CN104872194A - 一种白黄链霉菌在番茄灰霉病防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种白黄链霉菌在番茄灰霉病防治中的应用，所述白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)为白黄链霉菌TD-1，该白黄链霉菌TD-1保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4666，所述白黄链霉菌TD-1的活菌体、发酵液、麦麸培养物、麦麸培养物的固态菌剂或麦麸培养物产生的挥发性物质在番茄灰霉病防治中的应用。本发明将白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1应用在番茄灰霉病害防治中，该白黄链霉菌对番茄灰霉病具有较强的抑制效果，为生物防治灰霉病害提供了一种新的微生物菌株，将其应用在番茄灰霉病害防治中，长期使用不会造成环境污染、残毒积累，不会危及人畜健康。

Description

一种白黄链霉菌在番茄灰霉病防治中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其是一种白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)在番茄灰霉病害防治中的应用。

背景技术

灰霉病是一种世界性的真菌病害，灰霉病原菌寄主范围广、繁殖快、遗传变异大、容易产生抗药性，可侵染番茄、葡萄、黄瓜、草莓等多种作物的叶片、果实及果柄等部位。灰霉病的危害是欧洲、亚洲、美洲、地中海沿岸等国家面临的一个普遍性问题。番茄灰霉病是番茄生产中影响番茄产量和质量的主要病害之一。目前，主要利用多菌灵、嘧霉胺和腐霉利等化学农药防治番茄灰霉病。但化学药剂的长期使用容易造成环境污染、残毒积累，甚至危及人畜健康。生物防治由于具有高效、广谱、对人畜安全及与生态环境兼容等特点，越来越受到人们的关注和重视。

生物防治，即在各种条件下或者利用各种措施，通过其它生物的自然控制作用，降低植物病原物的生存和活动能力从而达到减轻病害发生和危害的目的的病害控制策略。微生物由于易于大量培养，产生的代谢产物丰富，抑菌作用强，在植物病害的生物防治方面具有很大的商业价值。目前，国内外已经报道了许多能控制番茄生长及采后灰霉病害的拮抗细菌、真菌、放线菌以及商品化的生防制剂。

链霉菌的分类地位为细菌域，放线杆菌纲，放线菌亚纲，放线菌目，链霉菌科，链霉菌属。链霉菌主要分布在土壤中，种类繁多，产生的次级代谢产物结构复杂，是一类具有较大开发潜力的微生物资源。链霉菌作为抗生素等一些价值较高的生理活性物质的产生菌，在医药、农业等多方面有着广泛应用，它所产生的抗生素不仅能有效地防治人类和牲畜的传染性疾病，在农业病害的生物防治方面也有重要应用。筛选拮抗链霉菌用以防治番茄灰霉病，是利用自然间天然存在的微生物之间的拮抗效应进行的生物防治措施，不易产生抗性，安全性高，符合我国农业和环境可持续发展的要求，是解决番茄灰霉病害发生和蔓延的重要途径之一。

通过检索，发现如下两篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

1.一株微白黄链霉菌及其在防治黄瓜霜霉病方面的应用(CN103468620A)，公开了一株微白黄链霉菌及其在防治黄瓜霜霉病方面的应用，属于生物防治植物病害领域。该菌株为微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)ACT033，保藏编号CGMCCNo.8125。本发明还公开了一种采用该新的微白黄链霉菌菌株ACT033制备的能够高效防治黄瓜霜霉病的生物防治制剂及其制备方法。实验表明，本发明的微白黄链霉菌菌株ACT033具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该微白黄链霉菌菌株ACT033制备的生物防治制剂，不仅能够防治黄瓜霜霉病，还能有效提高作物产量。

2.具有新代谢特性的微白黄链霉菌及其在生物降解中的应用(CN101250491)，本发明分离筛选出一株具有新代谢特性的微白黄链霉菌。本发明的优点是微白黄链霉菌通过部分还原途径降解硝基苯，并矿化降解过程中的副产物吡啶甲酸，从而实现硝基苯的彻底降解，解决了硝基苯部分还原降解中的瓶颈；微白黄链霉菌能够在高盐度以及多种有机物质共存的条件下有效降解硝基苯；微白黄链霉菌能够以吡啶甲酸为唯一碳、氮、能源进行生长，吡啶甲酸最终被矿化为无害的二氧化碳和水；微白黄链霉菌能够作为生物强化制剂应用于盐度高、成分复杂的硝基苯废水和吡啶甲酸废水的生物治理中。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种长期使用不会造成环境污染、残毒积累、不会危及人畜健康、具有较强的抑制效果的白黄链霉菌在番茄灰霉病害防治中的应用，提供了一种防治番茄灰霉病的新菌株和新方法。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一种白黄链霉菌在番茄灰霉病防治中的应用，所述白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)为白黄链霉菌TD-1，该白黄链霉菌TD-1保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4666，所述白黄链霉菌TD-1的活菌体、发酵液、麦麸培养物、麦麸培养物的固态菌剂或麦麸培养物产生的挥发性物质(VOCs)在番茄灰霉病防治中的应用。

而且，所述白黄链霉菌TD-1的发酵液的制备步骤如下：

⑴菌种的活化培养：

将分离保存的白黄链霉菌TD-1菌株转接到PDA固体培养基上，30℃条件下培养5-6d，保存备用；

⑵菌株TD-1孢子悬浮液的制备：

取PDA平板上活化的白黄链霉菌TD-1，用无菌水洗下平板表面的孢子，配成孢子悬浮液，并调整孢子浓度为1.0×10⁶个/mL；

⑶菌株TD-1种子培养液的制备：

种子液培养基为每1000mL水中含有可溶性淀粉，20.0g；黄豆粉，10.0g；KNO₃，1.0g；K₂HPO₄，0.5g；NaCl，0.5g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；FeSO₄·7H₂O，0.01g，每250mL三角瓶装培养基100mL；配制后121℃灭菌20min，待冷却后在无菌条件下按1％的接种量将TD-1孢子悬浮液接种于培养基内，30℃，180r/min摇床培养48h，得到菌株TD-1种子液；

⑷TD-1菌株发酵液的制备：

TD-1菌株发酵培养基的配制与⑶中种子液培养基配方一致，121℃灭菌20min，待冷却后在无菌条件下按10％的比例接种TD-1种子液，30℃、180r/min摇床培养6d，5000r/min离心15min，取上清液备用，即得可用于对灰霉菌抑菌的白黄链霉菌TD-1的发酵液。

而且，所述白黄链霉菌TD-1的麦麸培养物的制备步骤如下：

称取20-30g的干燥麦麸，按照料水比的质量比为1:1的比例添加蒸馏水，121℃灭菌20min，冷却后按20％的比例接种链霉菌TD-1的种子培养液，在30℃条件下培养8d，即得可用于对灰霉菌抑菌的白黄链霉菌TD-1的麦麸培养物。

而且，所述白黄链霉菌TD-1麦麸培养物的固态菌剂的制备步骤如下：

而且，称取20-30g的无菌麦麸，按20％的接种量，接种链霉菌TD-1种子液，30℃发酵2d，待菌种适应生长环境后，将发酵物置于30℃烘箱中干燥24h，再按2％(mL/g)的比例添加司盘60：吐温80(1:1)乳化剂到干燥后的固态发酵物中，分装于自封袋中，4℃条件下保存两个月后，即得白黄链霉菌TD-1麦麸培养物的固态菌剂。

而且，所述白黄链霉菌TD-1的麦麸培养物产生的挥发性物质在番茄灰霉病防治中的应用的检测方法的步骤如下：

⑴抑菌活性测定方法

采用双皿对扣法测定挥发性物质的抑菌活性，根据测量得到的菌落直径，用以下公式计算挥发性抑菌物质的抑菌率；

抑菌率＝[(空白组菌落直径－实验组菌落直径)/空白组菌落直径]×100％

⑵挥发性物质对菌丝生长和产孢能力的影响

取发酵8d的TD-1麦麸培养物，置于直径90mm的皿底，取活化好的灰霉孢菌菌饼，直径6mm，接种于另一PDA皿底中央，两皿对扣，封口膜密封，25℃培养，以加入相应质量的无菌麦麸作为空白对照，每个处理设3个平行，重复3次，5d后，采用十字交叉法测量菌落直径，按上述公式计算抑菌率，用血球计数板计数各组灰霉病菌的产孢量；

⑶挥发性物质对灰霉病菌细胞膜通透性的影响

双层平皿培养如步骤⑵所述，下层皿底为发酵8d的TD-1麦麸培养物，上层皿底倒入PDA培养基，冷却后平铺灭菌玻璃纸，1.5×1.5cm²，将灰霉病菌孢子悬浮液浓度调整至0.5–5×10⁶CFU/mL，取0.5mL均匀涂布于玻璃纸上，以加入相应质量的无菌麦麸作为空白对照，封口膜密封，25℃培养，分别于12h、24h、36h、48h和60h时取出，5mL无菌水洗下菌体，离心，取上清，分光光度计测定OD₂₆₀值；每个样品做3次平行，重复3次；

⑷挥发性物质对灰霉病菌细胞形态的影响

挑取培养5d的菌落边缘菌丝，在生物显微镜下观察菌丝形态及变化；从PDA培养基上取大小为3-5mm³灰霉病菌菌块，用扫描电子显微镜观察挥发性物质对菌丝微观形态的影响；

⑸挥发性物质的对番茄果实上灰霉病菌的防治

取大小一致的番茄果实，每个果实用打孔器打一直径6mm的伤口，接种浓度为0.5–5×10⁶CFU/mL的灰霉孢菌孢子悬浮液1μL，将果实放入带隔板保鲜盒，盒底部放入20g TD-1麦麸培养物，放少量无菌水保湿，保鲜膜封住保鲜盒口，以加入相应质量的无菌麦麸作为空白对照，30℃培养4d后观察灰霉病菌对番茄果实的侵染情况；

⑹挥发性物质的GC/MS分析鉴定

取样品于顶空瓶中，45℃水浴30min，用经老化处理的DVB/CAR/PDMS固相微萃取纤维头顶空吸附30min收集挥发性物质，GC/MS进样分析检测，以无菌麦麸作为空白对照；

气相色谱条件：色谱柱型号：VF-5MS 30m×0.25mm×0.25μm；进样口温度：250℃；载气：He，纯度99.999％；分流比：10:1；流速：1mL/min；程序升温：初始温度40℃，保持3min，以4℃/min升至150℃，保持1min，以8℃/min升至250℃，保持6min，根据气相色谱峰面积归一法确定各组分含量；

质谱条件：质量分离器：离子阱；离子源：EI；电离能量：70eV；离子阱温度：220℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟时间：1.5min；全扫描方式；扫描范围：43-500m/z；检索谱库：NIST05。

本发明取得的优点和积极效果是：

1.本发明将白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1应用在番茄灰霉病害防治中，该白黄链霉菌对番茄灰霉病具有较强的抑制效果，为生物防治灰霉病害提供了一种新的微生物菌株，将其应用在番茄灰霉病害防治中，长期使用不会造成环境污染、残毒积累，不会危及人畜健康。

2.本发明是利用白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1液体发酵培养后获得的发酵液防治灰霉病，该发酵液应用于植物真菌病害的生物防治，为微生物应用于生物防治的开发提供了新的途径。

3.本发明是利用白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1麦麸培养物产生的挥发性物质防治灰霉病，和直接接触防病相比，具有更加安全、方便的优势，有利于开发为微生物熏蒸剂。

4.本发明以灰霉病菌为指示菌，在离体条件下对S.alboflavus TD-1代谢产生的挥发性物质进行了抑菌活性实验，结果表明：VOCs能有效的抑制灰霉病菌菌丝生长和产孢量，并使细胞膜通透性增大、细胞形态异常、菌丝表面粗糙、分节增多。此现象可以为将该菌作为生物熏蒸剂的来源提供依据，有实际应用价值。

附图说明

图1为本发明白黄链霉菌TD-1在高氏1号培养基上划线培养的菌落形态图；

图2为本发明白黄链霉菌TD-1与灰霉病菌的对峙培养图，其中图2-1为对照组，图2-2为处理组；

图3为本发明白黄链霉菌TD-1发酵液对灰霉病菌丝生长的抑制图，其中A为对照组，B为发酵液稀释15倍组，C为稀释10倍组，D为稀释5倍组，E为发酵原液组；

图4为本发明白黄链霉菌TD-1对灰霉病菌孢子萌发抑制图；

图5为本发明白黄链霉菌TD-1麦麸培养物产生的挥发性物质对灰霉病菌的抑制效果图，其中5-1为对照组，5-2为处理组；

图6为本发明白黄链霉菌TD-1VOCs对灰霉病菌产孢能力的影响图；

图7为本发明白黄链霉菌TD-1VOCs对灰霉病菌细胞膜通透性的影响图；

图8为本发明白黄链霉菌生物显微镜观察TD-1VOCs对灰霉病菌孢子和菌丝影响图；其中，(A)正常菌丝及孢子；(B)受VOCs抑制的菌丝；(C)正常萌发的孢子；(D)受VOCs抑制的孢子；

图9为本发明白黄链霉菌扫描电子显微镜观察TD-1VOCs对灰霉病菌菌丝形态的影响图；其中，(A)正常菌丝及孢子；(B)受抑制菌丝及孢子；

图10为本发明白黄链霉菌TD-1挥发性物质对离体果实上灰霉病菌的防治效果图；其中，A为挥发物质作用组(观察4d)；B为空白对照组(观察4d)；C为挥发物质作用组(观察10d)；D为空白对照组(观察10d)；

图11为本发明发酵8d的白黄链霉菌TD-1麦麸培养物VOCs总离子流图；

图12为本发明白黄链霉菌TD-1抑制番茄灰霉病的离体叶片试验图，其中图12-1为对照组，图12-2为处理组；

图13为本发明白黄链霉菌TD-1抑制番茄灰霉病的盆栽试验图，其中图13-1为对照组，图13-2为处理组。

具体实施方式

为能进一步了解本发明的内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。需要说明的是，本实施例是描述性的，不是限定性的，不能由此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的试剂，如无特殊规定，均为本领域的常规试剂；本发明中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域的常规方法。

一种白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)在番茄灰霉病害防治中的应用，本发明所使用的白黄链霉菌TD-1，是从天津市宝坻区饲料厂储粮仓周围的土壤中分离得到的，属于放线菌目(Actinomycete)，链霉菌属(Streptomyces)，已于2011年3月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.4666，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，本发明白黄链霉菌TD-1在高氏1号培养基上划线培养的菌落形态图见图1，所述白黄链霉菌TD-1的活菌体、发酵液、麦麸培养物、麦麸培养物的固态菌剂或麦麸培养物产生的挥发性物质均可以应用在番茄灰霉病防治中。

在本发明中，所述白黄链霉菌TD-1的发酵液的制备步骤可以如下：

(1)菌种的活化培养：

将分离保存的白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1菌株转接到PDA固体培养基上，30℃条件下培养5-6d，保存备用。

(2)菌株TD-1孢子悬浮液的制备：

取PDA平板上活化的白黄链霉菌TD-1，用无菌水洗下平板表面的孢子，配成孢子悬浮液，并调整孢子浓度为1.0×10⁶个/mL。

(3)菌株TD-1种子培养液的制备：

种子液培养基为每1000mL水中含有可溶性淀粉，20.0g；黄豆粉，10.0g；KNO₃，1.0g；K₂HPO₄，0.5g；NaCl，0.5g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；FeSO₄·7H₂O，0.01g，每250mL三角瓶装培养基100mL；配制后121℃灭菌20min，待冷却后在无菌条件下按1％的接种量将TD-1孢子悬浮液接种于培养基内，30℃，180r/min摇床培养48h，得到菌株TD-1种子液。

(4)TD-1菌株发酵液的制备：

TD-1菌株发酵培养基的配制与(3)中种子液培养基配方一致，121℃灭菌20min，待冷却后在无菌条件下按10％的比例接种TD-1种子液，30℃，180r/min摇床培养6d，5000r/min离心15min，取上清液备用，用于对灰霉菌抑菌活性的检测。

在本发明中，所述白黄链霉菌TD-1的麦麸培养物的制备步骤可以如下：

称取20-30g的干燥麦麸，按照料水比1:1的比例添加蒸馏水，121℃灭菌20min，冷却后按20％的比例接种链霉菌TD-1的种子培养液，在30℃条件下培养8d，称取一定量的麦麸培养物用平皿对扣实验测定抑菌活性，结果表明，TD-1麦麸培养物的抑菌率为55.43％。

在本发明中，所述白黄链霉菌TD-1麦麸培养物的固态菌剂的制备步骤可以如下：

称取20-30g的无菌麦麸，按20％的接种量，接种链霉菌TD-1种子液，30℃发酵2d，待菌种适应生长环境后，将发酵物置于30℃烘箱中干燥24h，再按2％(mL/g)的比例添加司盘60：吐温80(1:1)乳化剂到干燥后的固态发酵物中，分装于自封袋中4℃条件下保存两个月后，复水活化，用平皿对扣实验测定抑菌活性，结果表明，抑菌率为40.85％。

本发明白黄链霉菌TD-1的相关应用的相关验证结果：

一、白黄链霉菌TD-1活菌体对灰霉病菌的拮抗效果

采用平板对峙法，测定链霉菌TD-1对灰霉病菌的拮抗效果。在无菌的PDA平板上以原点为中心划十字线，中心点接链霉菌TD-1菌饼(Φ＝6.0mm)，以中心点接无菌PDA菌饼为对照，于28℃培养3d后，在两条直线的两端距中心相同距离处接已培养好的灰霉菌菌饼(菌饼直径＝6.0mm)，但不能与TD-1相连，于28℃培养4-5d，测定抑菌带宽度，按以下公式计算抑菌率，做3次重复。

抑菌率＝(对照菌落抑菌带宽度－处理菌落抑菌带宽度)/对照菌落抑菌带宽度×100％。

实验结果见附图2，结果表明：链霉菌TD-1对灰霉病菌有抑制作用，能在平皿内产生明显的抑菌带，抑菌带平均宽度为11.69mm，抑菌率为87.17％。

二、白黄链霉菌TD-1发酵液对灰霉菌的抑制效果

(一)链霉菌TD-1发酵液对灰霉菌菌丝生长的抑制作用

TD-1发酵上清液加入到融化的PDA培养基中，制成不同浓度发酵液平板(稀释15倍、稀释10倍、稀释5倍、发酵原液)，以不加发酵液的PDA平板作为空白对照，再将制备好的灰霉病菌的菌饼(Φ＝6.0mm)置于平板中央，于25℃下培养5d。用十字交叉法测量供试真菌菌落生长直径，重复3次，计算菌丝生长抑制率。

菌丝生长抑制率＝(对照菌落生长直径－处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径×100％

试验结果见附图3，由图3可知，链霉菌TD-1发酵液对灰霉菌菌丝生长抑制作用明显。且发酵液浓度越高，抑制作用越强。可见，菌株TD-1能产生抑制灰霉病菌的活性代谢产物。

(二)链霉菌TD-1菌株发酵液对灰霉菌孢子萌发的抑制作用

参照方中达(方中达.植病研究方法[M].北京：中国农业出版社，1998.)的方法，采用水琼脂表面萌发法测定，每个处理重复3次，每次观察200个孢子，孢子的芽管超过孢子短直径一半时判为萌发孢子，当对照灰霉病菌分生孢子萌发率超过80％时，根据公式计算孢子萌发抑制率。

孢子萌发抑制率＝(对照孢子萌发率－处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率×100％

实验结果见附图4，从图4可以看出，链霉菌TD-1发酵液对灰霉菌孢子萌发抑制作用明显。且随着TD-1发酵液稀释倍数的增大，对孢子萌发的抑制率下降。

三、白黄链霉菌TD-1麦麸培养物产生的挥发性物质对灰霉菌的抑制效果检测

(一)材料与方法

1.供试菌株

拮抗菌：白黄链霉菌(S.alboflavus TD-1)，菌株编号CGMCC NO.4666。

指示菌：灰霉孢菌(Botrytis cinerea)由天津市畜牧兽医研究所提供。

2.培养基及培养条件

(1)链霉菌TD-1种子液

取保存菌株，于高氏1号培养基上进行活化，30℃培养6d，以1％体积比接种于链霉菌种子培养基中，30℃、180r/min摇床培养2d。

(2)链霉菌固体培养基

取20g麦麸置于250mL锥形瓶内，加质量比1:1自来水，121℃，20min灭菌。接种4mL链霉菌种子液于麦麸上，30℃恒温培养，每天摇瓶2次，培养8d。

(3)指示菌活化

取保存的灰霉病菌，于PDA培养基上，20-25℃下培养5d，活化菌株。

3.实验方法

3.1 抑菌活性测定方法

采用双皿对扣法测定挥发性物质的抑菌活性。根据测量得到的菌落直径，用以下公式计算挥发性抑菌物质的抑菌率。

抑菌率＝[(空白组菌落直径－实验组菌落直径)/空白组菌落直径]×100％

3.2 挥发性物质对菌丝生长和产孢能力的影响

取6g发酵8d的S.alboflavus TD-1麦麸培养物，置于直径90mm的皿底。取活化好的灰霉病菌菌饼(直径6mm)，接种于另一PDA皿底中央，两皿对扣，封口膜密封，25℃培养，以加入相应质量的无菌麦麸作为空白对照，每个处理设3个平行，重复3次，5d后，采用十字交叉法测量菌落直径，按上述公式计算抑菌率，用血球计数板计数各组灰霉病菌的产孢量。

3.3 挥发性物质对灰霉孢菌细胞膜通透性的影响

双层平皿培养如3.2所述，下层皿底为6g发酵8d的S.alboflavus TD-1麦麸培养物，上层皿底倒入PDA培养基，冷却后平铺灭菌玻璃纸(1.5×1.5cm²)，将灰霉病菌孢子悬浮液浓度调整至0.5–5×10⁶CFU/mL，取0.5mL均匀涂布于玻璃纸上，以加入相应质量的无菌麦麸作为空白对照，封口膜密封，25℃培养，分别于12h、24h、36h、48h和60h时取出，5mL无菌水洗下菌体，离心，取上清，分光光度计测定OD₂₆₀值。每个样品做3次平行，重复3次。

3.4 挥发性物质对灰霉孢菌细胞形态的影响

挑取培养5d的菌落边缘菌丝，在生物显微镜下观察菌丝形态及变化；从PDA培养基上取大小约为3-5mm³灰霉孢菌菌块，用扫描电子显微镜观察挥发性物质对菌丝微观形态的影响。

3.5 挥发性物质的对番茄果实上灰霉孢菌的防治

取大小一致的番茄果实，每个果实用打孔器打一直径6mm的伤口，接种浓度为0.5–5×10⁶CFU/mL的灰霉孢菌孢子悬浮液1μL，将果实放入带隔板保鲜盒，盒底部放入20g S.alboflavusTD-1麦麸培养物，放少量无菌水保湿，保鲜膜封住保鲜盒口，以加入相应质量的无菌麦麸作为空白对照，30℃培养4d后观察灰霉病菌对番茄果实的侵染情况。

3.6 挥发性物质的GC/MS分析鉴定

取6g样品于顶空瓶中，45℃水浴30min，用经老化处理的DVB/CAR/PDMS固相微萃取纤维头顶空吸附30min收集挥发性物质，GC/MS进样分析检测，以无菌麦麸作为空白对照。

气相色谱条件：色谱柱型号：VF-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度：250℃；载气：He，纯度99.999％；分流比：10:1；流速：1mL/min；程序升温：初始温度40℃，(保持3min)，以4℃/min升至150℃(保持1min)，以8℃/min升至250℃(保持6min)，根据气相色谱峰面积归一法确定各组分含量。

质谱条件：质量分离器：离子阱；离子源：EI；电离能量：70eV；离子阱温度：220℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟时间：1.5min；全扫描方式；扫描范围：43-500m/z；检索谱库：NIST05。

(二)结果

1.挥发性物质对灰霉病菌菌丝生长和产孢能力的影响

挥发性物质(VOCs)对菌丝生长的影响如图5所示。经VOCs作用5d后，空白对照组灰霉孢菌菌丝几乎长满平板，采用十字交叉法测定菌落直径为7.20cm；而受VOCs作用的灰霉孢菌菌落直径为2.40cm，抑菌率能达到66.67％。由此可见，链霉菌TD-1麦麸培养物产生的挥发性物质对灰霉病菌生长具有良好的抑制作用。

VOCs对孢子数量的影响图6所示。VOCs作用5d后，对照组孢子数量能达到5.90×10⁷个/cm²，而实验组能达到3.90×10⁶个/cm²，方差分析显示，两组之间的孢子产量达到显著水平(P<0.01)，说明S.alboflavus TD-1产生的VOCs在一定条件下能抑制灰霉孢菌产生孢子。

2.挥发性物质对灰霉病菌细胞膜通透性的影响

由图7可知，链霉菌TD-1产生的VOCs作用菌丝体离心后悬浮液的OD₂₆₀一直高于空白对照组，灰霉病菌经VOCs作用48h后，其菌丝体离心后悬浮液的OD₂₆₀值为0.82，而空白对照组的OD₂₆₀值为0.50，且有显著性差异(P<0.01)；链霉菌TD-1产生的VOCs对灰霉病菌的作用时间越长，其OD₂₆₀值越大，说明随着链霉菌TD-1产生的VOCs的作用，灰霉病菌的细胞膜受损失程度越大，即渗透到胞外的核酸类物质越多。因此，推测该VOCs对灰霉病菌的作用靶位点之一在细胞膜上，通过破坏细胞膜结构完整性来达到抑菌的作用。

3.挥发性物质对灰霉病菌细胞形态的影响

生物显微镜观察结果如图8所示，正常的灰霉病菌菌丝光滑、顺直、分节均匀，而经VOCs作用的灰霉病菌菌丝生长形态异常、表面粗糙、分节不明显；正常组灰霉病菌的孢子大多数萌发，能明显看到细长的新生菌芽和菌丝，而VOCs作用组，孢子萌发受到抑制，生长出的菌丝有肿胀现象。说明链霉菌S.alboflavus TD-1产生的VOCs对灰霉病菌的菌丝和孢子形态均有影响。

扫描电镜观察结果如图9所示。正常菌丝形态结构完整，表面光滑，菌丝体圆润饱满，表现出良好的生长状态，能够产生大量孢子。而受VOCs作用的菌丝生长畸形，表面凹凸不平，变得粗细不均，菌丝甚至会出现破损现象，只能产生很少量的孢子。VOCs会通过抑制孢子正常萌发、使菌丝末端生长畸形阻碍菌丝继续生长产生孢子、破坏菌体的完整性等发挥抑菌作用。

4.挥发性物质对番茄果实上灰霉病菌的防治

如图10所示，从侵染情况来看，空白对照组从第2d开始孔径周围就有长出灰霉病菌的少量白色菌丝，4d时菌丝生长旺盛，布满孔径，并向外蔓延，菌落直径达到1.3cm左右(图10-B)，10d时菌落直径继续蔓延，达到1.6cm左右，并且菌落周围番茄果皮表面开始腐烂(图10-D)；而试验组，2d时孔径周围几乎无白色菌丝生长，第4d时只是在孔径内部有菌丝生长，菌落直径0.9cm左右(图10-A)，10d时菌落直径几乎没变化，孔径周围番茄果皮出现皱缩现象(图10-C)。

5.挥发性物质的GC/MS分析鉴定

从S.alboflavus TD-1麦麸培养物分离并鉴定出63个组分，多数为醇类、酯类、酮类、醛类、烷烃类和烯烃类等。含量较高的组分为保留时间21.066min的二甲基异冰片(13.01％)和22.541min的1,4-二甲基金刚烷(14.37％)，如图11所示。

(三)讨论

以灰霉病菌为指示菌，在离体条件下对S.alboflavus TD-1代谢产生的挥发性物质进行抑菌活性实验，结果表明，VOCs能有效的抑制灰霉孢菌菌丝生长和产孢量，菌丝生长抑制率达66.67％，并使细胞膜通透性增大、细胞形态异常、菌丝表面粗糙、分节增多。也有研究表明，挥发性物质除了造成真菌形态的改变外，还能影响菌体细胞内相关酶的活性，可见，挥发性物质抑制微生物生长的作用方式是一个较为复杂的体系。

四、白黄链霉菌TD-1发酵液在番茄离体叶片上对灰霉病菌的防治效果

摘取叶龄、大小一致的番茄叶片，用无菌水洗净、晾干。将叶片浸于TD-1发酵液中1min，取出后在子叶叶柄部包裹醮水脱脂棉保持子叶活力。以无菌水浸叶为空白对照，每处理设3个重复，每重复处理6片叶。叶片浸药后，正面朝上摆放在含有0.5％琼脂的培养皿中。在每片叶中央接种一个直径为6mm的灰霉病菌菌饼，置于25℃恒温培养室中培养5-6d后，用十字交叉法测病斑直径。

病斑平均直径(mm)＝测量平均直径－6

防治效果(％)＝(对照病斑平均直径－处理病斑平均直径)/对照病斑平均直径×100

结果见图12，由图12可知，发酵液处理番茄叶片上灰霉病菌的病斑直径明显小于清水处理的病斑直径。对照处理的叶片上可见水渍状的灰褐色病斑，平均病斑直径约3.67cm，TD-1发酵液处理的叶片病斑直径为1.34cm，抑制率为63.49％。

五、白黄链霉菌TD-1发酵液在番茄植株上对灰霉病的防治效果

在番茄植株上喷洒链霉菌TD-1发酵液24h后喷灰霉病菌孢子悬浮液(孢子液浓度1.0-5.0×10⁶个/mL)，20-25℃培养，每个处理重复2次，每个重复10株，对照组用清水代替发酵液。参照方中达(方中达.植病研究方法[M].北京：中国农业出版社，1998.)的方法，在接菌后5-6d进行调查并计算病情指数和防效。结果见附图13，由图13可知，对照组番茄植株叶片大面积发黄枯萎，处理组叶片发病较轻，表面仅见轻微的灰色斑点。

实验结果：

表2 TD-1发酵液在番茄植株上对灰霉病的防效表

Claims (5)

1.一种白黄链霉菌在番茄灰霉病防治中的应用，所述白黄链霉菌(Streptomycesalboflavus)为白黄链霉菌TD-1，该白黄链霉菌TD-1保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4666，其特征在于：所述白黄链霉菌TD-1的活菌体、发酵液、麦麸培养物、麦麸培养物的固态菌剂或麦麸培养物产生的挥发性物质在番茄灰霉病防治中的应用。

2.根据权利要求1所述的白黄链霉菌在番茄灰霉病防治中的应用，其特征在于：所述白黄链霉菌TD-1的发酵液的制备步骤如下：

⑴菌种的活化培养：

将分离保存的白黄链霉菌TD-1菌株转接到PDA固体培养基上，30℃条件下培养5-6d，保存备用；

⑵菌株TD-1孢子悬浮液的制备：

取PDA平板上活化的白黄链霉菌TD-1，用无菌水洗下平板表面的孢子，配成孢子悬浮液，并调整孢子浓度为1.0×10⁶个/mL；

⑶菌株TD-1种子培养液的制备：

种子液培养基为每1000mL水中含有可溶性淀粉，20.0g；黄豆粉，10.0g；KNO₃，1.0g；K₂HPO₄，0.5g；NaCl，0.5g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；FeSO₄·7H₂O，0.01g，每250mL三角瓶装培养基100mL；配制后121℃灭菌20min，待冷却后在无菌条件下按1％的接种量将TD-1孢子悬浮液接种于培养基内，30℃，180r/min摇床培养48h，得到菌株TD-1种子液；

⑷TD-1菌株发酵液的制备：

TD-1菌株发酵培养基的配制与⑶中种子液培养基配方一致，121℃灭菌20min，待冷却后在无菌条件下按10％的比例接种TD-1种子液，30℃、180r/min摇床培养6d，5000r/min离心15min，取上清液备用，即得可用于对灰霉菌抑菌的白黄链霉菌TD-1的发酵液。

3.根据权利要求1所述的白黄链霉菌在番茄灰霉病防治中的应用，其特征在于：所述白黄链霉菌TD-1的麦麸培养物的制备步骤如下：

称取干燥麦麸，按照料水比的质量比为1:1的比例添加蒸馏水，121℃灭菌20min，冷却后按20％的比例接种链霉菌TD-1的种子培养液，在30℃条件下培养8d，即得可用于对灰霉菌抑菌的白黄链霉菌TD-1的麦麸培养物。

4.根据权利要求1所述的白黄链霉菌在番茄灰霉病防治中的应用，其特征在于：所述白黄链霉菌TD-1麦麸培养物的固态菌剂的制备步骤如下：

称取无菌麦麸，按20％的接种量，接种链霉菌TD-1种子液，30℃发酵2d，待菌种适应生长环境后，将发酵物置于30℃烘箱中干燥24h，再按2％(mL/g)的比例添加司盘60：吐温80(体积比1:1)乳化剂到干燥后的固态发酵物中，分装于自封袋中，4℃条件下保存两个月后，即得白黄链霉菌TD-1麦麸培养物的固态菌剂。

5.根据权利要求1所述的白黄链霉菌在番茄灰霉病防治中的应用，其特征在于：所述白黄链霉菌TD-1的麦麸培养物产生的挥发性物质在番茄灰霉病防治中的应用的检测方法的步骤如下：

⑴抑菌活性测定方法

采用双皿对扣法测定挥发性物质的抑菌活性，根据测量得到的菌落直径，用以下公式计算挥发性抑菌物质的抑菌率；

抑菌率＝[(空白组菌落直径－实验组菌落直径)/空白组菌落直径]×100％

⑵挥发性物质对菌丝生长和产孢能力的影响

取发酵8d的TD-1麦麸培养物，置于直径90mm的皿底，取活化好的灰霉病菌菌饼，直径6mm，接种于另一PDA皿底中央，两皿对扣，封口膜密封，25℃培养，以加入相应质量的无菌麦麸作为空白对照，每个处理设3个平行，重复3次，5d后，采用十字交叉法测量菌落直径，按上述公式计算抑菌率，用血球计数板计数各组灰霉病菌的产孢量；

⑶挥发性物质对灰霉病菌细胞膜通透性的影响

双层平皿培养如步骤⑵所述，下层皿底为发酵8d的TD-1麦麸培养物，上层皿底倒入PDA培养基，冷却后平铺灭菌玻璃纸，1.5×1.5cm²，将灰霉病菌孢子悬浮液浓度调整至0.5–5×10⁶CFU/mL，取0.5mL均匀涂布于玻璃纸上，以加入相应质量的无菌麦麸作为空白对照，封口膜密封，25℃培养，分别于12h、24h、36h、48h和60h时取出，5mL无菌水洗下菌体，离心，取上清，分光光度计测定OD₂₆₀值；每个样品做3次平行，重复3次；

⑷挥发性物质对灰霉病菌细胞形态的影响

挑取培养5d的菌落边缘菌丝，在生物显微镜下观察菌丝形态及变化；从PDA培养基上取大小为3-5mm³灰霉病菌菌块，用扫描电子显微镜观察挥发性物质对菌丝微观形态的影响；

⑸挥发性物质的对番茄果实上灰霉病菌的防治

取大小一致的番茄果实，每个果实用打孔器打一直径6mm的伤口，接种浓度为0.5–5×10⁶CFU/mL的灰霉病菌孢子悬浮液1μL，将果实放入带隔板保鲜盒，盒底部放入20g TD-1麦麸培养物，放少量无菌水保湿，保鲜膜封住保鲜盒口，以加入相应质量的无菌麦麸作为空白对照，30℃培养4d后观察灰霉病菌对番茄果实的侵染情况；

⑹挥发性物质的GC/MS分析鉴定

取样品于顶空瓶中，45℃水浴30min，用经老化处理的DVB/CAR/PDMS固相微萃取纤维头顶空吸附30min收集挥发性物质，GC/MS进样分析检测，以无菌麦麸作为空白对照；

气相色谱条件：色谱柱型号：VF-5MS 30m×0.25mm×0.25μm；进样口温度：250℃；载气：He，纯度99.999％；分流比：10:1；流速：1mL/min；程序升温：初始温度40℃，保持3min，以4℃/min升至150℃，保持1min，以8℃/min升至250℃，保持6min，根据气相色谱峰面积归一法确定各组分含量；

质谱条件：质量分离器：离子阱；离子源：EI；电离能量：70eV；离子阱温度：220℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟时间：1.5min；全扫描方式；扫描范围：43-500m/z；检索谱库：NIST05。