基平板上，30℃培养24、48、72h后观察外围透明圈的产生，出现透明圈表明有几丁质酶的产生，每个处理3个重复，结果见表9。

葡聚糖酶检测：待测菌接种于含有ABP培养基的平板上，30℃培养48、72h后，观察平板中是否出现消解圈，若有消解圈产生则表明有葡聚糖酶的产生，每个处理3个重复，结果见表9。

嗜铁素检测：嗜铁素用CAS培养基检测，将活化的待测菌接种于CAS检测培养基平板上，30℃培养72h后，观察平板中是否产生橘黄色晕圈，若出现橘黄色则表明有嗜铁素的产生，每个处理重复3次，结果见表9。

纤维素酶的检测：将分离到的菌株活化后接种于纤维素筛选培养基平板上，28℃恒温倒置培养2d，用0.1％的刚果红染色液浸染10min，再用1mol/L的NaCl溶液脱色5min。若菌株产纤维素酶，则会在菌落周围出现清晰的透明圈，每个处理重复3次，结果见表9。

HCN的检测：在含有4.5g/L甘氨酸的KMB培养基上活化细菌，在培养皿的盖上面放一张灭菌的滤纸，将滤纸用1％的苦味酸和2％的碳酸钠混合液浸湿，密封培养皿，在30℃培养24、48h后，观察滤纸颜色变化，若滤纸由红色变成红褐色则表明有HCN的产生，每个处理3个重复，结果见表9。

ABP培养基的制作：用研钵将块状茯苓研碎成粉末，使其可通过120目的筛子，KH₂PO₄6.8g，K₂PHO₄·12H₂O17.9g，酵母提取物6.7g，茯苓粉(或β-1.3-葡聚糖)5.0g，苯胺蓝120mg，琼脂粉12g，H₂O1L，pH值为6.8，水1L。

CAS培养基的制备：Casitone酪胨9g，酵母浸膏5g，枸橼酸三钠10g，磷酸氢二钠1g，磷酸二氢钠1g，葡萄糖10g，琼脂20g，溶于1L水中。

纤维素富集培养基:NaCl6g,MgS0₄0.1g,KH₂P0₄0.5g,CaC1₂0.1g,(NH₄)S0₄2.0g,K₂HP0₄2.0g，琼脂1.5％,CMC-Na0.5％,(5g)，补足水至1L，pH调至7.0。纤维素筛选培养基(1L):在上述纤维素酶富集培养基中加入酵母粉1g。

刚果红染色液:用蒸馏水溶解刚果红，终浓度为0.1％(w/v)。

刚果红脱色液:终浓度为1mol/L的NaCl溶液。

KMB培养基的制备：Proteose Peptone No.3(Difco)蛋白胨20g，K₂HPO₄1.5g，MgSO₄0.738g或者MgSO₄·7H₂O1.5g，甘油10mL，ddH₂O990mL，琼脂粉15g，加水1L。

表9枯草芽孢杆菌2012SYX04菌株生防活性物质检测

注：数据为三次重复的检测结果；“+”是检测出结果，“-”是未检测出

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用条件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌2012SYX04(Bacillus subtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2014年05月21日，保藏编号为CGMCC No.9189。

2.一种菌剂，其包含如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌2012SYX04。

3.一种防治稻瘟病的方法，其包括将如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌2012SYX04或如权利要求2所述的菌剂施用于水稻作物。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述菌剂为所述枯草芽孢杆菌2012SYX04的培养液。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述稻瘟病为苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、穗瘟、枝梗瘟和/或谷粒瘟。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述稻瘟病为叶瘟和/或穗瘟。

7.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌2012SYX04或如权利要求2所述的菌剂在防治稻瘟病中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述稻瘟病为苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、穗瘟、枝梗瘟和/或谷粒瘟。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述稻瘟病为叶瘟和/或穗瘟。