CN106676023A

CN106676023A - 一株高产中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN106676023A
Application number: CN201510750221.5A
Authority: CN
Inventors: 张大伟; 付刚; 宋亚凤
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2015-11-05
Filing date: 2015-11-05
Publication date: 2017-05-17

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌BAP-1及发酵生产的中性蛋白酶。该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BAP-1。本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BAP-1能发酵生产中性蛋白酶，发酵液中中性蛋白酶的酶活力可达8000U/mL，为一种具有良好应用前景的菌株。

Description

一株高产中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属生物工程技术领域，具体涉及一株具有分泌生产高酶活中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用。

背景技术

解淀粉芽孢杆菌在自然界中分布广泛，一般为好氧或兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌，胞内可产生圆形、椭圆形或柱状的内生芽孢。芽孢壁中有皮质层，对热、紫外线和离子辐射及抗菌素具有很高的抗性，可以耐受饲料加工、储藏、耐酸、高温、耐挤压等优点。

中性蛋白酶是能催化蛋白质肽键水解, 最适作用pH 值在7.0 左右的蛋白酶。中性蛋白酶由于具有催化反应速度快、无工业污染、催化反应条件适应性较宽等性质和优点，被应用于食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业。

酶的应用已有千年以上的历史，虽然中性蛋白酶是最早为人类所发现并应用于工业化生产的蛋白酶制剂之一，但是广泛应用还是最近几十年的事。随着科学技术的发展，随着酶的制备、酶和细胞固定化、酶分子改造等酶技术的发展，中性蛋白酶的应用范围也不断扩大。自上世纪以来，世界各国科研工作者一直都致力于中性蛋白酶产生菌的筛选、酶提取、纯化以及酶学性质的研究和应用研究工作，取得了一定的成绩。

国内目前从事中性蛋白酶生产与销售的酶制剂企业很少，主要是由于所采用生产菌种大多为上世纪八十年代所开发的诱变菌株，产酶能力下降、不太稳定、部分优良性状出现部分退化或丧失，且易受到酵母及噬菌体的污染，对生产造成一定程度的损失，加之，目前我国中性蛋白酶发酵单位相对较低，浓缩成本高，不便保存与运输。国外对中性蛋白酶的研究比较早，一些产品化的中性蛋白酶类，都已经研究得比较透彻，且都申请了专利，所以要筛选新的中性蛋白酶生产菌株将成为一个发展方向。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用。本发明是从天津滨海新区大港水库的土壤中分离筛选出一株中性性蛋白酶高产菌株，该高产菌株能高效分泌表达中性蛋白酶，酶活力较高，为低成本、规模化生产中性蛋白酶奠定了基础。

本发明的优势是：（1）解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1 是从天津滨海新区大港水库的土壤中分离出来的，在发酵过程中能产生高活性的蛋白酶。（2）解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1生长迅速，具有较强分解蛋白的能力。

本发明通过分离筛选的方法获得了一株高产中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌。所述菌株能显著提高中性蛋白酶的产量，摇瓶发酵酶活高达8000U/ml，且该菌株株表达的中性蛋白酶的酶学性质稳定，具有良好的应用前景。

附图说明

图1：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1菌落在脱脂牛奶培养基平板上水解圈图；

图2：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1 16SrDNA电泳图；

图3：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1生长曲线图；

图4：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1发酵生产中性蛋白酶酶活图；

图5：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAP-1在不同的发酵条件下，生产中性蛋白酶酶活图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例 1 解淀粉芽孢杆菌的筛选

（1）蛋白酶菌株初筛。将采集的土样称取10 g，加入装有90ml无菌水并放有玻璃珠的250 ml三角瓶中，80℃水浴30 min，再充分振荡30 min，制成10^-5g/ml，10^-6g/ml，10^-7 g/ml的土壤悬液，分别涂布于用于初筛的加有脱脂牛奶的LB培养基平板上，37℃培养2-4天，观察透明圈的有无。如果产生透明圈，分别测量透明圈和菌落的直径并计算其比值，选择比值较大的菌株进行复筛。附图1中1和2为筛选到的解淀粉芽孢杆菌在脱脂牛奶平板中形成的透明圈，3和4为不分泌蛋白酶的枯草芽孢杆菌1A751对照组。

（2）蛋白酶菌株复筛。取初筛获得的中性蛋白酶菌株分别接种到30ml发酵培养基中，37℃，220rpm培养48h，用福林（Folin）法测定（参照《中华人民共和国专业标准》SB/T 10317-1999蛋白酶活力测定法），其原理是蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。从中选择出酶活力最高的菌株作为目的菌株，进行革兰氏染色和生理生化鉴定。

（3）菌种的确认

采用常规生理生化反应与分子16S rRNA技术对从土壤中筛选出来的菌株进行鉴定。根据解淀粉芽孢杆菌在Genebank中的16S rRNA进行分子鉴定，电泳结果如附图2所示；所述菌株在固体平板上菌落颜色为乳白色，表面干燥不透明，革兰氏染色呈阳性，镜检为长杆状，有芽孢，可利用柠檬酸盐，硝酸还原、V-P 实验、氧化酶与过氧化氢酶均为阳性，且具运动性，进一步采用法国生物梅里埃细菌鉴定仪(参照《常见细菌鉴定手册》)，最终确定BAP-1为解淀粉芽孢杆菌。

(4)生长曲线的测定

从-80℃甘油管保存的解淀粉芽孢杆菌BAP-1用三区划线法接种于固体LB平板上在37℃培养箱中培养12 h后，接种在LB固体平板上活化的单菌落至LB液体培养基中培养12h后，以1%的接种量接种到30mL的LB培养基中，每隔30min取样测定其OD₆₀₀得到其生长曲线，结果附图3所示。

实施例 2 解淀粉芽孢杆菌发酵生产中性蛋白酶

从-80℃甘油管保存的解淀粉芽孢杆菌BAP-1用三区划线法接种于固体LB平板上在37℃培养箱中培养12 h后，接种在LB固体平板上活化的单菌落至LB液体培养基中培养12h后，以1%的接种量接种到30mL发酵培养基中37℃，220 rpm培养基中振荡培养，每间隔12h后，将发酵液离心，以福林酚法测定粗酶液活力，结果附图4所示。

实施例 3 产中性蛋白酶出发菌株发酵培养基的优化

在原来发酵培养基2×SR的基础上添加不同浓度的不同的碳源或氮源，发酵生产碱性蛋白酶，具体方法同上。这些碳源或氮源的终浓度分别为1%的棉籽粉，1%的淀粉，0.3%的牛肉膏，0.5%的蛋白胨，0.5%的酵母膏和0.5%的葡萄糖，标记为BAP-1-a，BAP-1-b，BAP-1-c，BAP-1-d，BAP-1-e, BAP-1-f。终浓度分别为4%的棉籽粉，4%的淀粉，0.8%的牛肉膏，1.5%的蛋白胨，2%的酵母膏和2%的葡萄糖，标记为BAP-1-g，BAP-1-h，BAP-1-i，BAP-1-j，BAP-1-k, BAP-1-l。其中添加终浓度为0.5%的葡萄糖和终浓度为1%的淀粉时发酵生产的中性蛋白酶酶活最高。结果附图5所示。

碱性蛋白酶活力的测定

采用《中华人民共和国专业标准》SB/T 10317-1999蛋白酶活力测定方法即福林（Folin）法。

其中各培养基的配方如下：

(1) LB固体培养基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，脱脂牛奶10 g/L，琼脂20 g/L，pH自然，121℃灭菌 20min。

(2)LB种子培养基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L， pH自然，121℃灭菌 20min。

(3)2×SR发酵培养基：酵母浸粉50 g/L，蛋白胨30 g/L，K₂HPO₄ 6 g/L，pH 7.2. 121℃灭菌 20min。

Claims

1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BAP-1，其特征在于该解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BAP-1。

2.一种或多种由权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌生产的中性蛋白酶及蛋白酶系。

3.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌生产蛋白酶的发酵培养基进行优化，其发酵优化培养基组成为：酵母浸粉50 g/L，蛋白胨30g/L，5 g/L葡萄糖，10 g/L的淀粉，K₂HPO₄ 6 g/L，pH 7.2。