CN103087951B - 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。本发明的解淀粉芽孢杆菌的菌株号为MH71，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.6978。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71对果蔬作物上的灰霉病菌、镰刀病菌、褐腐、根腐及炭疽病菌等多种病原真菌和大白菜黑腐病、平菇褐斑病和黄瓜角斑病菌等病原细菌具有明显的抑制作用。解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）MH71繁殖速度快，能够人工培养，抗逆能力强，尤其是对真菌引起的甘蓝枯萎病等土传病害的防治具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于微生物领域。
背景技术
植物真菌病害给农业生产带来了巨大的损失，而植物土传真菌病害是一类重要的难防治病害，已给现代农业生产尤其是保护地蔬菜生产造成了严重影响。近年来，设施蔬菜迅速发展，设施栽培的特殊条件导致生产中各类作物的土传病害发生严重，对保护地蔬菜生产造成了严重威胁，其中由尖镰孢引起的枯萎病是一类重要的真菌病害，甘蓝枯萎病，国外报道甘蓝枯萎病由尖孢镰刀菌粘团专化型(Fusarium oxysporumf.sp.conglutinans）引起（Ramirez-Villupadua J，Endo R M，Bosland P，et al.．A new race ofFusarium oxysporumf.sp．conglutinans that attacks cabbage with type Aresistance[J]．Plant Disease,1985,69:612-613）；我国学者研究表明，北京延庆县发生的甘蓝枯萎病病原除尖孢镰刀菌粘团专化型外，尚有轮枝样镰刀菌(F. verticillioides)（耿丽华，迟胜起，焦晓辉，等.北京延庆县甘蓝枯萎病病原菌的分离及其生物学特性的研究[J].中国蔬菜，2009，（2）：34-37）。在美国、日本等国家发生较为普遍，我国2001年在北京延庆发现此病，此后迅速传播，危害严重；近年在山西寿阳、大同阳高、河北张家口等地也陆续发生。目前此病尚无理想的防控方法，化学防治亦无特效药剂，且其长期大量应用易加重土壤农药残留、诱导病菌抗药性。近些年已成为北京郊区乃至全国甘蓝蔬菜生产基地甘蓝出口贸易上的主要限制因素。因此，亟待开发新的、环境友好的高效防控产品和技术，以持续有效地控制其危害。
芽孢杆菌（Bacillus spp.）在土壤中普遍存在，是存在于土壤和植物微生态系统中的优势微生物种群之一，由于产生内生芽孢，具有较强的抵抗外界环境压力的能力，能够抵抗所生存的环境中由于干燥、热和紫外辐射所造成的伤害，维持自身生存能力不受影响，这个生物学特征使芽孢杆菌具有非常良好的应用前景，特别是在使用活菌制剂的生物制品中表现出强大的生命力。芽孢杆菌种类繁多，数量巨大，能够产生多种多样的生理活性物质和代谢产物，具有广泛的工业应用前景。解淀粉芽孢杆菌在自然界中分布十分广阔，而目前还未有防治甘蓝枯萎病的解淀粉芽孢杆菌的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供对甘蓝枯萎病菌具有抑制作用的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）及其用途。
本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的菌株号为MH71，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.6978。
所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71的16SrDNA序列、gyrA序列及ITS序列分别如SEQ ID No.1、2和3所示。所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens）MH71的形态学特征为菌体细胞呈短杆状，直或近直，芽孢中生，柱状或椭圆形，具有运动性；在LB培养基上不产色素，菌落为白色不透明，扁平或圆形，无光泽，随着培养时间增长，菌落变厚变干，边缘不整齐，菌落上有褶皱，变为乳脂色。所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71的生理生化特征为革兰氏染色阳性，形成菌膜，甲基红、乙酰甲基甲醇、硝酸盐还原、吲哚反应、接触酶阳性，可水解明胶、尿素、纤维素、淀粉和七叶苷，氧化酶反应、分解酪氨酸阴性，产生硫化氢，利用柠檬酸盐，不利用丙二酸盐，精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶反应阳性，苯丙氨酸脱氨酶反应阴性，葡萄糖、蔗糖产酸产气，可利用葡萄糖、麦芽糖、山梨醇、鼠李糖、菊糖、半乳糖、肌醇、木糖、甘露糖、甘露醇、核糖、蔗糖等，不利用阿拉伯糖和山梨糖。所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71于含有1%~7%（质量含量）氯化钠的培养基中均可正常生长，于含有10%（质量含量）氯化钠的培养基中不可生长，于pH4.5~9.0的培养基中均可正常生长，在pH4.0下生长势弱，pH9.5下不可生长，在环境温度为4℃下生长势弱，在55℃~80℃下处理15min，仍可正常生长。所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71产嗜铁素、纤维素酶和蛋白酶，不产几丁质酶和磷酸酯酶，尤其是具有强的产嗜铁素和蛋白酶的能力，这是生防菌的关键性生防指标。
本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌的用途为下述任一种：
1、病原菌抑制剂，它的活性成分是所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）MH71和/或其代谢物；
2、病害抑制剂，它的活性成分是所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71和/或其代谢物；
3、所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71和/或其代谢物在抑制病原菌中的应用；
4、所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71和/或其代谢物在制备病原菌抑制剂中的应用；
5、所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71和/或其代谢物在制备病害抑制剂中的应用；
6、所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71和/或其代谢物在抑制病害中的应用。
上述解淀粉芽孢杆菌的用途中，所述病原菌为下述至少一种：
A、植物枯萎病菌；
B、植物根腐病菌；
C、植物纹枯病菌；
D、植物全蚀病菌；
E、植物灰霉病菌；
F、植物褐腐病菌；
G、植物炭疽病菌；
H、植物或蘑菇细菌性病菌。
其中，所述植物枯萎病菌可为甘蓝枯萎病菌（如尖孢镰刀菌粘团专化型[Fusariumoxysporum Schl.f.sp.conglutinans(Wollenw.)Snyder&Hansen]）或西瓜枯萎病菌（如Fusarium oxysporumf.sp.niveum）；所述植物根腐病菌可为豌豆镰孢根腐病菌（如茄镰孢豌豆专化型（Fusarium solanif.sp.pisi））或百合根腐病菌（如尖孢镰孢病菌（Fusariumoxysporum Schlecht.）；所述植物纹枯病菌可为小麦纹枯病菌（如Rhizoctonia cereali）；所述植物全蚀病菌可为小麦全蚀病菌（如Gaeumannomyces graminis(Sacc.)Arx＆Olivier var.tritici J.Walker）；所述植物灰霉病菌可为番茄灰霉病菌（如灰葡萄孢(Bottytiscinerea Per．ex Fr．)）或草莓灰霉病菌（如Botrytis cinerea Persoon）或葡萄灰霉病菌（如灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea Pers.)）；所述植物褐腐病菌可为桃褐腐病菌（如链核盘菌（Monilinia fructicola(wint．)Rehm））；所述植物炭疽病菌可为辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）或葡萄炭疽病菌（如胶孢炭疽菌(Colletortrichumgloeosporioides Penz．e t Sacc．)）；所述植物细菌性病菌可为黄瓜角斑病菌（Pseudomonas syringae pv.lachrymans）或大白菜黑腐病菌（如Xanthomonas campestrispv.campsetris）；所述蘑菇细菌性病菌可为平菇褐斑病菌（如托拉斯假单胞杆菌（Pseudomonas tollasii Paine）。
所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71的代谢物可从所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71的发酵液中获得。所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71的代谢物具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71，除去液体培养物（发酵液）中的所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71即得到所述解淀粉芽孢杆菌的代谢物。
上述解淀粉芽孢杆菌的用途中，所述病害可为下述至少一种：
a、植物枯萎病；
b、植物根腐病；
c、植物纹枯病；
d、植物全蚀病；
e、植物灰霉病；
f、植物褐腐病；
g、植物炭疽病；
h、植物或蘑菇细菌性病害。
其中，所述植物枯萎病可为甘蓝枯萎病和/或西瓜枯萎病；所述植物根腐病可为豌豆根腐病和/或百合根腐病；所述植物纹枯病可为小麦纹枯病；所述植物全蚀病可为小麦全蚀病；所述植物灰霉病可为番茄灰霉病和/或草莓灰霉病和/或葡萄灰霉病；所述植物褐腐病可为桃褐腐病；所述植物炭疽病可为辣椒炭疽病和/或葡萄炭疽病；所述植物细菌性病害可为黄瓜角斑病和/或大白菜黑腐病；所述蘑菇细菌性病害可为平菇褐斑病。
其中，所述甘蓝枯萎病可由甘蓝枯萎病菌-尖孢镰刀菌粘团专化型[Fusariumoxysporum Schl.f.sp.conglutinans(Wollenw.)Snyder&Hansen]引起，所述西瓜枯萎病可由西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.niveum）引起，所述豌豆根腐病可由茄镰孢豌豆专化型（Fusarium solanif.sp.pisi）引起，所述百合根腐病可由尖孢镰孢病菌（Fusarium oxysporum Schlecht.）引起，所述小麦纹枯病可由小麦纹枯病菌（Rhizoctoniacereali）引起，所述小麦全蚀病可由小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis(Sacc.)Arx＆Olivier var.tritici J.Walker）引起，所述番茄灰霉病可由番茄灰霉病菌——灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per．ex Fr．)引起，所述草莓灰霉病可由草莓灰霉病菌（Botrytiscinerea Persoon）引起，所述葡萄灰霉病可由葡萄灰霉病菌——灰葡萄孢霉(Botrytiscinerea Pers.)引起，所述桃褐腐病可由桃褐腐病菌——链核盘菌（Monilinia fructicola(wint．)Rehm）引起，所述辣椒炭疽病可由辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）引起，所述葡萄炭疽病可由葡萄炭疽病菌——胶孢炭疽菌(Colletortrichumgloeosporioides Penz．e t Sacc．)引起，所述黄瓜角斑病可由黄瓜角斑病菌（Pseudomonassyringae pv.lachrymans）引起，所述大白菜黑腐病可由大白菜黑腐病菌（Xanthomonascampestris pv.campsetris）引起，所述平菇褐斑病可由平菇褐斑病菌——托拉斯假单胞杆菌（Pseudomonas tollasii Paine）引起。
解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71对果蔬作物上的灰霉病菌、镰刀病菌、全蚀病菌、褐腐及炭疽病菌等多种病原真菌和大白菜黑腐病、平菇褐斑病和黄瓜角斑病等病原细菌均具有抑制作用，其中，解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）MH71对供试的12种植物病原真菌的抑菌带宽均在1.3~2.3cm之间，尤其是几乎完全抑制了桃褐腐病菌的生长，对甘蓝枯萎病菌的抑制作用也是十分明显的；对大白菜黑腐病菌、平菇褐斑病菌和黄瓜角斑病菌的抑菌圈直径分别为6.5cm、5.0cm和6.0cm。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71的发酵液2倍稀释液和5倍稀释液对甘蓝枯萎病的防效分别为60.01%和47.14%，二者的防效均与多菌灵500倍稀释液（防效30.03%）对比，差异显著。解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliqufaciens）MH71繁殖速度快，能够人工培养，抗逆能力强，尤其是对真菌引起的甘蓝枯萎病等土传病害的防治具有重要意义。该菌种培养条件简单、容易保存，适于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
生物材料保藏说明
分类命名：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）
菌株编号：MH71
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2012年12月12日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.6978
下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
附图说明
图1a为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71显微放大400倍的菌体形态。
左侧图片为革兰氏染色照片。
图1b为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71在LB培养基上的菌落形态。
右侧图片为菌落放大形态照片。
图2为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71对常见植物病原真菌和细菌的抑制效果。
图中，A：尖孢镰刀菌粘团专化型[Fusarium oxysporum Schl.f.sp.conglutinans(Wollenw.)Snyder&Hansen]；B：西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.niveum）；C：茄镰孢豌豆专化型（Fusarium solanif.p.pisi）；D：尖孢镰孢病菌（Fusariumoxysporum Schlecht.）；E：小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cereali）；F：小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis(Sacc.)Arx＆Olivier var.tritici J.Walker）；G：番茄灰霉病菌-灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per．ex Fr．)；H：草莓灰霉病菌（Botrytis cinereaPersoon）；I：葡萄灰霉病菌——灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea Pers.)；J：桃褐腐病菌——链核盘菌（Moniliniafructicola(wint．)Rehm）；K：辣椒炭疽病菌（Colletotrichumcapsici）；L：葡萄炭疽病菌——胶孢炭疽菌(Colletortrichum gloeosporioides Penz．et Sacc．)；M：大白菜黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campsetris）；N：平菇褐斑病菌——托拉斯假单胞杆菌（Pseudomonas tollasii Paine）；O：黄瓜角斑病菌（Pseudomonas syringae pv.lachrymans）。
图3为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71培养48h时产嗜铁素、纤维素酶和淀粉酶的检测图片。
图中，A：产嗜铁素检测；B：产蛋白酶检测；C：产纤维素酶检测。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用到的病原菌公众可从野外采集，也可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验：
甘蓝枯萎病菌——尖孢镰刀菌粘团专化型[Fusarium oxysporum Schl.f.sp.conglutinans(Wollenw.)Snyder&Hansen]（李明远等.十字花科蔬菜枯萎病及其病原鉴定.植物保护.2003年6第29卷第3期）；
西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.niveum）（耿丽华等.西瓜枯萎病菌生理小种鉴定技术体系的建立和验证.中国蔬菜.2010（20）：52-56）
豌豆镰孢根腐病菌——茄镰孢豌豆专化型（Fusarium solanif.sp.pisi）（向妮等.豌豆镰孢根腐病菌的鉴定及其致病基因多样性.中国农业科学2012，45(14)：2838-2847）；
尖孢镰孢病菌（Fusarium oxysporum Schlecht.）（安智慧等.百合根腐病病原鉴定及防治方法.中国蔬菜.2010（3）：23-24）；
小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cereali）（纪兆林等.小麦纹枯病菌毒素对小麦植株的作用.扬州大学学报(农业与生命科学版)第32卷第3期2011年9月p55-59）；
小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis(Sacc.)Arx＆Olivier var.triticiJ.Walker）（刘卫国.药剂处理对小麦全蚀病防效及其产量因素的影响.湖北农业科学.第51卷第16期2012年8月.p3483-3487）；
番茄灰霉病菌——灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per.ex Fr)（李兴红等.北京地区番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性检测.植物保护.2012.38(4)：141-143）；
草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea Persoon）（朱宝成等.草莓灰霉病菌的培养、毒素提取及生物测定.植物病理学报.24（3）：239～243）；
葡萄灰霉病菌——灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea Pers.)（陈宇飞等.葡萄灰霉病研究进展.东北农业大学学报.37(5)：693-699）；
桃褐腐病菌——链核盘菌（Monilinia fructicola(wint.)Rehm）（王菲等.桃褐腐病的发生与防治.果树花卉.2012年第5期p58）；
辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）（宋根苗等.噻霉酮和苯醚甲环唑混配对4种不同病原菌的增效作用.植物保护.2012，38(4)：171-174）；
葡萄炭疽病菌——胶孢炭疽菌(Colletortrichum gloeosporioides Penz．etSacc．)（李利霞等.葡萄炭疽病菌SRAP遗传多样性分析.中国农学通报.2012，28(12)：230-235）；
平菇褐斑病菌——托拉斯假单胞杆菌（Pseudomonas tollasii Paine）（金丹等.一种平菇褐斑病病原菌的鉴定.食用菌学报.200916(1)：89～91）；
黄瓜角斑病菌（Pseudomonas syringae pv.lachrymans）（A.T.Alleyne.et.al.Identification ofPseudomonas syringae pv.lachrymans in Barbados by rep-PCR.Journal ofAgricultural Science and Technology B1（2001）593-597）；
茄子青枯病菌（Ralstonia solanacearum）（封林林等.茄子青枯病抗性材料的鉴定及性状观察．长江蔬菜.2000年第10期P35）；
大白菜黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campsetris）（翟文慧等.大白菜黑腐病鉴定的湿度试验及其苗期与成株期抗病性的相关分析.中国蔬菜.2010（10）：59-63）。
实施例1、本发明解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71的分离与菌株鉴定
1、样品采集
从中国最北端气温最低的地方——黑龙江漠河北极村采集的的永冻土层样品。
2、菌株的分离筛选及拮抗筛选
采用常规土样梯度稀释涂布分离，用LB，NA，KB，PYG和CM0002共5种培养基分别在28℃条件下培养，挑取菌落形态差异较大并可纯培养的细菌，在LB培养基上纯化保存，并以甘蓝枯萎病菌为靶标病原菌进行拮抗菌的初筛和多次复筛，最终得到一株抑菌活性强的细菌菌株，命名其为MH71。
3、菌株的鉴定
对菌株MH71进行形态学、生理生化特性和部分保守序列的分析。参考《土壤微生物研究原理与方法》（林先贵.土壤微生物研究原理与方法[M]，高等教育出版社，2010）中描述方法进行生理生化和环境耐受性特性的测定。
结果表明，菌株MH71的菌体细胞在400倍光学显微镜下菌体细胞呈短杆状，直或近直，芽孢中生，柱状或椭圆形，具有运动性；在LB培养基上不产色素，菌落为白色不透明，扁平或圆形，无光泽，随着培养时间增长，菌落变厚变干，边缘不整齐，菌落上有褶皱，变为乳脂色(图1a和图1b)。菌株MH71的生理生化特征为革兰氏染色阳性，形成菌膜，甲基红、乙酰甲基甲醇、硝酸盐还原、吲哚反应、接触酶、尿酶阳性，可水解明胶、纤维素、淀粉和七叶苷，氧化酶反应、分解酪氨酸阴性，产生硫化氢，利用柠檬酸盐，不利用丙二酸盐，精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶反应阳性，苯丙氨酸脱氨酶反应阴性，葡萄糖、蔗糖产酸产气，可利用葡萄糖、麦芽糖、山梨醇、鼠李糖、菊糖、半乳糖、肌醇、木糖、甘露糖、甘露醇、核糖、蔗糖等，不利用阿拉伯糖和山梨糖。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71的环境耐受性表现为于含有1%~7%（质量含量）氯化钠的培养基中均可正常生长，于含有10%（质量含量）氯化钠的培养基中不可生长，于pH4.5~9.0的培养基中均可正常生长，在pH4.0下生长势弱，pH9.5下不可生长，在环境温度为4℃下生长势弱，在55℃~80℃下处理15min，仍可正常生长（表1）。菌株MH71的16S rDNA序列、gyrA序列及ITS序列分别如SEQ ID No.1、2和3所示。
表1解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71的生理生化特性和环境耐受性测定结果
| 试验项目 | 结果 | 试验项目 | 结果 |
| 好氧性 | + | 氢离子浓度试验 | |
| 运动性 | + | pH4.0 | +W |
| 菌膜形成 | + | pH4.5~pH9.0 | + |
| 甲基红反应 | + | pH9.5 | - |
| 乙酰甲基甲醇反应(Voges-Proskauer) | + | 温度耐受性试验(15分钟) | |
| 硝酸盐还原 | + | 4℃ | W |
| 明胶液化 | + | 55℃ | + |
| 吲哚试验 | + | 65℃ | + |
| 接触酶 | + | 75℃ | + |
| 氧化酶 | - | 80℃ | + |
| 尿酶 | + | 121℃ | - |
| 纤维素水解 | + | 碳源利用实验 | |
| 淀粉水解 | + | 葡萄糖 | + |
| 丙二酸盐利用 | - | 麦芽糖 | + |
| 柠檬酸盐利用 | + | 山梨醇 | + |
| H2S产生 | + | 鼠李糖 | + |
| 氨基酸脱羧酶反应 | 菊糖 | + | |
| 精氨酸 | + | 半乳糖 | + |
| 赖氨酸 | + | 肌醇 | + |
| 鸟氨酸 | + | 木糖 | + |
| 在NaCl生长 | 甘露糖 | + | |
| 1% | + | 蔗糖 | + |
| 2% | + | 甘露醇 | + |
| 5% | + | 核糖 | + |
| 7% | + | 山梨糖 | - |
| 10% | - | 阿拉伯糖 | - |
| 苯丙氨酸脱氨酶反应 | - | ||
| 蔗糖发酵产酸产气 | + | ||
| 葡萄糖发酵产酸产气 | + | ||
| 酪氨酸分解 | - | ||
| 七叶苷水解 | + |
注：“+”表示阳性反应；“–”表示阴性反应；“w”表示反应弱。
根据对菌株MH71的形态学、生理生化特性和部分特异性保守序列测定分析的结果，将该菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）已于2012年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.6978。
实施例2、本发明解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71抑菌谱的测定
供试病原菌：
甘蓝枯萎病菌——尖孢镰刀菌粘团专化型[Fusarium oxysporum Schl.f.sp.conglutinans(Wollenw.)Snyder&Hansen]；
西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.niveum）；
豌豆镰孢根腐病菌——茄镰孢豌豆专化型（Fusarium solanif.sp.pisi）；
尖孢镰孢病菌（Fusarium oxysporum Schlecht.）；
小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cereali）；
小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis(Sacc.)Arx＆Olivier var.triticiJ.Walker）；
番茄灰霉病菌——灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per．ex Fr．)；
草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea Persoon）；
葡萄灰霉病菌——灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea Pers.)；
桃褐腐病菌——链核盘菌（Moniliniafructicola(wint．)Rehm）；
辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）；
葡萄炭疽病菌——胶孢炭疽菌(Colletortrichum gloeosporioides Penz．e t Sacc．)；
平菇褐斑病菌——托拉斯假单胞杆菌（Pseudomonas tollasii Paine）；
黄瓜角斑病菌（Pseudomonas syringae pv.lachrymans）；
茄子青枯病菌（Ralstonia solanacearum）；
大白菜黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campsetris）。
以上植物病原真菌和细菌是由中国农业大学植物病理学系和北京市农林科学院植物保护环境保护研究所提供。
选择农业生产上常见的植物病原真菌甘蓝/枯萎病菌、豌豆镰孢根腐病菌、尖孢镰孢病菌、小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、番茄/草莓/葡萄灰霉病菌、桃褐腐病菌、辣椒/葡萄炭疽病菌等为指示真菌，采用平板对峙培养法。具体操作如下：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71菌株在LB培养基上28℃恒温培养48h。植物病原真菌在PDA平板上25℃~28℃恒温培养3~4天，自菌落边缘用直径0.7cm无菌不锈钢打孔器打制带菌琼脂片；用无菌接种针挑取病原菌菌片，菌丝面朝下接种于PDA平板中心处，同时在距病原真菌菌片两侧均约3.00cm处用无菌接种环划线解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71，以仅接病原菌的平板为对照，每个处理三次重复，25℃~28℃恒温培养5~7天，测量病原真菌边缘与解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens)MH71的菌落带宽中心之间的抑菌带宽度。选择黄瓜角斑病菌、茄子青枯病菌、大白菜黑腐病菌和平菇褐斑病菌等植物病原细菌为指示细菌，采用双层培养法。将活化的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71点种在KB培养基平板的中心处，28℃培养40h，用3ml氯仿以其蒸汽杀死解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens）MH71，静置10～12h，以便氯仿蒸气挥发完全。将活化好的靶标病原细菌制备成108CFU/ml菌悬液。吸取100μl菌悬液加入3ml融化后冷却至50℃的1%水琼脂中，迅速混匀，立即倒入三氯甲烷已杀死解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）MH71的平板上，铺成均匀的薄层，28℃培养36h，观察抑菌效果并十字交叉法测量抑菌圈直径。
结果表明当仅接各种病原菌的平板上菌丝近乎长满整个平板时，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71对所选择的植物病原真菌的抑菌带宽均在1.3~2.3cm之间，尤其是几乎完全抑制了桃褐腐病菌的生长，对甘蓝枯萎病菌的抑制作用也是十分明显的。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71对所选择的植物病原细菌中，对大白菜黑腐病菌、平菇褐斑病菌和黄瓜角斑病菌的抑制作用最明显，抑菌圈直径分别为6.5cm、6.0cm和5.0cm，对其他几种病原细菌无明显抑菌活性。说明解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71不仅对甘蓝枯萎病菌有强的抑制作用，而且还对其他植物病原真菌有较强的抑制作用。多次重复该试验均得到同样的稳定抑菌效果，因此表明解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71具有稳定、高效、广谱的抗菌性能。
表2解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71抑菌测定结果
注：“/”表示未测该项内容；“-”表示未有明显抑菌效果；表中数据为3次重复数值的平均值。
实施例3、本发明解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71与生防相关功能检测
嗜铁素的检测嗜铁素检测用培养基（CAS培养基）（Schwyn B.and Neilands J.B.Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores[J].AnalyticalBiochemistry,1987,160:47-56）：由4种溶液组成（溶液1-3及casamimo acid），4种溶液混合前单独灭菌。溶液1CAS/HDTMA：①CAS溶液：60.5mg CAS(铬天青)溶解在50ml水中；②铁溶液：1Mm FeCl3·6H2O溶解于10mM HCl中,pH为2.0；③HDTMA溶液：72.9mg溴化十六碳烷基三甲氨溶解于40ml水中。把溶液①与10ml溶液②混合后加入溶液中③并搅拌均匀，把得到的蓝黑色液体灭菌，该液体即CAS/HDTMA溶液。溶液2.Salts/Buffer溶液：①Salts(750ml)：K H2PO40.3g，NaCl0.5g，NH4Cl1.0g；②Pipes：30.24g，溶解于Salts①中，以50%(W/V)KOH调节pH至6.8，加入15.0g琼脂定容至800ml，高压灭菌冷却至50℃。溶液3(750ml)：葡萄糖2g，甘露醇2g，MgSO4·7H2O493mg，CaCl211mg，H3BO31.4mg，ZnSO4·7H2O1.2mg，MnSO4·2H2O1.17mg，Na2MoO4·2H2O1mg，CuSO440μg；高压灭菌。溶液3冷却至50℃后加入溶液2与30ml过滤除菌的10%(W/V)casamimo acid混合，再加入溶液1，缓慢搅拌（避免产生泡沫），铺平板。将活化好的MH71菌株接种于嗜铁素检测平板上。28℃培养24、48、60、72h观察菌落外围是否产生黄色晕圈。由于嗜铁素竞争培养基中EDTA螯合的铁离子，使培养基由蓝色变成黄色，因此菌落周围黄色晕圈出现表明嗜铁素的产生。
几丁质酶的检测检测用胶态几丁质培养基（陈天寿.微生物培养基的制造与应用[M].1995,北京：中国农业出版社，494）：胶体几丁质2.5g，K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml，pH7.0。
将活化好的MH71菌株接种于几丁质酶检测培养基平板上，28℃培养24、48、60、72h后观察菌落外围透明圈的产生，出现透明圈表明几丁质酶的产生。
蛋白酶的检测检测用用脱脂牛奶琼脂培养基：脱脂奶粉10g，琼脂粉10g，蒸馏水1000ml。将活化好的MH71菌株接种于脱脂牛奶平板上，28℃培养24、48、60、72h后观察菌落外围透明圈的产生，出现透明圈表明蛋白酶的产生。
纤维素酶的检测检测用纤维素刚果红培养基（Teather R.M.and Wood P.J.Use ofCongo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolyticbacteria from the bovine rumen[J].Applied and Environment Microbiology,1982,43:777-780）：MgSO4·7H2O0.25g，K2HPO40.5g，纤维素1.88g，刚果红0.2g，琼脂14.0g，明胶2.0g，蒸馏水1000ml，pH7.0。将活化好的MH71菌株接种到纤维素刚果红培养基平板上，于28℃培养，48、60、72h观察菌落周围红色水解圈的产生，出现红色水解圈表明纤维素酶的产生。
磷酸酯酶的检测检测用Pikovskaya’s琼脂培养基（Pikovskaya R.I.Mobilization ofphosphorus in soil in connection with vital activity of some microbial species[J].Microbiology,1948,17:362-370）：酵母提取物0.5g，葡萄糖10.0g，Ca3(PO4)25.0g，(NH4)2SO40.5g，KCl0.2g，MgCl20.1g，MnSO4·H2O0.1mg，FeSO40.1m g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml，pH7.0。将活化好的MH71菌株接种到Pikovskaya’s琼脂培养基平板上，于28℃培养，48、60、72h后观察菌落周围透明圈的产生，出现透明圈表明磷酸酯酶的产生。
结果表明，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71产嗜铁素、纤维素酶和蛋白酶，见图3，不产几丁质酶和磷酸酯酶，尤其是具有强的产嗜铁素和蛋白酶的能力，这是生防菌的关键性生防指标，表明该菌株具有生防潜力，且本菌株来源于生境特殊的地方，有可能具有特殊的生理活性功能，因此值得深入研究并值得开发成生防制剂。
实施例4、本发明解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71对甘蓝枯萎病的田间防效
一、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71发酵液的制备
MH71的固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g,琼脂15g，用蒸馏水定容至1000ml，pH7.0~7.2；种子和发酵培养基：葡萄糖10g，蛋白胨10g，NaCl5g，牛肉膏3g，MnSO4·H2O5mg，用蒸馏水定容至1000ml，pH7.2~7.4。将解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71在固体培养基划线培养24h后，接种一环到种子培养基（500ml三角瓶50ml装量）中，30℃180rpm摇培18h后，以3%接种量接种到发酵培养基（500ml三角瓶100ml装量）中，30℃180rpm摇培48h，即得到解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71的发酵液（三角瓶内的所有培养物）。该发酵液中，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71的菌体和芽孢总数为2~4×109CFU/ml。
二、预防甘蓝枯萎病的田间实验
在延庆康庄镇东官坊选多年甘蓝枯萎病发生严重的地块一块，选择感病品种中甘21号甘蓝（中国农业科学院蔬菜花卉研究所）为供试甘蓝品种。供试药剂为步骤一的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71的发酵液2倍稀释液（简称MH712倍稀释发酵液）和5倍稀释液（简称MH715倍稀释发酵液），多菌灵（Carbendazim，50%可湿性粉剂，江阴市福达农化有限公司）500倍稀释液为化学农药对照，同时设一不施药的处理CK，共4种处理。小区面积为30平方米，重复3次。采用药剂灌根的方法防治甘蓝枯萎病，灌根在从甘蓝种苗苗圃中将幼苗移栽到大田7天后开始，每隔7天灌根1次，共灌根4次，每株苗灌液量为200ml。灌根施药后60天调察发病情况，并计算出防治效果。病害分级标准：0级：无症状；1级：轻微感病，包心不紧，初见黄叶；3级：感病，叶发黄，包心不紧，叶外翻；5级：植株无心，周围叶片外翻；7级：植株严重黄化，无心；9级：植株枯死。防效%=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100，病情指数=[∑（各级病株数×各级代表值）/总株数×9]×100。
表3、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71发酵液对甘蓝枯萎病的防效测定结果
注：表中数据为3次重复的平均值；平均数后的不同字母表示经Duncan's新复极差测验在p=0.05水平上差异显著。
从表3可见，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71的发酵液2倍稀释液和5倍稀释液对甘蓝枯萎病的防效分别为60.01%和47.14%，两者之间差异显著，表明在田间尽可能的提高生防菌的使用浓度，更有助于病害的防治；二者的防效均与多菌灵500倍稀释液（防效30.03%）对比，差异显著。这一结果表明，利用解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MH71的发酵产物来防治甘蓝枯萎病表现出了较好防治优势。若提高其发酵产量和优化制剂工艺，将会提高其对甘蓝枯萎病的防效，因此该菌株值得深入研究。
经检测，该甘蓝枯萎病由尖孢镰刀菌粘团专化型[Fusarium oxysporum Schl.f.sp.conglutinans(Wollenw.)Snyder&Hansen]引起（李明远,张涛涛,李兴红,严红.十字花科蔬菜枯萎病及其病原鉴定[J].植物保护,2003,29(3):44-45.）。
本发明的上述实例仅仅是为更清楚地介绍本发明而做出的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。凡是属于本发明的技术所引出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的菌株号为MH71，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.6978。
2.病原菌抑制剂，它的活性成分是权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌和/或权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的代谢物；
所述病原菌抑制剂对植物或蘑菇细菌性病菌具有抑制作用，所述植物细菌性病菌为黄瓜角斑病菌或大白菜黑腐病菌；所述蘑菇细菌性病菌为平菇褐斑病菌。
3.病害抑制剂，它的活性成分是权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌和/或权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的代谢物；所述病害为植物或蘑菇细菌性病害，所述植物细菌性病害为黄瓜角斑病和/或大白菜黑腐病；所述蘑菇细菌性病害为平菇褐斑病。
4.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌和/或权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的代谢物的下述任一应用：
1）权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌和/或权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的代谢物在抑制病原菌中的应用；
2）权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌和/或权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的代谢物在制备病原菌抑制剂中的应用；
3）权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌和/或权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的代谢物在制备病害抑制剂中的应用；
4）权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌和/或权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的代谢物在抑制病害中的应用；
所述病原菌为植物或蘑菇细菌性病菌，所述植物细菌性病菌为黄瓜角斑病菌或大白菜黑腐病菌，所述蘑菇细菌性病菌为平菇褐斑病菌；所述病害为植物或蘑菇细菌性病害，所述植物细菌性病害为黄瓜角斑病和/或大白菜黑腐病；所述蘑菇细菌性病害为平菇褐斑病。
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