CN103725630B - 一种拮抗马铃薯疮痂病的微生物菌剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种微生物菌剂，其采用枯草芽孢杆菌（Bacillus？subtilis）CGMCC1.3382、放线菌（Dactylosporangium？sp.）ACCC？No.40661、玫瑰黄链霉菌（Streptomyces？roseoflavus）ACCC？No.40400作为制备菌种，先将各菌种制备成发酵液，并将发酵液混合后再次深层发酵后制得；该系列菌种合理利用微生物间的相互作用，产品特点是适应性强，稳定性好，不易老化、对病原菌拮抗性强等，能够高效拮抗马铃薯疮痂病的病原菌，刺激植物生长、改善作物品质，从而达到增产、高产的目的。
Description
技术领域
本发明属于农业和生物技术领域，涉及一种拮抗马铃薯疮痂病的微生物菌剂，具体地说，涉及不同菌种之间通过协同作用进行有效复合所生产的一种能够有效治疗马铃薯疮痂病的一种微生物菌剂。
背景技术
马铃薯是我国重要的农作物之一，地位仅次于水稻、小麦和玉米，为我国第四大农作物。马铃薯的种植区域广泛，病害也较为复杂，其中由多种植物病原链霉菌引起的马铃薯疮痂病是当今影响马铃薯生产的重要病害之一。
马铃薯疮痂病主要是由链霉菌引起的，其菌丝细长，连续分割生成大量孢子。孢子圆筒形，致病菌一般经由土壤气孔从马铃薯表皮皮孔或伤口侵入，但在马铃薯块茎表皮木栓化后侵入较难。马铃薯疮痂病在土壤高温干燥情形下适宜发病，适宜发病温度为20-30℃，适宜酸碱度为pH5-8.6。马铃薯疮痂病影响马铃薯的外观和品质，使薯块的质量下降，降低了马铃薯的商品价值，使之市场竞争力降低，从而带来经济损失。
可以说研究出能够抑制马铃薯疮痂病的微生物群体是利国利民的一项重要课题。
发明内容
本发明所要解决的问题是研制出一种能够高效拮抗马铃薯疮痂病的微生物菌剂，该系列菌种特点主要是适应性强，稳定性好，不易老化、对病原菌拮抗性强等特点，并合理利用微生物间的相互作用，配备高技术的生产发酵技术生产出优质的产品。该微生物菌剂能高效拮抗马铃薯疮痂病的病原菌，刺激植物生长、改善作物品质等作用，从而达到增产、高产的目的。
本发明通过双层平板法测定菌种的抑菌能力，再用纸片法测定发酵液的抑菌能力，最后通过响应面法确定最终产品的组成。其技术方案如下：一种拮抗马铃薯疮痂病的微生物菌剂，其采用枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）CGMCC1.3382、放线菌（Dactylosporangiumsp.）ACCCNo.40661、玫瑰黄链霉菌（Streptomycesroseoflavus）ACCCNo.40400作为制备菌种；所述菌种的质量百分比如下：枯草芽孢杆菌30～35%、放线菌30～35%、玫瑰黄链霉菌33～38%。
本发明所述拮抗马铃薯疮痂病的微生物菌剂，其采用枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）CGMCC1.3382发酵液、放线菌（Dactylosporangiumsp.）ACCCNo.40661发酵液、玫瑰黄链霉菌（Streptomycesroseoflavus）ACCCNo.40400发酵液混合后作为混合菌剂，经再次发酵制得。
对于上文所述的技术方案，优选的情况下：所述的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）CGMCC1.3382发酵液、放线菌（Dactylosporangiumsp.）ACCCNo.40661发酵液、玫瑰黄链霉菌（Streptomycesroseoflavus）ACCCNo.40400发酵液混合的质量百分比分别为30～35%、30～35%、33～38%。
对于上文所述的技术方案，优选的情况下：所述的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）CGMCC1.3382发酵液、放线菌（Dactylosporangiumsp.）ACCCNo.40661发酵液、玫瑰黄链霉菌（Streptomycesroseoflavus）ACCCNo.40400发酵液，各自的菌种数量均不低于108个/mL。
对于上文所述的技术方案，优选的情况下：所述的混合菌剂经再次发酵的接种量为混合菌剂占总发酵培养基质量的1～5%。
对于上文所述的技术方案，优选的情况下：所述再次发酵的发酵培养基为：葡萄糖15～30g/L、淀粉10～15g/L、蛋白胨15～23g/L、NaCl5～10g/L、KH2PO40.1～0.5g/L，其余为蒸馏水；pH6.0～8.0。
对于上文所述的技术方案，优选的情况下：所述的再次发酵制得的终产物总菌数至少为10×108个/mL。
对于上文所述的技术方案，优选的情况下：所述再次发酵的条件为30℃下培养4～7天。
对于上文所述的技术方案，优选的情况下：所述的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）CGMCC1.3382发酵液采用营养肉汁培养基发酵制备；放线菌（Dactylosporangiumsp.）ACCCNo.40661发酵液采用酵母膏麦芽膏培养基发酵制备；玫瑰黄链霉菌（Streptomycesroseoflavus）ACCCNo.40400发酵液采用高氏合成一号培养基发酵制备；其中：
营养肉汁培养基为蛋白胨5g，NaCl5g，牛肉膏3g，蒸馏水定容至1.0L；
酵母膏麦芽膏培养基为为酵母膏10.0g，葡萄糖4g，麦芽膏10.0g，蒸馏水定容至1.0L；
高氏合成一号培养基为可溶性淀粉20.0g，KNO31.0g，FeSO40.01g,NaCl0.5g,MgSO40.5g，蒸馏水定容至1.0L。
本发明实施例中通过响应面法确定最终产品的组成，最后通过双层平板法测定发酵液的抑菌能力。经实地验证，其配方合理，功效稳定，能高效拮抗马铃薯疮痂病的病原菌、增加产量，提高肥料利用率，改良土壤生态环境。
具体实施方式
本发明所述的微生物菌剂采用枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）CGMCC1.3382、放线菌（Dactylosporangiumsp.）ACCCNo.40661、玫瑰黄链霉菌（Streptomycesroseoflavus）ACCCNo.40400均可由商业途径获得。为方便描述后文简述为枯草芽孢杆菌、放线菌、玫瑰黄链霉菌。
实施例1：发酵液的制备
1）接种：配制各菌种的固体培养基，灭菌后严格进行无菌操作，从斜面转接至平板，最适温度下培养2～3天；
2）一级培养：将长好的平板挑取单菌落转接至装有一级液体培养基的50mL锥形瓶中，无菌操作，30℃、130r/min培养24～48h；
3）二级发酵：将一级培养菌种接种于盛有二级液体培养基的500mL锥形瓶中，无菌操作，30℃、130r/min培养24～48h，分别制得枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）CGMCC1.3382发酵液、放线菌（Dactylosporangiumsp.）ACCCNo.40661发酵液、玫瑰黄链霉菌（Streptomycesroseoflavus）ACCCNo.40400发酵液。
上述方法中所用的培养基：
所述枯草芽孢杆菌采用的固体培养基为营养肉汁琼脂培养基：蛋白胨5g，NaCl5g，牛肉膏3g，琼脂15g，蒸馏水定容至1.0L；一级液体培养基和二级液体培养基均为营养肉汁培养基：蛋白胨5g，NaCl5g，牛肉膏3g，蒸馏水定容至1.0L。
所述的放线菌采用的固体培养基为酵母膏麦芽膏琼脂培养基：酵母膏10.0g，葡萄糖4g，麦芽膏10.0g，琼脂20.0g，蒸馏水定容至1.0L；一级液体培养基和二级液体培养基均为酵母膏麦芽膏培养基：酵母膏10.0g，葡萄糖4g，麦芽膏10.0g，蒸馏水定容至1.0L；
所述玫瑰黄链霉菌采用的固体培养基为高氏合成一号琼脂培养基：可溶性淀粉20.0g，KNO31.0g，FeSO40.01g,NaCl0.5g,MgSO40.5g,琼脂20g，蒸馏水定容至1.0L；一级液体培养基和二级液体培养基均为高氏合成一号培养基：可溶性淀粉20.0g，KNO31.0g，FeSO40.01g,NaCl0.5g,MgSO40.5g，蒸馏水定容至1.0L。
实施例2：发酵菌株培养条件的优化
对实施例1培养获得的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）CGMCC1.3382发酵液、放线菌（Dactylosporangiumsp.）ACCCNo.40661发酵液、玫瑰黄链霉菌（Streptomycesroseoflavus）ACCCNo.40400发酵液分别按30～35%、30～35%、33～38%的质量百分比混合，将混合后的菌液接种于盛有发酵培养基的发酵罐中，接种量为总发酵培养基质量的1～5%，30℃下培养4～7天，使发酵液中菌数达到10×108个/mL以上，即得到所述拮抗马铃薯疮痂病的微生物菌剂。其中，所述发酵培养基为：葡萄糖15～30g/L、淀粉10～15g/L、蛋白胨15～23g/L、NaCl5～10g/L、KH2PO40.1～0.5g/L，其余为蒸馏水；pH6.0～8.0。
针对实施例1中所用的发酵培养基的①最适碳源、②最适碳源浓度、③最适氮源、④最适氮源浓度进行如下的优选实验；同时对发酵培养条件的⑤最适温度、⑥最适pH、⑦最适接种量分别进行如下的优选实验；最终通过响应面分析法确定最佳发酵条件：
①最适碳源：分别用1%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖、木糖和可溶性淀粉代替培养基中的葡萄糖。培养一段时间，每24小时取一次培养液，用分光光度计测定生长量。作平行样。确定以葡萄糖和可溶性淀粉为最适碳源。
②最适碳源浓度：固定其他条件不变，研究不同浓度的最适碳源对菌株生长的影响。选择起始浓度分别为0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%、2%的碳源进行研究。培养一段时间，每24小时取一次培养液，用分光光度计测定生长量。作平行样。确定葡萄糖2%、可溶性淀粉1%。
③最适氮源：分别用1%的蛋白胨、酵母粉、胰蛋白胨、牛肉膏、磷酸铵、硝酸铵、尿素作为发酵培养基的氮源。培养一段时间，每24小时取一次培养液，用分光光度计测定生长量。作平行样。确定以蛋白胨为最适氮源。
④最适氮源浓度：固定其他条件不变，研究不同浓度的最适碳源对菌株生长的影响选择起始浓度分别为0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%、2.0%的氮源进行研究。培养一段时间，每24小时取一次培养液，用分光光度计测定生长量。作平行样。确定以蛋白胨1.5%。
⑤最适温度：在以上条件确定的基础上配制培养基，高压灭菌后按5%接种量接入种子液，分别放在20℃、25℃，30℃、35℃、的摇床中培养。每24小时取一次培养液，用分光光度计测定生长量。作平行样。确定最适培养温度为30℃。
⑥最适pH：在以上条件确定的基础上，配制pH6-11的一系列初始pH培养基，高压灭菌后按5%接种量接入种子液，最适温度培养。每24小时取一次培养液，用分光光度计测定生长量。作平行样。确定最适pH为7.0。
⑦最适接种量：在上述最佳培养条件下，向10ml液体培养基中分别以1%，3%，5%，7%，9%接种量接入种子培养液，摇床培养，每24小时取一次培养液，用分光光度计测定生长量。作平行样。确定最适接种量为3%。
⑧响应面分析法确定最佳发酵条件为葡萄糖15～30g/L、淀粉10～15g/L、蛋白胨15～23g/L、NaCl5～10g/L、KH2PO40.1～0.5g/L，其余为蒸馏水；pH6.0～8.0，接种量为1～5%，30℃下培养4～7天。
实施例3：菌种复合及液体深层发酵
将各菌种按下述质量百分比混合即：枯草芽孢杆菌发酵液30%、放线菌发酵液35%、玫瑰黄链霉菌发酵液35%。将混合后的菌液接种于盛有发酵培养基的发酵罐中，接种量为总发酵培养基质量的3%，30℃下培养5天，使发酵液中菌数达到10×108个/mL以上，即得到所述拮抗马铃薯疮痂病的微生物菌剂。其中，所述发酵培养基为：葡萄糖15～30g/L、淀粉10～15g/L、蛋白胨15～23g/L、NaCl5～10g/L、KH2PO40.1～0.5g/L，其余为蒸馏水；pH6.0～8.0。
实施例4：菌种抑菌能力的测定
采用双层平板法：①制备高氏合成一号琼脂培养基，凝固后在培养皿中加入2～3个直径为0.6cm的滤纸片，其上点滴10μL链霉菌孢子悬浮液（20%甘油，-20℃保存），孢子浓度为107～108cuf/mL，30℃培养。
②培养3d后，在培养皿中放入一玻璃镜片，其上加入3mL氯仿，加盖处理lh，杀死疮痂病链霉菌菌体；然后将镜片连同多余的氯仿一起移出，晾放30min。
③发酵液抑菌能力的测定：向培养皿中再加入15mL发酵琼脂培养基，凝固后加入150μL发酵液，用玻璃棒涂匀。至30℃培养3d后，抑菌圈直径达5cm，具有良好的抑菌效果。
实施例5：拮抗马铃薯疮痂病的微生物菌剂田间应用效果
拮抗马铃薯疮痂病的微生物菌剂田间应用试验如下：
①试验方案及设计：
在马铃薯疮痂病严重的试验田中施用本发明产品。
施用时间为马铃薯块茎形成期。
施用方法为土壤灌溉，以不施用本产品同一地域同样病情的同品种马铃薯为试验对照。
田间试验品种：鲁马铃薯1号生产种薯。
试验地点：山东，露地直播，覆盖地膜。
②马铃薯疮痂病分级标准：
戴线手套去土，不损坏薯块表皮。目测。0级：薯块无病斑；1级：有1-3个明显病斑，或有多个小病斑斑点，但总体危害很轻；2级：有4个以上明显病斑。
③检测结果与分析：
拮抗马铃薯疮痂病的微生物菌剂对病薯防效
| 组数 | 1组 | 2组 | 3组 | 平均值 |
| CK的病情指标（%） | 37 | 40 | 36 | 37.7 |
| 试验的病情指标（%） | 20 | 22 | 17 | 19.7 |
| 相对防效（%） | 46 | 45 | 52.7 | 47.9 |
注：病情指数=（0级×0级块数+1级×1级块数+2级×2级块数)/(2级×总级数）
防病效果=(CK的平均病情指数—处理的平均病情指数)/(CK平均病情指数)
另外，使用本发明产品生产的马铃薯薯块皮色光亮、光泽好；空白组生产的马铃薯薯块皮色暗。
④结论：
试验说明，本发明产品预防马铃薯疮痂的防病效果为47.9%。且使马铃薯薯块皮色光亮、光泽好、明显增长。
该试验土壤地块系春马铃薯连作4年，马铃薯疮痂病发病不是特别严重。在马铃薯疮痂病发病较重的土壤地块试验，本发明产品对马铃薯疮痂病的防病效果达到90%以上。
Claims (6)
1.一种拮抗马铃薯疮痂病的微生物菌剂，其特征在于：采用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCC1.3382发酵液、放线菌(Dactylosporangiumsp.)ACCCNo.40661发酵液、玫瑰黄链霉菌(Streptomycesroseoflavus)ACCCNo.40400发酵液混合后作为混合菌剂，经再次发酵制得；所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCC1.3382发酵液、放线菌(Dactylosporangiumsp.)ACCCNo.40661发酵液、玫瑰黄链霉菌(Streptomycesroseoflavus)ACCCNo.40400发酵液混合的质量百分比分别为30～35％、30～35％、33～38％；所述的混合菌剂经再次发酵的接种量为混合菌剂占总发酵培养基质量的1～5％；所述再次发酵的发酵培养基为：葡萄糖15～30g/L、淀粉10～15g/L、蛋白胨15～23g/L、NaCl5～10g/L、KH2PO40.1～0.5g/L，其余为蒸馏水；pH6.0～8.0。
2.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCC1.3382发酵液、放线菌(Dactylosporangiumsp.)ACCCNo.40661发酵液、玫瑰黄链霉菌(Streptomycesroseoflavus)ACCCNo.40400发酵液，各自的菌种数量均不低于108个/mL。
3.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于：所述的再次发酵制得的终产物总菌数至少为10×108个/mL。
4.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于：所述再次发酵的条件为30℃下培养4～7天。
5.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCC1.3382发酵液采用营养肉汁培养基发酵制备；放线菌(Dactylosporangiumsp.)ACCCNo.40661发酵液采用酵母膏麦芽膏培养基发酵制备；玫瑰黄链霉菌(Streptomycesroseoflavus)ACCCNo.40400发酵液采用高氏合成一号培养基发酵制备。
6.根据权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于：所述的营养肉汁培养基为蛋白胨5g，NaCl5g，牛肉膏3g，蒸馏水定容至1.0L；酵母膏麦芽膏培养基为酵母膏10.0g，葡萄糖4g，麦芽膏10.0g，蒸馏水定容至1.0L；高氏合成一号培养基为可溶性淀粉20.0g，KNO31.0g，FeSO40.01g,NaCl0.5g,MgSO40.5g，蒸馏水定容至1.0L。
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