CN102816725A - 一株枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)T-500，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC NO：6058。本发明枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)T-500可以作为生物农药防治植物多种病害，也可以作为生物肥料促进作物增产。枯草芽孢杆菌T-500对水稻稻瘟菌、水稻纹枯菌、水稻白叶枯病菌、水稻稻曲病菌、水稻细菌性条斑病菌、禾谷镰刀菌、黄曲霉及黑曲霉菌等病原菌，表现出较强的抑菌活性，并对其引起的病害有较好的防控作用。在水稻叶面稀释200-500倍防治水稻叶部病害、浸种后可防治水稻恶苗病；灌根可防治蔬菜等的土传病害。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其应用，属于微生物领域。 

背景技术

目前，植物病害防治主要依赖化学农药，化学农药在农产品的安全生产中做出了巨大贡献，但化学农药普遍使用和农药用量的增加产生了一系列问题，如病原菌产生抗药性、农产品农药残留超标，农田生态环境污染等问题。这些问题增加了农田生产成本，同时也使本身具有优良品质的农产品因农药的过度使用而受影响。新的防治技术和病害防治手段成为植保科技工作者探索的方向，其中利用枯草芽孢杆菌防治植物病害成为研究热点。枯草芽孢杆菌是一种有益的土壤细菌，具有发达的分泌系统和较强的环境适应性，在农业生产中广泛应用。枯草芽孢杆菌对多种病原菌具有拮抗性能，生产中用于防治多种植物病害。例如用来防治芒果软腐病、辣椒炭疽病、苹果轮纹病、水稻纹枯病、水稻白叶枯病和一些镰刀菌引起的病害，相关研究比较深入，取得了显著的研究进展。 

以水稻为例，受到多种病原菌的危害。植物病害水稻是我省主要的粮食作物，优质稻米在我省种植面积有扩大的趋势，其中以粳稻类品种所占面积甚大，这些密植、大穗型、优质和高产稻米为病虫害的发生提供了充裕的营养和繁殖条件。近年来我省水稻主要病害的发生呈现上升趋势。稻瘟病在全省范围内均有发生。生产上，水稻稻瘟病的防治主要以三环唑、多菌灵、还有一些以有机磷为主的化学农药为主，有机磷类的农药在高温时施药容易造成人畜中毒。江苏省水稻稻瘟病的防治采取的是预防为主的防治思路，分别在苗期和孕穗期进行防治，大量农药的投入，给农民造成了较大的经济负担，同时也对稻米的品质和稻田生态环境造成了不良影响。江苏省水稻稻瘟病的防治面积大约在7000万亩左右（次/年），仅每年在防治水稻稻瘟病上的开支在1.75亿元人民币，给农民造成了较大的经济负担，病害的发生和大量化学农药的使用严重的影响了稻米品质。 

江苏省抗白叶枯病育种已经缺乏有效的抗病基因，水稻白叶枯病在我省的淮安地区、宿迁地区和连云港均有发生。江苏省的气候特点适宜水稻白叶枯病菌的发生，前水稻白叶枯病防治相对较难，没有特效药剂，主要利用农用链霉素、叶菌灵、叶枯宁、消病灵、菌毒清和拌种灵等杀菌剂用来防治。农用抗菌素的使用目前也受到许多争议。 

保障无公害、优质农产品的供给和实现资源的可持续利用是本世纪我国农业生产面临的最大挑战。但是，化学农药的预防性过度使用，尤其在孕穗期使用，对稻米品质造成潜在的影响。利用生物防治技术防治水稻稻瘟病和白叶枯病，国内外均有相关研究，但未见开发出相对成熟的产品应用于生产。 

通过引进枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）控制植物病害的流行是目前植病生防研究中十分活跃的研究领域。美国已有四株枯草芽孢杆菌经环保局（EPA）批准进入商品化或有限商品化应用，如GBO3、MBI600、QST7。陈志谊，许志刚，刘永锋等开发了新型的微生物杀菌剂“纹曲宁”，说明利用枯草芽孢杆菌防治植物病害切实可行。 

发明内容

本发明的目的在于提供一株枯草芽孢杆菌，它可以作为生物农药防治植物多种病害，也可以作为生物肥料促进作物增产。 

本发明的目的是通过下列技术措施实现的：本发明枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) T-500是从南京50份水稻田土壤样品中分离获得，已于2012年5月2日被中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 CGMCC受理保藏，保藏编号为：CGMCC NO：6058 ，拉丁学名为Bacillus subtilis T-500。其生物学性状记载为：T-500在YPGA培养基平板上生长24h的菌落4-5mm，菌落圆形，四周光滑，米色，表面有皱褶。革兰氏反应阳性，细胞形状为杆状，细胞直径大于1μm，严格好气，L－阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、甘露醇、淀粉水解、明胶液化等利用反应均为阳性。 

本发明枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) T-500的培养方法，包括如下步骤： 

1)、菌株活化：将枯草芽孢杆菌T500移入YPGA斜面培养基上，在28-32℃下培养24~72h；

2)、种子培养：将步骤1)活化后的菌株，移入YPG培养液中， 120转/分，28-32℃下培养24~72h；

3)、发酵培养：将步骤2)中种子罐中的发酵液压入发酵罐发酵，发酵温度为28-32℃；转速：适当；酸碱度7.0-7.4，待到菌体有90%变为芽孢后，检测菌含量达到2×10¹⁰cfu/ml时出罐。

步骤1)中YPGA斜面培养基组分为：胰蛋白胨3-10g、酵母膏1-10g、葡萄糖1-10g，琼脂5-15g，水1000ml； 

步骤2)中YPG培养液组分为：胰蛋白胨3-10g、酵母膏1-10g、葡萄糖1-10g，琼脂5-15g，水1000ml；

步骤3)中所用发酵培养基组分为：碳源5-10g·L^-1，氮源5-18 g·L^-1、微量元素1-4.5 g·L^-1，pH=7.0-7.4；所述碳源为蔗糖或者淀粉中的一种或两种混合，所述氮源为黄豆粉、豆饼粉、玉米桨中的一种或几种种混合，所述微量元素为牛肉浸出膏、酵母膏或者鱼粉中一种或两种混合，以碳酸钙调节pH。

枯草芽孢杆菌T-500在防治植物病害中的应用。 

所述植物病害包括水稻稻瘟、水稻纹枯、水稻白叶枯病、水稻稻曲病、水稻细菌性条斑病，辣椒疫病以及由禾谷镰刀菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌引起的储藏期病害。 

枯草芽孢杆菌T500发酵出罐后，将发酵液单独使用，也可以和三环唑、叶枯唑、链霉素、多菌灵、福美双、嘧霉胺、甲霜灵等化学药剂复配，菌剂质量比占20-80%，在水稻苗期或者成熟期喷施，用于防治水稻病害。也可在辣椒等蔬菜苗期灌根。 

枯草芽孢杆菌T-500也可在水稻促生增产方面进行应用。 

本发明有益效果：本发明枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) T-500可以作为生物农药防治植物多种病害，也可以作为生物肥料促进作物增产。尤其是对水稻病害有较好的防治效果，枯草芽孢杆菌T-500对水稻稻瘟菌、水稻纹枯菌、水稻白叶枯病菌、水稻稻曲病菌、水稻细菌性条斑病菌、禾谷镰刀菌、黄曲霉及黑曲霉菌等病原菌，表现出较强的抑菌活性，可以用于防治水稻稻瘟、水稻纹枯、水稻白叶枯病、水稻稻曲病、水稻细菌性条斑病，辣椒疫病以及由禾谷镰刀菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌引起的储藏期病害。在水稻叶面稀释200-500倍防治水稻叶部病害、浸种后可防治水稻恶苗病；灌根可防治蔬菜等的土传病害。 

附图说明

图1. T500和链霉素、叶枯唑复配防治水稻细菌性条斑病防治效果。 

具体实施方式

实施例1：枯草芽孢杆菌T500的发酵方法 

枯草芽孢杆菌T500的发酵包括如下步骤：

1)、菌株活化：将枯草芽孢杆菌T500移入YPGA斜面培养基上，在28℃下培养48h；

2)、种子培养：将步骤1)活化后的菌株，移入YPG培养液中，120rpm，28℃下培养48h。

3)、发酵培养：步骤2)中种子罐菌含量达到10¹⁰cfu/ml时，将种子罐中的发酵液压入发酵罐发酵，发酵温度为28-32℃；转速：80-150转/分；酸碱度7.0-7.4，泡沫较多时可适量加入消泡剂，每隔2小时进行检测，观察菌含量和测定发酵液的酸碱度。待到菌体有90%变为芽孢后，检测菌含量达到2×10¹⁰cfu/ml时出罐；出罐后将发酵液按照总量的2%加入苯甲酸防腐剂、搅拌均匀，进行分装即可应用。 

步骤1)中YPGA斜面培养基组分为：胰蛋白胨5g、酵母膏5g、葡萄糖5g，琼脂15g，水1000ml；步骤2)中YPG培养液组分为：胰蛋白胨5g、酵母膏5g、葡萄糖5g，水1000ml；步骤3)中所用发酵培养基组分为见表1。 

表1：5个产业化生产用培养基配方实例（单位：Kg/吨） 

实施例2：T500对植物病害的抑菌作用

对水稻纹枯病菌的抑菌活性测定：将9mm水稻纹枯病菌菌饼接于PDA培养基平板中央，对峙三点放置6 mm无菌滤纸片，吸取10 μL枯草芽孢杆菌发酵液于滤纸片上，置于28 ℃恒温箱内培养。设未接枯草芽孢杆菌处理为对照，每处理重复3次，待空白对照病原菌长满平板时，测量抑菌圈直径，计算抑制率。对禾谷镰刀菌、黄曲霉及黑曲霉的抑菌活性测定方法与水稻稻曲病菌的抑菌活性测定方法相同。水稻稻曲病菌的抑菌活性测定：将稻曲病菌接入PDA液体培养基中，置于140 r/min、28 ℃摇床培养5～7 d，待孢子量达到1×10⁶ cfu/mL，吸取330 μL于PDA平板上，使用无菌L棒涂布均匀，对峙三点放入6 mm无菌滤纸片，吸取10 μL枯草芽孢杆菌发酵液于滤纸片上，置于28 ℃恒温箱内培养。设无枯草芽孢杆菌处理为对照，每处理重复3次，待对照病原菌长满平板时，测量抑菌圈直径，计算抑制率。

对水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌的抑菌活性测定：将白叶枯病菌、细菌性条斑病菌接于NB培养液中，置于140r/min、28℃摇床培养36h、吸取330 μL病原菌菌液于NA培养基平板，使用无菌L棒将菌液涂布均匀，对峙三点放入6 mm无菌滤纸片，吸取10 ml枯草芽孢杆菌T-500发酵液于滤纸片上，置于28 ℃恒温箱内培养。设无枯草芽孢杆菌处理为对照，每处理重复3次，待对照病原菌长满平板时，测量抑菌圈直径，计算抑制率，结果见表2. 

表2、T-500对8中植物病原菌的抑菌活性

实施例3、枯草芽孢杆菌与三环唑的相容性

在无菌的条件下，将枯草芽孢杆菌T500接入NB培养液中置于28℃，140r/min摇床培养48 h。称取适量20%三环唑，配置成含有三环唑浓度分别为100 μg/mL、500 μg/mL、1000 μg/mL、2000 μg/mL、3000 μg/mL、4000 μg/mL、5000 μg/mL的马铃薯平板和不含三环唑的马铃薯平板，定点放入滤纸片，滤纸片上含有10 μL培养好的T500发酵液，以不含三环唑的马铃薯平板中放入的滤纸片为对照，28℃培养2天后观察并记录菌落生长情况。

结果见表3，表明枯草芽孢杆菌T500在三环唑浓度为4000 μg/mL的培养基上生长没有受到影响，在培养基含三环唑5000 μg/mL时菌落较小，生长受到一定的抑制。抗细菌与20%三环唑相容性测定结果表明，T500与三环唑的相容性较好，对三环唑的敏感程度较低，可以与三环唑复配使用。 

表3  枯草芽孢杆菌与三环唑的相容性测定结果 

注：+++：菌落生长很好；++：菌落生长较好；+：菌落略有生长；—：菌落不生长(生长情况与对照相比)

实施例4、枯草芽孢杆菌T-500对水稻白叶枯病的防治效果

将水稻白叶枯感病品种金刚30的水稻种子在无菌水中28℃下浸种48 h，除去无菌水进行保湿催芽48 h，将催芽后的水稻播种在塑料盆钵中，待水稻苗长到四叶一心时期，采用剪叶接种，枯草芽孢杆菌发酵液叶面喷雾处理。水稻白叶枯病菌浙173菌液培养：将白叶枯病菌接入NB液体培养基中，置于28℃，140 r/min摇床培养24 h，菌液浓度达1×10⁶ cfu/mL为接种体。采用剪刀沾取水稻白叶枯病菌菌液在第五叶片叶尖处剪口接种，随后使用浓度为1×10⁸cfu/ml的待测枯草芽孢杆菌发酵液进行叶面喷雾处理。每处理重复3次，采用空白培养液为对照处理。接种后3周调查，每处理调查30株水稻苗。白叶枯病情调查分级标准参照，记录数据并计算防治效果。

防治效果（％）

枯草芽孢杆菌T-500对苗期水稻白叶枯病具有较好的防治效果。结果见表4，T500对苗期水稻白叶枯病的防治效果达到57.14%；结果表明，T500对水稻白叶枯病苗期的防治效果相对较好，和对照相比差异显著，防效明显。 

表4. 枯草芽孢杆菌T-500对白叶枯病的防治效果 

               CK为对照组，下同。

实施例5、枯草芽孢杆菌T-500对水稻稻瘟病的防治效果 

本实验采用盆栽  进行。盆钵大小8×7cm将水稻播种在培养盘内，每处理3个重复，待水稻秧苗长到三叶期时，采用人工高压喷雾接菌，稻瘟病病原菌孢子悬浮液浓度为1×10⁴孢子／m1，孢子萌发率在95％以上，接菌后24h，用浓度为1×10^８ cfu／ml的待测细菌悬浮液进行叶面喷雾，连续保湿5～7d。空白对照采用清水处理。接种后7d调查，每处理调查30株水稻苗[3]。调查分级标准以株为单位(国家技术监督局 GB/T) 分级标准：0级，无病斑；       1级，病斑5个以下；2级，病斑5~ 10个；3级，全株发病或部分叶片枯死。记录数据及计算防效：计算防治效果：

病情指数

防治效果（％）

T500与三环唑以1:1、1:2和2:1比例复配分别稀释50倍、100倍，随着稀释倍数增加，其防治水稻苗瘟效果降低，结果见表5；稀释50倍和100倍时，T500与三环唑以2:1比例复配防治水稻苗瘟的效果较好; 1:1比例复配防治水稻苗瘟的效果高于1:2比例复配后防治水稻苗瘟的效果。

表5、T500与三环唑协同防治水稻苗瘟病效果 

注：同列中英文字母相同者表示在0.05水平无显著差异。

实施例6、T500分别与链霉素、叶枯唑复配防治细菌性条斑病 

将培育好的水稻秧苗（品种为金刚30）移栽到盆钵（25×30cm）中，每盆移栽3穴共15株苗，肥水按照常规管理，在水稻进入分蘖盛期后接种水稻细菌性条斑病菌。接种病原菌为细菌性条斑病菌B2-19，采用胁本氏培养基培养48小时后，用无菌水洗下，配置成3亿细胞/毫升的菌液，针刺法接种。将T500发酵液分别与40%链霉素可湿性粉剂、25%叶枯唑乳油（江苏省丰登农药厂）按照1：1的比例进行复配，得到T500+链霉素、T500+叶枯唑复配液。将上述两种复配液分别稀释200倍、500倍和1000倍，喷雾至接种的稻苗上。每盆钵细喷雾10ml药液，喷雾清水对照，每处理3个重复，施药后肥水照常管理。21天后调查实验结果，调查方法，用直尺测量病斑长度，每处理调查45张叶片，计算不同处理对细菌性条斑病菌的控制效果。

实验结果表明（图1），图1中纵坐标为防治效果(%)，T500可以和化学农药协同控制水稻细菌性条斑病。化学农药链霉素和叶枯唑对细菌性条斑病具有一定的防治效果；使用T500防治和对照药剂相比，其防治效果也比链霉素单剂相当，但是使用后，在相同的防治效果下，可以替代50%的叶枯唑，表明，枯草芽孢杆菌T500菌液可以部分替代化学农药，同时确保了对病害的防治效果。 

实施例7、T500和甲霜灵复配对辣椒疫病的防治效果 

常规营养钵育苗，待幼苗长至4～6叶期，选取健康，长势一致的辣椒移植于田间。小区面积16m²，试验采用随机区组设计，每处理50株，重复3次。在辣椒8～9叶期接种。拮抗菌选用温室盆栽试验有较好防效的bGV1-1和aNP6-7。

处理设：

清水和辣椒疫霉作对照；同时灌根接种T500和辣椒疫霉；

同时灌根接种T500+25%甲霜灵和辣椒疫霉；

同时灌根接种辣椒疫霉和25%甲霜灵WP20000倍。参考农药田间药效试验准则(一)中的杀菌剂防治辣椒疫病标准(GB/T 17980.32-2000)，调查试验结果，分析对辣椒疫病的防控效果。 

田间试验结果见表6，结果显示，单独使用T500对防治辣椒疫病具有良好的防治效果，处理后15d防效分别达71.99%，处理后30d防效略有下降，为67.89%。从两次的调查结果均可以看出，T500和化学农药复合使用时，防效于处理后15d时达到79.98%%，30d时达70.88%%，与单独使用农药以及单独使用拮抗菌的防效比较，明显增强防治效果。 

表6  T500和农药对辣椒疫病的防治效果 

CK为清水对照组。

实施例8、枯草芽孢杆菌T-5002对水稻的促生效果 

NB培养液配方：牛肉膏3g，酵母膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，水1000ml。

将培养好的枯草芽孢杆菌T500菌液接入50 mL NB培养液中培养浓度达到1×10¹⁰ cfu/mL的枯草芽孢杆菌发酵液，稀释100倍；将随机挑选水稻品种为金刚30的种子100粒浸入稀释菌液中，28℃浸种48 h，去除菌液进行保湿催芽，2 d后将催芽后的种子播种在经过高温处理后土壤的盆钵中；随后将枯草芽孢杆菌T500菌液与无菌水以1:5的比例稀释灌根，一周后再次进行稀释灌根处理，以NB培养液浸种、灌根处理作为对照，3周后测量水稻苗株高、根长及干重。测量各处理幼苗株高和根长，株高以最长的一片叶子为测量对象，根以最长的一根为测量对象；干重测量：将幼苗与根分开用吸水纸包好，105℃烘箱中杀青，80℃下24 h，冷却至室温后用0.001 g天平称重，结果见表7。 

表7、枯草芽孢杆菌T-500对水稻的促生活性 

CK为对照组。  

Claims (4)

1.一种枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) T-500，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC NO：6058。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌T-500在防治植物病害中的应用。

3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌T-500在防治植物病害中的应用，其特征在于：所述植物病害包括水稻稻瘟、水稻纹枯、水稻白叶枯病、水稻稻曲病、水稻细菌性条斑病，辣椒疫病以及由禾谷镰刀菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌引起的储藏期病害。

4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌T-500在水稻促生增产方面的应用。

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