CN104974965A - 枯草芽孢杆菌jn005及其在防治水稻稻瘟病中的应用 - Google Patents

枯草芽孢杆菌jn005及其在防治水稻稻瘟病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌JN005及其在防治水稻稻瘟病中的应用，菌株JN005的保藏编号为CCTCC No：M2015228。利用菌株JN005对水稻稻瘟病进行防治，避免了化学防治对环境和稻米安全的潜在不良影响及抗病品种利用的感病化风险。菌株JN005活体菌及其代谢产物对稻瘟病均有较好的防效，保护和治疗作用兼具，可将其作为活体菌剂和代谢产物的剂型加工开发。此外，菌株JN005对多种病原指示菌具有抑制效果。

Description

枯草芽孢杆菌JN005及其在防治水稻稻瘟病中的应用
技术领域
本发明涉及生物防治技术领域，具体地说，涉及一种枯草芽孢杆菌JN005及其在防治水稻稻瘟病中的应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa)是最重要的粮食作物之一，全球有半数以上人口以水稻为食。稻瘟病(病菌为Magnaporthe oryzae，其无性世代为Pyicularia oryzae)是水稻最严重要的真菌性病害之一。稻瘟病菌(M.oryzae)是一种半活体寄生，在感染最初阶段具有很明显的活体营养阶段。稻瘟病根据其发病部位和发病时期不同可以分为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗瘟、谷粒瘟、枝梗瘟等。目前生产上主要利用抗病品种和使用化学杀菌剂控制稻瘟病。主要使用的杀菌剂有三环唑、稻瘟灵、咪鲜胺、稻瘟酰胺、异稻瘟净、稻瘟净、敌瘟磷(克瘟散)、丙环唑、嘧菌酯、戊唑醇、烯丙苯噻唑、氯溴异氰尿酸、三氯异氰尿酸、四氯苯酞、肟菌·戊唑醇(拿敌稳)、硫磺·三环唑、甲硫·三环唑(稻津)、异稻·稻瘟灵、丙环唑·咪酰胺等；生物产品化学有效成分或活体微生物如春雷霉素、乙蒜素、氨基寡糖素、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等。由于稻瘟病菌的遗传背景复杂，易变异，加上抗瘟品种单一化，主栽品种的遗传同质性高，抗病品种难保持持久抗稻瘟病，常常导致一个新的抗瘟品种在大面积种植几年后丧失抗性，而感病化。在抗病品种不能满足生产需要的情况下，化学防治是防治稻瘟病的有效手段，但由于用药不合理，给生态安全带来潜在的不利影响，也值得人们关注。
生物防治即利用有益微生物活体或代谢产物杀灭或者降低病原微生物的数量以控制植物病害发生和危害。从植物病害的可持续控制来考虑，生物防治是一类绿色安全有效的防治措施。
然而，生物防治领域中常会遇到拮抗微生物在田间自然条件下定殖力差、对病害防治效果不稳定等问题。大量的研究也表明，室内筛选出的拮抗微生物在温室中对病原菌有较强的抑制作用，而在大田防治中效果不理想，这可能是由于一方面菌株不适应大田生态环境而不能很好的定殖到植物的根围，另一方面与大田土壤中复杂的微生物种类与拮抗菌株之间出现相互作用，导致拮抗微生物防效降低，因此，选择筛选生物菌株的田间适应能力强或高效代谢产物应用于大田病害防治是解决上述问题的重要途径。
发明内容
本发明的目的是提供一株新分离的生防菌-枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JN005。
本发明的另一目的是提供所述枯草芽孢杆菌JN005在防治水稻稻瘟病中的应用。
为了实现本发明目的，本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JN005是从湖南省桃江县大栗港镇牌形上村(N28°31′49.02″，E111°54′24.86″)感稻瘟病水稻品种湘早籼24号的病丛中选取健康稻株分离获得的，采用与稻瘟病菌平板对峙法筛选出的对稻瘟病菌菌丝抑制率达84％的拮抗菌株，现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO：M2015228，保藏日期2015年4月14日。
菌株JN005在NA培养基平板上培养，对其菌落形态进行观察及对其菌体的扫描电镜图观察，菌落形态不规则，边缘隆起，中间凹陷，粗糙不透明，表面干燥，污白色或微黄色。JN005菌体呈杆状，鞭毛周生，无荚膜，大小为(0.7～0.8)μm×(2～3)μm，芽孢椭圆倒柱状位于菌体中央或稍偏，长0.5～1.0μm，形态如图1所示。
菌株JN005能使淀粉水解、明胶液化，能利用D-果糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、D-甘露醇，但不能产生H2S，吲哚试验反应为阴性，不能分解酪蛋白(不产生酪蛋白酶)，不能利用D-阿拉伯糖。
菌株JN005的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供由所述枯草芽孢杆菌JN005制备的菌剂。
本发明还提供所述枯草芽孢杆菌JN005或由其制备的菌剂在防治水稻稻瘟病中的应用。
前述的应用包括将所述枯草芽孢杆菌JN005或由其制备的菌剂施用于水稻作物。其中，所述菌剂中枯草芽孢杆菌JN005的活菌浓度≥5.5×106cfu/mL。
本发明进一步提供一种防治水稻稻瘟病的方法，其包括将所述枯草芽孢杆菌JN005的培养液进行离心，所得上清液施用于水稻作物，或将枯草芽孢杆菌JN005的活体菌配制菌悬液施用于水稻作物。
例如，菌株JN005在NA固体培养基(蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂17g/L，pH 7.0，蒸馏水配制)平板上活化后，用打孔器打取直径5mm的2个菌饼接入装有150mL NB液体培养基(蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L，pH 7.0，蒸馏水配制)的250mL三角瓶中，28℃、180r/min条件下，摇床振荡培养6d，用细菌过滤器过滤，获得枯草芽孢杆菌JN005代谢产物。
菌株JN005代谢产物在稻瘟病菌感染前和感染后，以及活体菌(浓度≥5.5×106cfu/mL)在稻瘟病菌感染前3-5d，采用喷雾防治法均有较好的防效，表明该菌株具有良好的保护和治疗效果。
此外，采用平板对峙培养法发现菌株JN005对多种病原指示菌，例如禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、稻曲病菌(Ustiloginoideavirens)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)生长的抑菌率分别为70.1％、73.6％和62.5％。
利用本发明提供的枯草芽孢杆菌JN005对水稻稻瘟病进行防治，避免了化学防治对环境和稻米安全的潜在不良影响及抗病品种利用的感病化风险。菌株JN005活体菌及其代谢产物对稻瘟病均有较好的防效，保护和治疗作用兼具，可将其作为活体菌剂和代谢产物的剂型加工开发。
附图说明
图1为本发明枯草芽孢杆菌JN005的菌株扫描电镜下菌体形态。
图2为本发明实施例1中枯草芽孢杆菌JN005在NA平板上培养结果；其中，A为菌落形态，B为划线培养结果。
图3为本发明实施例1中枯草芽孢杆菌JN005对不同病原指示菌的生长抑制效果；其中，A1为稻曲病菌(Ustiloginoidea virens)；A2为JN005对稻曲病菌菌丝生长抑制效果；B1为禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)；B2为JN005对镰刀菌菌丝生长抑制效果。
图4为本发明实施例2中枯草芽孢杆菌JN005及其代谢产物对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的菌丝生长抑制效果；其中，A为菌株JN005对稻瘟病菌生长抑制效果，CK为稻瘟病菌；B为菌株JN005的代谢产物对稻瘟病菌菌丝生长抑制效果，CK为稻瘟病菌。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1枯草芽孢杆菌JN005的分离获得
从湖南省桃江县大栗港镇牌形上村(N28°31′49.02″，E111°54′24.86″)感稻瘟病水稻品种湘早籼24号的病丛中选取健康稻株，共分离出871株菌株，采用与稻瘟病菌平板对峙法筛选出1株对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)菌丝抑制率达84％的拮抗菌JN005。
通过在NA固体培养基(蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂17g/L，pH 7.0，蒸馏水配制)平板上培养菌株JN005(图2A和图2B)，对其菌落形态进行观察，对其菌体的扫描电镜图观察，并结合该菌的生理生化、微生物学检测结果，以及16S rDNA测序结果(见SEQ ID NO.1)，最终确定菌株JN005为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
此外，采用平板对峙培养法发现菌株JN005对多种病原指示菌具有抑制效果(图3)，例如禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、稻曲病菌(Ustiloginoidea virens)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)的抑菌率分别为70.1％、73.6％和62.5％。
实施例2枯草芽孢杆菌JN005在水稻稻瘟病防治中的应用
菌株JN005在NA固体培养基平板上活化后，用打孔器打取直径5mm的2个菌饼接入装有150mL NB液体培养基(蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L，pH 7.0，蒸馏水配制)的250mL三角瓶中，28℃、180r/min条件在摇床中振荡培养6d，用细菌过滤器过滤，获得枯草芽孢杆菌JN005代谢产物。
将菌株JN005代谢产物10mL和稻瘟病菌(81号菌株)分生孢子液0.1mL加入灭菌的三角瓶中，混匀，以无菌水代替拮抗菌培养液为对照，27℃黑暗培养，6h镜检孢子萌发情况，实验重复3次。结果表明JN005代谢产物对稻瘟病菌孢子萌发抑制率为62.15％。菌株JN005采用与稻瘟病菌平板对峙法培养，其对稻瘟病菌81号菌株菌丝抑制率达84％(图4)。
温室盆栽试验包括JN005菌株代谢产物和不同浓度活体菌对水稻高感稻瘟病品种湘晚籼12号的稻瘟病防治效果试验两部分，试验在组培控温光照培养室内进行。
JN005菌株代谢产物对水稻高感品种湘晚籼12号的稻瘟病防治效果评价：采用水稻活体接种法接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液(浓度为1×105个/mL)诱发稻瘟病。具体试验包括3种处理方式，分别为：A组先喷稻瘟病菌孢子液，第3d喷代谢产物；B组先喷代谢产物，1d后喷稻瘟病菌孢子液；C组将稻瘟病菌孢子液与代谢产物按1:1体积比混匀喷施。设置清水和杀菌剂40％稻瘟灵EC(×500倍液)为对照，每种处理方式3钵，每钵30株。接种后10d对稻瘟病抗性进行分级调查和防治效果评价。
JN005活体菌对水稻高感品种湘晚籼12号的稻瘟病防治效果：采用喷雾法接种稻瘟病菌(分生孢子浓度为1×105个/mL)诱发稻瘟病。将JN005活菌浓度梯度设计为：5.5×109cfu/mL、5.5×108cfu/mL、5.5×107cfu/mL、5.5×106cfu/mL共4个浓度梯度。试验包括3种处理方式，分别为：A组接种稻瘟病菌孢子悬浮液前1d分别喷4个浓度梯度的JN005菌株活菌液；B组接种稻瘟病菌孢子液前3d先分别喷4个浓度梯度的JN005菌株活菌液；C组接种稻瘟病菌孢子液前5d先分别喷4个浓度梯度的JN005菌株活菌液；设置清水和40％稻瘟灵EC(×500倍液)为对照，每种处理方式3钵，每钵30株。接种后10d对稻瘟病抗性进行分级调查和防治稻瘟病效果评价。
温室盆栽试验结果：JN005菌株代谢产物对水稻高感品种湘晚籼12号的稻瘟病防治效果见表1，JN005活体菌对水稻高感品种湘晚籼12号的稻瘟病防治效果见表2。
表1 JN005菌株代谢产物对湘晚籼12号的稻瘟病防治效果
处理 病株率(％) 病情指数 相对防效(％)
JN005  (A组) 11.11 9.33 87.98
40％稻瘟灵(A组) 16.67 14.29 81.59
清水(A组) 90.00 77.64 /
JN005  (B组) 10.00 6.19 92.82
40％稻瘟灵(B组) 10.00 5.71 93.38
清水(B组) 76.67 86.19 /
JN005  (C组) 13.33 7.62 89.94
40％稻瘟灵(C组) 16.67 9.05 88.05
清水(C组) 88.89 75.71 /
注：以上数据均为3次重复结果。
表2 JN005活体菌对湘晚籼12号的稻瘟病防治效果
注：以上数据均为3次重复结果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JN005，其保藏编号为CCTCCNo：M2015228。
2.由权利要求1所述枯草芽孢杆菌JN005制备的菌剂。
3.权利要求1所述枯草芽孢杆菌JN005或权利要求2所述菌剂在防治水稻稻瘟病中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，其包括将如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌JN005或如权利要求2所述的菌剂施用于水稻作物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述菌剂中枯草芽孢杆菌JN005的活菌浓度≥5.5×106cfu/mL。
6.一种防治水稻稻瘟病的方法，其特征在于，其包括将如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌JN005的培养液进行离心，所得上清液施用于水稻作物，或将枯草芽孢杆菌JN005的活体菌配制菌悬液施用于水稻作物。
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