CN105087446A - 一株高产中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体是通过紫外诱变的方法获得一株突变菌株解淀粉芽孢杆菌FN61，保藏编号为CCTCC？NO：M2015527。所述突变菌能显著提高中性蛋白酶的产量，20L罐发酵酶活高达14135？U/ml，较出发菌提高了42%。该突变菌所产中性蛋白酶的最适作用pH为7.5，与出发菌株一致，但突变菌产的蛋白酶在pH6.5-8.5范围内的相对酶活普遍高于出发菌，从而说明突变菌产的蛋白酶比出发菌更适合在中性条件下发挥作用；该突变菌产的蛋白酶最适作用温度为40℃，较出发菌没有发生改变，取得了意料不到的技术效果。本发明所述突变菌株FN61产中性蛋白酶可广泛应用于饲料和食品加工领域，前景广阔。

Description

一株高产中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌

技术领域

本发明属于微生物筛选技术领域，具体涉及一株高产中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术

蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，可将大分子的蛋白质水解为氨基酸、小肽等产物。中性蛋白酶是指最适作用pH为6.0-7.5的一类蛋白酶，作为一种生物催化剂，它具有催化反应速度快，无工业污染，催化反应条件适应性宽等的性质和优点。微生物由于具有生长速度快、所需生长空间小、广泛的生化多样性及其遗传可操作性等特点，因而备受人们的青睐。据统计，微生物蛋白酶占据了世界整个酶销售市场约40%左右的份额，已成为市场上蛋白酶生产的主要来源。大多数市售中性蛋白酶大都产自芽孢杆菌属。

中性蛋白酶是最早为人类所发现并应用于工业化生产的蛋白酶制剂之一。目前中性蛋白酶已被广泛的应用于食品、皮革、毛皮、化妆品、医药等行业。其中，在畜禽饲料配方中添加中性蛋白酶，可有效提高蛋白质的利用率和降低饲养成本；另外，中性蛋白酶具有较强的脱毛能力，能够避免传统的皮革加工使用硫酸钠进行处理造成的环境污染；中性蛋白酶应用于啤酒生产中，可排除蛋白质产生的“冷浑浊”现象；在洗涤剂用品中加入中性蛋白酶可大大提高洗涤效果；在医药行业中，中性蛋白酶还可作为消化、消炎、化痰止咳等药物，以及用于治疗跌打伤、水肿血肿，消除坏死组织等。

中性蛋白酶的研究开发工作自上世纪七十年代就已开始，国内外都于上世纪八十年代初实现产业化，但中性蛋白酶发酵单位一直很低，发酵不稳定，易受噬菌体和酵母的污染。因此国内外科技工作者一直致力于加速开发新型中性蛋白酶高产菌株，提高生产菌株的产酶能力，从而降低中性蛋白酶的生产成本。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）及其应用。本发明通过紫外诱变的方法筛选出一株中性蛋白酶高产菌株，该菌株能高效分泌表达中性蛋白酶，为中性蛋白酶的广泛应用奠定了基础。

本发明一方面涉及一种解淀粉芽孢杆菌突变株，为解淀粉芽孢杆菌FN61（BacillusamyloliquefaciensFN61），已于2015年9月14日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2015527。

本发明另一方面涉及一种中性蛋白酶，是由上述解淀粉芽孢杆菌突变株FN61发酵得到的。

所述中性蛋白酶在饲料和食品加工领域中的应用。

本发明通过紫外诱变的方法获得的突变菌株解淀粉芽孢杆菌FN61能显著提高中性蛋白酶的产量，20L罐发酵酶活高达14135U/ml，较出发菌提高了42%。该突变菌所产中性蛋白酶的最适作用pH为7.5，与出发菌株一致，但突变菌产的蛋白酶在pH6.5-8.5范围内的相对酶活普遍高于出发菌，从而说明突变菌产的蛋白酶比出发菌更适合在中性条件下发挥作用；该突变菌产的蛋白酶最适作用温度为40℃，较出发菌没有发生改变，取得了意料不到的技术效果。本发明所述突变菌株FN61产中性蛋白酶可广泛应用于饲料和食品加工领域，前景广阔。

附图说明

图1为突变菌FN61和出发菌FN产蛋白酶的作用pH-相对酶活曲线图；

图2为突变菌FN61和出发菌FN产蛋白酶的作用温度-相对酶活曲线图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。

对于本发明所涉及的术语及相关测定方法解释如下：

1、蛋白酶酶活测定方法：采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法（GB/T25327-2009）.

2、酶活单位的定义：1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g（U/mL）表示。

3、运用福林法进行蛋白酶活力测定，使用到的溶液包括：福林使用溶液（一份市售福林溶液与两份水混合，摇匀），碳酸钠溶液（42.4g/L），三氯乙酸（65.4g/L），梯度pH值缓冲液，酪蛋白溶液（10.0g/L）。反应过程如下：试管中加入1mL酶液，40℃温浴2min，加入酪蛋白溶液1mL，摇匀后40℃温浴10min，加入2mL三氯乙酸溶液，摇匀（空白对照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液）。取出静止10min，慢性定性滤纸过滤。取1mL滤液，加碳酸钠溶液5mL，加福林试剂使用溶液1mL，40℃显色20min，于680nm波长，用10mm比色皿测定吸光度。

实施例1出发菌解淀粉芽孢杆菌FN的紫外诱变与筛选

出发菌：解淀粉芽孢杆菌FN（BacillusamyloliquefaciensFN），该菌株由发明人付娟于2014年5月分离自山东省青岛市崂山区林场土壤中，能发酵产中性蛋白酶。

菌悬液制备

将出发菌解淀粉芽孢杆菌FN在LB斜面（酵母粉0.5%，蛋白胨1%，NaCl1%，琼脂2%）上划线接种，37℃培养24h；加入5mL0.85%的无菌生理盐水，将斜面上的菌体全部冲洗下来，转入无菌的含有玻璃珠的试管中，涡旋震荡10min，完全打成单细胞菌体；将菌悬液全部转入15mL离心管，6000rpm离心3min收集菌体，取上清，用10mL生理盐水悬浮菌体；洗涤细胞两次，最后调整细胞浓度至10⁸个/mL.

1.2紫外诱变处理及诱变剂量确定

打开9W紫外灯开关，预热约30min；取直径9cm无菌平皿，加入上述细胞浓度为10⁸个/mL的菌悬液10mL，加入一根无菌磁力搅拌转子，打开磁力搅拌器，打开皿盖，在垂直距离为15cm处，分别搅拌照射1min，2min，3min，4min，5min；盖上平皿盖，关闭紫外灯，黑暗中孵育30min。

将照射后的菌悬液用0.85%生理盐水梯度稀释至10^-1~10^-6；取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度的菌悬液各100μL，涂布LB平板，每个稀释度涂布三个平板；以同样的操作，取未经紫外线照射处理的菌液稀释涂平板作对照。将上述涂布均匀的平板，用黑布或报纸包好后，置于37℃过夜培养。

统计不同照射时间下每个稀释度下平板上长出的单菌落数，若在某个稀释度下长出的单菌落数在30~300个之间，则认为改稀释度合适。将该稀释度下三个平板上长出的单菌落数求平均值，按下列公式计算菌悬液浓度：

菌悬液浓度（CFU/mL）=某个稀释度下的菌落平均数×稀释倍数×10

按下列公式计算某个紫外处理剂量下的致死率：

经计算，不同紫外诱变剂量下解淀粉芽孢杆菌FN的致死率如表1所示。

表1：紫外线诱变致死率

时间/min	1	2	3	4	5
						致死率/%	96.1	97.9	98.6	99.8	99.9

从表1可以看出，菌悬液经紫外照射1min后致死率达到95%以上，因此确定最终诱变时间为1min。

1.3脱脂奶粉平板透明圈大小初筛

从致死率为95%的LB平板上挑取菌落，划线培养获得单菌落后点种于脱脂奶粉（脱脂奶粉1%，酵母粉0.25%，蛋白胨0.5%，NaCl0.5%，琼脂2%）平板，每组设3个平行，同时点种出发菌株作为对照。37℃培养36h后，均匀滴入10%三氯乙酸。选择透明圈直径与菌落直径的比值大于出发菌的单菌落再次纯化，共筛选到110株突变菌株，分别命名为FN1、FN2、FN3、……、FN110。

1.4摇瓶复筛

将上述筛选得到的110株突变菌分别接种于50mL摇瓶发酵培养基（葡萄糖5%，豆饼粉3%，麸皮3%，Na₂HPO₄0.78%，KH₂PO₄0.05%）中，37℃培养72h后，离心取上清液，分别测定发酵上清液中的蛋白酶酶活，同时以出发菌株作为对照。酶活测定结果显示：出发菌株发酵上清液中蛋白酶酶活为239U/mL，而本发明初筛获得的110株突变菌中蛋白酶酶活最高的菌株分别为FN13，FN44和FN61，其发酵上清液中蛋白酶酶活分别为350U/mL，387U/mL，377U/mL，比出发菌提高了46.4%，61.9%，57.7%。

将突变株FN13、FN44和FN61在LB平板上传代5次以后，挑取单菌落，分别进行摇瓶发酵，其蛋白酶酶活仍比出发菌提高40%以上，从而说明本发明获得的上述3株突变株多次传代后，依然能保持遗传上的稳定性。将突变株进行有效的摇瓶发酵

1.520L罐发酵筛选

分别挑取出发菌FN，突变菌FN13、FN44和FN61的单菌落接种于0.6LLB液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养8h后，全部接种到含12L发酵培养基（葡萄糖5%，豆饼粉3%，麸皮3%，Na₂HPO₄0.78%,KH₂PO₄0.05%）的20L发酵罐中，30℃发酵培养96h，分别检测发酵上清液中的蛋白酶酶活。结果显示，突变菌FN61的蛋白酶酶活最高，达到14135U/mL，比出发菌株FN提高了42%。多次发酵试验也表明FN61产蛋白酶的水平保持稳定。

申请人将上述突变菌株FN61命名为解淀粉芽孢杆菌FN61（BacillusamyloliquefaciensFN16），并于2015年9月14日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2015527。

实施例2解淀粉芽孢杆菌FN61产蛋白酶的酶学性质分析

2.1最适作用pH分析

采用pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH值分别为8.5、9.0的硼砂-硼酸缓冲液，将上述突变菌株FN61和出发菌株FN发酵上清液进行稀释，底物也分别用对应pH值的缓冲液配制，在40℃条件下进行蛋白酶酶活力测定，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图1所示，本发明获得的突变菌株FN61产的蛋白酶最适作用pH值为7.5，为中性蛋白酶，与出发菌株一致。但是，突变菌FN61产的蛋白酶在pH6.5-8.5范围内的相对酶活普遍高于出发菌，从而说明突变菌FN61产的蛋白酶比出发菌更适合在中性条件下发挥作用，应用前景更广。

2.2最适作用温度分析

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，pH7.0条件下，对上述突变菌株FN61和出发菌株FN发酵上清液进行蛋白酶酶活测定，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图2所示，本发明获得的突变菌株FN61产的蛋白酶最适作用温度为40℃，与出发菌株一致。

综上所述，本发明通过紫外诱变方法获得的突变菌株解淀粉芽孢杆菌FN61能显著提高中性蛋白酶的产量，20L罐发酵酶活能达到14135U/mL，较出发菌株提高了42%，且突变菌FN61产的蛋白酶比出发菌更适合在中性条件下发挥作用，取得了意料不到的技术效果。

Claims (5)

1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述的解淀粉芽孢杆菌的保藏号为CCTCCNO：M2015527。

2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在生产蛋白酶中的应用。

3.一种蛋白酶，其特征在于，所述的蛋白酶是通过权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌发酵得到的。

4.权利要求3所述的蛋白酶在饲料领域中的应用。

5.权利要求3所述的蛋白酶在食品加工领域中的应用。