CN104140939A - 解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了解淀粉芽孢杆菌及其应用。该解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）SWJS22于2013年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8425。经单因素实验优化了解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）SWJS22产蛋白酶的条件，其培养、发酵条件简单，遗传性质稳定，并且该菌株分泌的蛋白酶在较低温度和碱性环境中的稳定性较好，在制革、洗涤和食品等行业中有着广泛的用途。

Description

解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及深海中微生物筛选及发酵领域，具体涉及解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SWJS22及其液体发酵产蛋白酶的方法。

背景技术

海洋是生命之源，人类物质资源的天然宝库。它覆盖着地球表面积的71%，海水总体积占地球总水量的97%，生物量约占地球生物总量的80%，生物种类20万种以上，蕴藏着丰富的资源。为了寻求更广泛的微生物及活性物质资源，人类将目光投向了海洋，期望寻求到符合要求的新型菌株及蛋白酶。其中，由于微生物几乎能分泌所有现今已知的酶类，并且微生物来源的酶制剂，相比于木瓜、猪胰脏等动植物来源的酶制剂有其不可替代的优势，因此对微生物菌株及其活性物质的利用已成为了研究的热点。

蛋白酶（Protease）属于水解酶类，是最重要的三大工业用酶之一，销售额约占全球酶制剂市场的60%。如今，在酶类市场中，在碱性条件下具有稳定活性的碱性蛋白酶占据了最大的份额。其应用已经深入到食品、酿造、医药、纺织、皮革、日用化学、洗涤剂、饲料以及水产加工等多个行业，对国民经济的发展起着重要的作用。目前，已被结晶和纯化的蛋白酶超过100种。

正是由于海洋中所具有的低温、高盐、高压的环境，使得海洋中的微生物及其所产的胞外酶具有陆生微生物所不具备的特性。通常，海洋微生物所产酶具有作用pH范围宽，最适pH和反应温度适中，温度对蛋白酶活力影响小等特点。因此，从中国南海的深海海泥中筛选出了能分泌特殊性能或研究价值较高的蛋白酶的微生物菌株，并探讨了其发酵性能和条件。

发明内容

本发明目的之一是提供了一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

本发明目的之二是提供了一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SWJS22在液体发酵生产蛋白酶的应用。

本发明中可生产蛋白酶的深海菌株，为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SWJS22，该菌于2013年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 8425。

对保藏号为CGMCC No. 8425的菌株进行形态学及生理生化鉴定，有以下特征：（1）菌落形态：白色，形状不规则，表面有颗粒感，乳头状凸起，不透明，边缘呈波状；（2）细胞形态：直杆状，链状排列，周生鞭毛，革兰氏阳性；（3）生理生化特征：可在4-40℃环境中生长，好氧，能耐受7%（wt）氯化钠，能水解明胶、淀粉、酪素、柠檬酸盐，能利用硫酸铵、硝酸铵，可利用果糖、葡萄糖、甘露醇、木糖为碳源，吲哚反应、V.P.反应、甲基红试验、接触酶和氧化酶试验为阳性，能产过氧化氢酶，不产硫化氢。

保藏号为CGMCC No. 8425菌株经16S rDNA鉴定，测得基因片段长度为1449bp，具体基因序列见序列表1。将获得的基因序列输入Genbank，应用Blast程序将获得的基因序列与数据库中基因序列进行对比。结果显示与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的16S rDNA序列同源性为99%。将此结果结合菌株形态学及生理生化鉴定特征，确定该菌为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

保藏号为CGMCC No. 8425菌株通过单因素试验对其液体发酵产蛋白酶条件进行了优化。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和技术效果：本发明公开了解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SWJS22产蛋白酶的条件，其培养、发酵条件简单，遗传性质稳定。由于该菌株来源于深海，所分泌蛋白酶具有特殊的性质，并且关于该菌株的文献报道较少，在开发新型深海菌株及酶制剂的研究中，具有重要意义。

附图说明

图1为不同种子液培养时间对解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SWJS22产蛋白酶的影响曲线。

图2 为不同装液量对解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SWJS22产蛋白酶的影响曲线。

图3 为不同发酵温度对解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SWJS22产蛋白酶的影响曲线。

图4 为不同发酵时间对解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SWJS22产蛋白酶的影响曲线。

具体实施方式

富集及种子培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g，硫酸铁0.1g，人工海水1L，pH7.6-7.8。

酪蛋白培养基：酪蛋白10g，牛肉浸粉3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2g，琼脂15g，去离子水L，pH7.3-7.5。

发酵培养基：麦芽糖5g，酵母粉10g，氯化钙2.8g，氯化钠1g，SE170 1.5g，去离子水1L，pH7.5。

编号CGMCC No.8425菌株的分离、筛选

细菌的富集：取少许海泥于含无菌去离子水的锥形瓶中，加入粒无菌玻璃珠，37℃、150rpm摇床中分散30min。吸取1ml上清液接种于富集培养基中（25ml/250ml），37℃、150rpm摇床中培养24h。

初筛：取1ml富集液适当稀释后涂布于酪蛋白培养基上。若细菌产蛋白酶，在菌落周围出现透明水解圈，根据水解圈直径(D)与菌落直径(d)的比值(D／d)大小确定产蛋白酶能力较强的菌株。

分离纯化：挑取D／d比值较大的菌株，连续划线分离三次以上，得纯培养物。将其于接种于斜面上，4℃保藏。

复筛：将上述保藏的菌株接种于种子培养基中，37℃，150r/min，活化12h后，以1%的接种量接种于发酵培养基中（25ml/250ml），发酵培养48h。将发酵完成液于4℃，10000r/min条件下高速离心10min,过滤得上清液，即粗酶液。采用福林-酚法测发酵液中性蛋白酶酶活，筛选出酶活较高的菌株。

编号CGMCC No.8425菌株的鉴定

将活化的编号CGMCC No.8425的菌株接种于L-B培养基中，37℃，150r/min培养12h，经L-B培养液传代培养2-3次后，取1.5mL对数生长末期的菌体培养物，4℃，10000r/min离心5min，收集菌体，去尽培养液。菌体经SDS及蛋白酶K裂解、酚-氯仿-异戊醇抽提、转移上清、0.6倍体积异丙醇析出DNA沉淀后短暂离心、70%乙醇洗涤、TE溶解模板DNA。电泳检测后采用通用引物进行PCR（正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,反向引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。

扩增总反应体系为（20μL）:模板基因DNA 0.5μL；上下游引物(20μmol/l)各1.0μL；Taq DNA聚合酶0.2μL；10×buffer 2.0μL；4种脱氧核苷酸混合物dNTP(各2.5 mmol/L)1.6μL，25 mmol/L MgCl2 1.6μL，双蒸水(ddH2O)12.1μL。PCR扩增条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 1.5 min；72℃ 10 min；10℃，共30个循环。PCR产物纯化后完成测定的16S rDNA基因基因片段长度为1449bp，与Bacillus amyloliquefaciens strains相似性最高，同源性达99%，具体序列见序列表。结合菌株形态学、生理生化特征，判定编号CGMCC No.8425的菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

海水芽孢杆菌CGMCC No.8425液体发酵产蛋白酶条件优化

种龄的优化：将菌株接种于种子液中，37℃，150r/min，分别培养4h、8h、12h、16h、24h后，接种于发酵培养基发酵48h，测定其酶活。结果见图1。种龄对发酵液中蛋白酶活力无显著影响。

摇瓶装液量的优化：采用250ml锥形瓶进行摇瓶发酵，装液量分别为10%、20%、30%、40%、60%、80%，在37℃，150r/min条件下发酵48h。测定发酵液中蛋白酶酶活，结果如图2，装液量为10%时酶活最高，随着装液量的增加，蛋白酶活力下降较快。

发酵温度的优化：将发酵液分别置于25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃下，150r/min，装液量为10%，发酵培养48h。测其发酵液中蛋白酶酶活，结果如图3，在37℃的环境中发酵，发酵液中蛋白酶活较高。

发酵时间优化：将接种后的装液量为10%的发酵液放于37℃，150r/min，培养72h，每隔6h取样，测其蛋白酶酶活。结果如图4，蛋白酶活在54h时达到最大，随着时间进一步延长，酶活力有较小幅度下降。

编号CGMCC No.8425菌株的遗传稳定性

表1

传代次数	1	2	3	4	5	6	7	8
									蛋白酶活U/mL	282±12	291±8	276±21	282± 10	291± 21	289± 9	271± 19	286± 21

将保藏的编号CGMCC No.8425菌株连续传代培养，并测其酶活，以酶活力作为评价遗传稳定性的指标。结果如表1，传代8次，蛋白酶力保持在280U/ml左右，表明菌株有较好的遗传稳定性。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  华南理工大学

 

<120>  解淀粉芽孢杆菌及其应用

 

<130> 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  1449

<212>  DNA

<213>  解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）

 

<400>  1

cctctgtcac ttcggcggct ggctcctaaa ggttacctca ccgacttcgg gtgttacaaa       60

 

ctctcgtggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct      120

 

gatccgcgat tactagcgat tccagcttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccgaac      180

 

tgagaacaga tttgtgggat tggcttaacc tcgcggtttc gctgcccttt gttctgtcca      240

 

ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct      300

 

tcctccggtt tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaaga      360

 

tcaagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa      420

 

ccatgcacca cctgtcactc tgcccccgaa ggggacgtcc tatctctagg attgtcagag      480

 

gatgtcaaga cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc      540

 

ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg      600

 

agtgcttaat gcgttagctg cagcactaag gggcggaaac cccctaacac ttagcactca      660

 

tcgtttacgg cgtggactac cagggtatct aatcctgttc gctccccacg ctttcgctcc      720

 

tcagcgtcag ttacagacca gagagtcgcc ttcgccactg gtgttcctcc acatctctac      780

 

gcatttcacc gctacacgtg gaattccact ctcctcttct gcactcaagt tccccagttt      840

 

ccaatgaccc tccccggttg agccgggggc tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg      900

 

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ggcacgtagt tagccgtggc tttctggtta ggtaccgtca aggtgccgcc ctatttgaac     1020

 

ggcacttgtt cttccctaac aacagagctt tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg     1080

 

gcgttgctcc gtcagacttt cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg     1140

 

agtctgggcc gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc     1200

 

gtcgccttgg tgagccgtta cctcaccaac tagctaatgc gccgcgggtc catctgtaag     1260

 

tggtagccga agccaccttt tatgtctgaa ccatgcggtt cagacaacca tccggtatta     1320

 

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gtccgccgct aacatcaggg agcaagctcc catctgtccg ctcgacttgc atgtatagca     1440

 

cccccatcc                                                             1449 

 

Claims (2)

1.一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SWJS22，该菌于2013年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 8425。

2.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SWJS22在液体发酵生产蛋白酶的应用。