CN103352020B

CN103352020B - 一种枯草芽孢杆菌的微生物制剂制备方法及其应用

Info

Publication number: CN103352020B
Application number: CN201310311377.4A
Authority: CN
Inventors: 韩青梅; 陈亚菲; 高小宁; 黄丽丽; 秦虎强
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2013-07-23
Filing date: 2013-07-23
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2033-07-23
Also published as: CN103352020A

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌（Bacillus sp.）EDR4的菌株，其保藏编号为CGMCC No.2133。本发明以保藏编号为CGMCC No.2133的菌株为活性成份制备了微生物制剂，所述微生物制剂制备工艺简单、操作方便、发酵周期短、原材料广泛易得、产品质量稳定、对农作物无药害，绿色环保，防治油菜菌核病的效果显著。因此，本发明所述保藏编号为CGMCC No.2133的枯草芽孢杆菌（Bacillus sp.）EDR4菌株能够应用在油菜菌核病的防治中。

Description

一种枯草芽孢杆菌的微生物制剂制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌、其微生物制剂的制备方法以及将其应用于防治油菜菌核病。

背景技术

油菜菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.)deBary）引起的一种真菌病害，在世界上各个油菜主产区均有发生。在我国主要油菜产区中，油菜菌核病作为一种常发性病害，居油菜三大病害（霜霉病、病毒病）之首，发病率一般为10～30%，严重年份可达80%以上，减产11%～73%，含油量降低1%～5%，致使油菜的品质和产量大大减小。由于菌核病菌喜欢潮湿温润的环境，因此在长江中、下游及东南沿海等主要的油菜产区，包括江苏、安徽、上海、浙江、湖南、湖北、江西等地发生尤为突出，严重影响了我国的油菜生产。

目前，对于油菜菌核病的防治主要采用选用抗病品种及药剂防治为主的综合防治措施。然而由于油菜对菌核病抗性遗传的复杂性，目前并没有获得对菌核病免疫的油菜品种。同时化学防治主要采取对地上部喷施化学药剂，由于花期油菜自身植株比较高大，花期时间较长等特性，化学防治的防治效果并不稳定，而且长期使用农药，不但会污染环境，危害人类健康，而且不断导致核盘菌群体中抗药性菌株的出现，因此利用有益微生物对菌核病的生物防治已经成为现在的研究热点。

目前国内外研究已发现多种真菌、细菌或其它微生物对核盘菌具有寄生或拮抗作用，而且已经有商品制剂应用于生产，但是至今仍存在一些亟待解决的问题。首先，目前开发的生防资源易受外界条件的影响，不容易在植物体内定殖，防治效果不稳定。其次，生防菌发酵液不易储存和运输，在使用过程中，制发酵液繁琐，不易操纵，不利于进一步推广应用。

植物内生菌是一种能在植物组织中定殖与运转，对植物无害甚至有益的微生物，由于它在植物体内有稳定的生存空间，且能产生与宿主植物代谢相同或相似的生理活性物质，因而能有效地抑制病原菌的侵染或提高宿主植物的抗病性。近几年，内生菌因其独特的优点成为生物防治的研究热点，为生物防治的应用开辟了新的天地。

发明内容

有鉴于此，本发明将提供一种微生物制剂，其主要成份为一株植物内生细菌—枯草芽孢杆菌（Bacillus sp.）EDR4，以及其制备方法与防治油菜菌核病的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明菌株分离自我国陕西省田间自然生长的小麦根部，经菌落和形态的显微观察、染色反应、常规生理生化特性实验以及16s rDNA序列分析，该菌株鉴定为芽孢杆菌的一个新菌株，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus sp.）EDR4。

本发明所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus sp.）EDR4已于2007年08月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.2133。保藏期限30年，30年内免费提供活菌。

本发明所制备的微生物制剂中的活性成份为保藏编号CGMCCNo.2133的枯草芽孢杆菌（Bacillus sp.）EDR4。

制备具有保藏编号CGMCC No.2133的枯草芽孢杆菌（Bacillussp.）EDR4活性成份的微生物制剂方法如下：

将-80℃下保存的保藏编号为CGMCC No.2133的枯草芽孢杆菌（Bacillus sp.）菌株在LB固体培养基上活化，挑取枯草芽孢杆菌（Bacillus sp.）EDR4单菌落，接种于100mL的LB培养液（250mL三角瓶），于28℃、150rpm振荡培养18～24h，然后按照1%的种子液接种到100mL的LB培养液中，于28℃、150rpm振荡培养48h，或者按照1%的种子液接种玉米粉固体培养基中，于28℃培养48h。将得到的发酵液与载体物质混合后获得微生物制剂。

需要说明的是，LB培养液由10g蛋白胨、10g酵母粉、5gNaCl、1000mL蒸馏水组成，其pH值为7.2。

需要说明的是，所述的玉米粉培养基含有玉米粉50g，黄豆粉35g，麸皮40g，蒸馏水1000mL。

需要说明的是，所述的载体物质主要为硅藻土。作为一种优选的方案，发酵后可以加入1%含量的羧甲基纤维素钠增加粘稠度。

需要进一步说明的是，所述本发明的微生物制剂为白色粉末状，无结块等现象，其中枯草芽孢杆菌（Bacillus sp.）EDR4的活菌数量可达1.0×10⁸CFU/g。

根据试验结果表明，以本发明保藏编号CGMCC No.2133的枯草芽孢杆菌（Bacillus sp.）EDR4为活性成份的微生物制剂制备简单，操作方便，易于储藏和运输，对农作物无药害，储藏期仍能保持一定的活菌量，显著抑制病菌菌丝的生长，并且在温室和田间条件下能够有效防治油菜菌核病的发生和危害。因此，利用本发明所制备的微生物制剂能够应用在防治油菜菌核病中。

生物保藏信息说明：

分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus sp.EDR4.于2007年08月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.2133。保藏期限30年，30年内免费提供活菌。

附图说明

图1为本发明制备的微生物菌剂在储藏期的活菌量变化；

图2为本发明制备的微生物制剂对油菜菌核病病菌生长的抑制作用；

图3为本发明制备的微生物制剂对油菜菌核病的盆栽防治作用。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面将结合具体实施例对发明进行详细的描述。

实施例1

枯草芽孢杆菌（Bacillus sp.）EDR4的发酵培养

将-80℃下保存的保藏编号为CGMCC No.2133的枯草芽孢杆菌（Bacillus sp.）菌株在LB固体培养基上活化，挑取枯草芽孢杆菌（Bacillus sp.）EDR4单菌落，接种于100mL的LB培养液（250mL三角瓶），28℃、150rpm振荡培养18～24h，然后按照1%的种子液接种到100mL的LB培养液中，于28℃、150rpm振荡培养48h，得到菌体的发酵产物一。其中，LB培养液由10g蛋白胨、10g酵母粉、5gNaCl、1000mL蒸馏水组成，pH值为7.2。

按照1%的种子液接种玉米粉固体培养基中，于28℃培养48h，得到菌体的发酵产物二。其中，玉米粉培养基含有玉米粉50g，黄豆粉35g，麸皮40g，蒸馏水1000mL，自然pH值。玉米粉培养基于121℃，灭菌30min，冷却后，灭菌3次。

实施例2

具有保藏编号CGMCC No.2133的枯草芽孢杆菌（Bacillus sp.）EDR4活性成份的微生物制剂的制备方法

向实施例1中的两种发酵产物（LB发酵液、黄豆粉培养基）中加入1%含量的羧甲基纤维素钠，然后和等重量的硅藻土混合均匀，分别制成两种粉末状菌剂A、B，无结块。于室温条件下密封保存。

试验例1

微生物制剂储藏期活菌量检测试验

称取实施例2中所述的两种微生物固体制剂A、B各1g，用无菌水逐级稀释至10^-6、10^-7，吸取100μL稀释液涂布于LB平板上，于28℃下培养1d，并设置3个重复，统计菌落数。每7d稀释、检测一次。

如图1所示，结果表明两种微生物制剂在室温条件下储存11周，活菌数量仍然可以达到10⁷CFU·g^-1以上，其中生防制剂B的活菌量可以达到10⁸CFU·g^-1，在储存后期，活菌量趋向稳定，没有大幅度的波动。

试验例2

微生物制剂储藏期抑菌活性检测试验

在储藏期，每周称取微生物制剂A、B各1g，分别稀释10倍、50倍和100倍，采用平板对峙法检测两种微生物制剂对油菜菌核病菌菌丝生长的影响。于PDA平板中央放置牛津杯，其中滴加微生物制剂稀释液各100μL，四周对称位置放置培养2d的油菜菌核病菌菌饼（直径为5mm）。以滴加清水的处理作为对照，每个处理设置三次重复。于25℃恒温培养3d后，观察微生物制剂对菌丝生长的抑制情况，测量抑菌圈直径。

如图2所示，通过皿内对峙发现，将生防制剂稀释100倍后，仍可以显著抑制油菜菌核病菌的生长，在储藏11周以后，抑菌圈直径可达15mm以上。

试验例3

微生物制剂防治油菜菌核病的盆栽实验

储藏4周以后，称取微生物制剂，用无菌水稀释50倍后备用。选取大小和生长状况一致的油菜幼苗，分别于接种前5d、接种前1d和接种同时三个不同的时期喷施油菜叶片，每株油菜幼苗喷施30mL。分别以喷施EDR4发酵液和无菌水作为对照。取于PDA培养基上培养2d的油菜菌核病菌菌落边缘，打直径5mm的菌饼，反置于油菜叶面上，每片叶子接种2个，共20个接种点，试验重复3次。20℃保湿培养3d后，调查发病情况并测量病斑大小，计算防效，并进行方差分析。

抑制率（%）=(对照病斑直径-处理病斑直径)/对照病斑直径×100

如图3所示，试验结果表明，将制剂稀释后喷施油菜叶片发现，储藏4周以后，生防制剂B的防治效果明显优于样品A，并且与生防菌EDR4发酵原液的防效之间不存在显著性差异。其中在接菌前1d喷施样品B的防治效果最好，防效可达60%以上，接菌的同时喷施的防治效果次之，接种的前5d喷施防效最差。样品A的防治效果较差，但在接菌的同时喷施能达到相对较好的防治效果。

试验例4

微生物制剂防治油菜菌核病的田间小区试验

试验设在陕西汉中市汉台区付家庙村，经调查该地块多年发生油菜菌核病，并且喷施之前调查已经在田埂上发现子囊盘。设置初花期喷施一次、盛花期喷施一次和初花期和盛花期各喷施一次3个不同的处理，于2013年3月中旬油菜的初花期将内生细菌EDR4生防制剂样品A稀释50倍和发酵原液均匀喷施于油菜花朵及叶片上，10d后盛花期喷施第二次，每个小区170株，喷施2.5L发酵液，每个处理3个重复，以喷清水作为对照。于收获初期调查植株发病情况，记录发病株数及病害严重度，计算防治效果。

病情指数=[Σ(各级病株数×代表数值)/(调查总株数×发病最重级的代表数值)]×100

防治效果（%）=[(对照组病情指数－处理组病情指数)/对照组病情指数]×100

试验结果显示，将微生物制剂样品A稀释50倍以后，在初花期和盛花期各喷施一次的防治效果最好，防治效果达到57.70%，于初花期喷施一次的防治效果和盛花期喷施一次的防治效果较差。结果如表1所示。

表1微生物制剂对油菜菌核病的田间防治效果

注：表中同列数据后不同字母表示0.05水平差异显著。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.一种制备枯草芽孢杆菌微生物菌剂的方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCC No.2133的枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.)在LB液体培养基或玉米粉固体培养基中发酵后，将获得的发酵液与载体物质混合后得到微生物菌剂。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的LB培养液由10g蛋白胨、10g酵母粉、5gNaCl、1000mL蒸馏水组成，且pH值为7.2。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述玉米粉固体培养基中含有玉米粉50g，黄豆粉35g，麸皮40g，加水1000mL制成。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体物质包括硅藻土和羧甲基纤维素钠，将发酵液与载体物质混合均匀至粉末状，密封，室温保存。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将-80℃下保存的保藏编号为CGMCC No.2133的枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株在LB固体培养基上活化，挑取单菌落，在250mL三角瓶中加入100mLLB培养液，接种后于28℃、150rpm振荡培养18～24h，然后按照1％的种子液接种到100mL的LB培养液中，于28℃、150rpm振荡培养48h后获得发酵液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，按照1％的种子液接种玉米粉固体培养基中，于28℃培养48h后获得发酵液。