CN103045485A - 米黑根毛霉菌株及其在制备β-葡聚糖酶和凝乳酶中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种米黑根毛霉菌株及其在制备β-葡聚糖酶和凝乳酶中的应用。本发明提供的米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432，其保藏编号为CGMCC No.4967。本发明所提供的菌株米黑根毛霉CAU432耐热性好，且菌种稳定性好，产酶高，发酵成本低(利用的碳源和氮源易于购买，价格便宜)，生产周期短，适宜应用于工业化生产领域，具有较好的工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种米黑根毛霉菌株及其在制备β-葡聚糖酶和凝乳酶中的应用。
背景技术
β-葡聚糖(Glucan)是以葡萄糖为单体形成的高分子聚合多糖，广泛存在于植物和微生物的细胞壁中。β-葡聚糖酶(Glucanase)是一类重要的水解酶，作用于β-葡聚糖的1，3及1，4糖苷键；该酶可以有效分解麦类和谷类植物胚乳细胞壁中的β-葡聚糖；在饲料中可降低非淀粉多糖(NSP)及其抗营养因子的含量，改善畜禽对营养物质的吸收，提高畜禽的生长速度和饲料转化效率；在啤酒酿造上用于降低麦汁黏度，改善过滤性能，提高麦芽溶出率，防止啤酒浑浊，稳定啤酒质量等。
迄今，微生物发酵产β-葡聚糖酶发酵的研究主要集中于木霉(Trichoderma)、曲霉(Aspergillus)和芽孢杆菌(Bacillus)，而芽孢杆菌中研究较多的是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和嗜碱芽孢杆菌(alkalophilic Bacillussp.)，且以枯草芽孢杆菌产酶活性最高。真菌发酵β-葡聚糖酶是以中温菌木霉和黑曲霉为主。嗜热真菌发酵产耐热β-葡聚糖酶的研究报道较少。
凝乳酶(chymosin，EC3.4.23.4)是一种从未断奶的小牛皱胃中发现的天门冬氨酸蛋白酶，其主要的生物学功能是有限切断酪蛋白的κ-酪蛋白的Phe-Met106连接的肽键，导致牛奶凝结，被广泛应用于干酪制造业，是食品领域中重要的酶制剂。凝乳酶的传统制备方法是从刚出生的小牛皱胃中提取，传统的提取方法与现代工业发展极不协调。研究者不断寻找新的凝乳酶来源，主要包括动物性凝乳酶、植物性凝乳酶及微生物凝乳酶。微生物生产周期短，产量大，生产凝乳酶的成本较低、酶提取方便。
目前微生物凝乳酶应用最多的是微小毛霉(Mucor pusillus)产生的凝乳酶。国内外关于天然微生物液体发酵生产凝乳酶的专利申请较少，且产酶量偏低。目前生产凝乳酶水平普遍偏低，生产周期长和发酵成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种米黑根毛霉菌株及其在制备β-葡聚糖酶和凝乳酶中的应用。
米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432已于2011年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4967。米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU43 2CGMCC No.4967简称米黑根毛霉CAU432。
本发明还保护一种用于培养所述米黑根毛霉CAU432的培养基，由碳源、氮源、无机盐和水组成；所述碳源为如下物质中的至少一种：甘蔗皮、玉米苞皮、玉米杆、燕麦(优选)、麦麸、甘蔗渣、玉米芯、啤酒酒糟、稻壳、可溶性淀粉、几丁质、高粱杆、白酒酒糟、麸皮、稻草和葡萄糖；所述氮源为如下物质中的至少一种：酵母提取物、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨(优选)、豆粕粉、黄豆粉(优选)、脱脂奶粉、蛋白胨、尿素、磷酸氢二铵、硫酸铵、酵母提取物和胰蛋白胨等质量混合得到的酵母蛋白胨混合物、硝酸铵和大豆蛋白胨；所述无机盐为如下物质中的至少一种：KH2PO4、MgSO4和CaCl2。所述培养基的pH可为自然pH或pH 5.0-7.0(如pH 5.0、pH 6.0或pH 7.0)。
所述培养基可由所述碳源、所述氮源、KH2PO4、MgSO4、CaCl2和水组成。
所述培养基优选为如下(a)至(d)中任一所述的培养基：
(a)将所述碳源10g-50g(0.45-0.9mm粒径范围或0.18-0.3mm粒径范围的粉末)(如10g、20g、30g、40g或50g)、氮源10g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g和CaCl2 0.3g溶于水并用水定容至1L得到的培养基；
(b)将所述碳源(0.45-0.9mm粒径范围或0.18-0.3mm粒径范围的粉末)和基础培养液甲混合得到的培养基；所述基础培养液甲的制备方法为：将所述氮源10g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g和CaCl2 0.3g溶于水并用水定容至1L得到的培养基；所述培养基的初始含水量为70-90％(质量百分含量)(如70％、75％(优选)、80％、85％或90％)；
(c)将所述碳源(0.45-0.9mm粒径范围或0.18-0.3mm粒径范围的粉末)、所述氮源和基础培养液乙混合得到的培养基；所述基础培养液乙的制备方法为：将CaCl2 0.3g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g和吐温-80 0.34g溶于水并用水定容至1L；所述培养基的初始含水量为30-75％(质量百分含量)(如33.3％、50％(优选)、60％、66.7％、71.4％)；所述碳源和所述氮源的质量比为5∶1；
(d)将所述碳源10g-50g(0.45-0.9mm粒径范围或0.18-0.3mm粒径范围的粉末)(如10g、20g、30g、40g、50g)、所述氮源10g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O0.3g和CaCl2 0.3g溶于水并用水定容至2.5L得到的培养基。
本发明还保护一种制备β-葡聚糖酶和/或凝乳酶的方法，是采用所述培养基发酵所述米黑根毛霉CAU432，得到β-葡聚糖酶和/或凝乳酶。
所述方法具体可为如下(1)至(4)中的任意一种：
(1)采用(a)所述培养基50℃振荡发酵所述米黑根毛霉CAU432，得到β-葡聚糖酶；所述发酵的时间为1天以上，优选为1-6天，最优选为3-5天；
(2)采用(b)所述培养基50℃静置发酵所述米黑根毛霉CAU432，得到β-葡聚糖酶；所述发酵的时间为1天以上，优选为1-6天，最优选为3-5天；
(3)采用(c)所述培养基37℃静置发酵所述米黑根毛霉CAU432，得到凝乳酶；所述发酵的时间为1天以上，优选为1-6天，最优选为2天；
(4)采用(a)所述培养基37℃振荡发酵所述米黑根毛霉CAU432，得到凝乳酶；所述发酵的时间为1天以上，优选为1-6天，最优选为3-5天；
(5)在发酵罐中采用(d)所述培养基发酵所述米黑根毛霉CAU432，得到β-葡聚糖酶；所述发酵的条件为：40-55℃(如50℃)、通气量为1-2vvm(如1.2vvm)、搅拌速率为300-600rpm(如500rpm)、发酵时间为10h以上(如10-72h，优选50h)。
所述方法(1)和/或所述方法(5)还包括如下步骤：将所述发酵得到的发酵液10000×g冷冻离心10min，取上清液，即为含有β-葡聚糖酶的溶液。
所述方法(2)还包括如下步骤：将所述发酵得到的固体发酵物加入50mM pH 6.0柠檬酸缓冲液，室温下200rpm震荡浸提2h，10000×g冷冻离心10min，取上清液，即为含有β-葡聚糖酶的溶液。
所述方法(3)还包括如下步骤：将所述发酵得到的固体发酵物加入去离子水，37℃、200rpm震荡浸提2h，10000rpm冷冻离心10min，取上清液，即为含有凝乳酶的溶液。
所述方法(4)还包括如下步骤：将所述发酵得到的发酵液10000rpm冷冻离心10min，取上清液，即为含有凝乳酶的溶液。
所述方法(1)和/或所述方法(2)和/或所述方法(5)还包括如下步骤：将所述含有β-葡聚糖酶的溶液依次进行硫酸铵沉淀、DEAE52弱阴离子交换层析和QSFF强阴离子交换层析，得到纯化后的β-葡聚糖酶。
以上任一所述方法得到的β-葡聚糖酶和/或凝乳酶也属于本发明的保护范围。
所述β-葡聚糖酶作为β-葡聚糖酶的应用也属于本发明的保护范围。所述应用中，所述应用的反应条件可为40-65℃、pH 4.0-7.0，优选为pH 5.5、60℃。
所述凝乳酶作为凝乳酶的应用也属于本发明的保护范围。
米黑根毛霉CAU432具有很高的产β-葡聚糖酶的能力。摇瓶发酵培养产酶水平为2000-6500U/mL，固体发酵培养产酶水平为50000-55000U/g，5L发酵罐扩大培养50h酶活可达到5500-8000U/mL，是目前相关报道中的最高水平。米黑根毛霉CAU432发酵得到的β-葡聚糖酶，最适pH为5.5，最适温度为60℃，该酶具有很好的温度稳定性，在70℃下处理30min后酶活力仍能保持80％以上。米黑根毛霉CAU432具有很高的产凝乳酶的能力，产酶水平可达105000U/g。
米黑根毛霉CAU432具有产凝乳酶的能力。固体发酵培养产凝乳酶水平为105000U/g干基，液体发酵出产凝乳酶水平为5450U/mL。
本发明所提供的菌株米黑根毛霉CAU432耐热性好，且菌种稳定性好，产酶高，发酵成本低(利用的碳源和氮源易于购买，价格便宜)，生产周期短，适宜应用于工业化生产领域，具有较好的工业化应用前景。
附图说明
图1为发酵时间对米黑根毛霉CAU432摇瓶液体发酵产β-葡聚糖酶活性的影响。
图2为米黑根毛霉CAU4325L发酵罐产β-葡聚糖酶过程曲线。
图3为β-葡聚糖酶的纯化过程中的蛋白电泳图；1：粗酶液；2：粗蛋白；3：DEAE52弱阴离子交换层析纯化后的蛋白；4和5：QSFF强阴离子交换层析纯化后的蛋白。
图4为β-葡聚糖酶的最适pH。
图5为β-葡聚糖酶的pH稳定性。
图6为β-葡聚糖酶的最适温度。
图7为β-葡聚糖酶的温度稳定性。
图8为发酵时间对米黑根毛霉CAU432固体发酵产凝乳酶酶活性的影响。
图9为碳源种类对米黑根毛霉CAU432液体发酵产凝乳酶酶活性的影响。
图10为氮源种类对米黑根毛霉CAU432液体发酵产凝乳酶酶活性的影响。
图11为米黑根毛霉CAU432摇瓶发酵产凝乳酶过程曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
酵母提取物、胰蛋白胨，购自英国Oxoid公司。琼脂、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨、酪蛋白、豆粕粉、尿素、可溶性淀粉等购自北京康明威培养基技术有限责任公司。KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、NaOH、苯酚、Na2SO3、CuSO4·5H2O、酒石酸钾、Na2CO3、脱氧胆酸钠、三氯乙酸，均为分析纯，购自北京化工厂。3，5-二硝基水杨酸购自上海远帆制剂厂。大麦β-葡聚糖、葡萄糖购自Sigma公司。脱脂奶粉(脱脂粉)购自完达山股份有限公司。几丁质购自青岛海洋奇力生物工程有限公司。蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限公司。
燕麦、甘蔗皮、稻草、玉米苞皮、麸皮、白酒酒糟、玉米杆、高粱杆、麦麸、甘蔗渣、稻壳、玉米芯和啤酒酒糟均粉碎后过筛，取粉末用作培养基的制备。
活化培养基的配制方法：燕麦(0.18-0.3mm粒径范围的粉末)10g、酵母提取物5g、胰蛋白胨5g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCl2 0.3g、琼脂20g，加水到1L，自然pH。
种子培养基的配制方法：燕麦(0.18-0.3mm粒径范围的粉末)10g、酵母提取物5g、胰蛋白胨5g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCl2 0.3g，加水到1L，自然pH。
采用DNS法测定β-葡聚糖酶酶活。反应原理：3，5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和棕红色物的颜色深浅呈一定比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的吸光度值，便可求出样品中还原糖的含量。描述DNS法测定β-葡聚糖酶酶活的参照文献：Miller.，et al.1959.Use ofdinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars.Analytical Chemistry.1959，31：426-428.。
凝乳酶酶活测定的参考文献：Arima(Arima K，Yu J，Iwasaki S.Milk-clotting enzymefrom Mucorpussilus.Methods in Enzymology Academic，1970，19(3)：446-460.。
采用Lowry法测定蛋白质含量。描述Lowry法测定蛋白质含量的参考文献：Lowry，O.H.Rosebrough，N.J.，Farr，A.L.and Randall，R.J.Protein measurement with the folinphenol reagent.Biol.Chem.，1951，193：265-275。
实施例1、菌株的分离和鉴定
一、菌株的分离
本发明提供的米黑根毛霉CAU432是从土壤中筛选得到的。
分离培养基的配制方法：燕麦(0.18-0.3mm粒径范围的粉末)20g，大豆蛋白胨10g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCl2 0.3g、琼脂20g、加水到1L，自然pH。
初筛培养基的配制方法：燕麦(0.18-0.3mm粒径范围的粉末)20g，大豆蛋白胨10g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCl2 0.3g、刚果红0.05g、琼脂20g，加水到1L，自然pH。
发酵培养基的配制方法：燕麦(0.18-0.3mm粒径范围的粉末)20g，大豆蛋白胨10g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCl2 0.3g，加水到1L，自然pH。
新鲜土样稀释后涂布于分离培养基中，在50℃恒温培养箱中培养。待分离培养基中有菌落长出，将菌株接种到初筛培养基，凡在菌落周围能使刚果红褪色形成透明圈的菌株，接种到发酵培养基；培养条件：50℃、200rpm、36h。发酵结束后取1mL发酵液于1.5mL离心管中，离心(12000rpm、10min)取上清，测定β-葡聚糖酶及凝乳酶酶活。
筛选得到一株酶活较高的菌株，将其命名为菌株CAU432。
二、菌株的鉴定
菌株CAU432的形态特征：在麦芽汁平板培养基上生长良好，最适生长温度为50-55℃；菌丝体呈深灰色，但在光照下培养颜色变浅；在显微镜下观察孢子形态为椭圆形，直径可以高达50μm；在没有硫胺素存在的SMA培养基(标准琼脂培养基)上生长，不会产生孢子。
菌株CAU432的18S rDNA测序结果见序列表的序列1。
综合形态特征和测序结果，将菌株CAU432鉴定为米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)。米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432已于2011年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.4967。米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432CGMCC No.4967简称米黑根毛霉CAU432。
实施例2、摇瓶发酵制备β-葡聚糖酶的条件优化
一、发酵培养基中碳源的筛选
本步骤中的发酵培养基的配制方法：碳源10g(0.45-0.9mm粒径范围的粉末)、蛋白胨10g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCl2 0.3g，加水到1L，自然pH。分别采用如下15种碳源：甘蔗皮、玉米苞皮、玉米杆、燕麦、麦麸、甘蔗渣、玉米芯、啤酒酒糟、稻壳、可溶性淀粉、几丁质、高粱杆、白酒酒糟、麸皮和稻草。
1、菌种活化
将保存的米黑根毛霉CAU432在活化培养基平板上进行活化。
2、种子液制备
将活化后的新鲜菌株接种到种子培养基中，50℃恒温空气浴往复式摇床上以200rpm振荡培养24h，得到种子液，种子液的湿重约等于0.1g/mL。
3、摇瓶液体发酵产β-葡聚糖酶
在250mL三角瓶中装入50mL发酵培养基，然后接种步骤2的种子液，接种量为2％(体积百分比)；在50℃恒温空气浴往复式摇床上以200rpm振荡培养72h。取发酵液12000×g冷冻离心10min，取上清液(粗酶液)，进行β-葡聚糖酶酶活测定。
β-葡聚糖酶酶活的具体测定方法：取100μL待测溶液(或其稀释液)，加入到900μL底物溶液(由大麦β-葡聚糖和50mM pH 6.0柠檬酸缓冲液组成；大麦β-葡聚糖的浓度为0.5g/100mL)中，60℃水浴反应10min后加入1mL DNS试剂(将1g 3，5-二硝基水杨酸、1g NaOH、0.2g苯酚溶于蒸馏水并定容至100mL，即为贮存液；使用前在贮存液中加入无水亚硫酸钠，使其浓度为0.05g/100mL)，煮沸15min后加入1mL饱和酒石酸钾钠溶液，冷却后测定540nm吸光度值。用不同浓度的葡萄糖水溶液制作标准曲线。将每分钟生成1μmol葡萄糖所需要的酶量定义为1个酶活性单位(U)。根据540nm吸光度值计算待测溶液的酶活力的公式如下：Y＝(1.0585*x-0.0394)*1000*N/180.16，Y代表酶活性(单位为U)，x代表540nm吸光度值，N代表稀释倍数。
采用各个碳源的培养基得到的粗酶液的β-葡聚糖酶酶活见表1。
表1碳源对米黑根毛霉CAU432固体发酵产β-葡聚糖酶活性的影响
| 碳源种类 | β-葡聚糖酶酶活力(U/mL粗酶液) |
| 甘蔗皮 | 646±35 |
| 玉米苞皮 | 619±27 |
| 玉米杆 | 559±18 |
| 燕麦 | 4055±143 |
| 麦麸 | 1308±63 |
| 甘蔗渣 | 293±12 |
| 玉米芯 | 860±31 |
| 啤酒酒糟 | 1142±43 |
| 稻壳 | 292±27 |
| 可溶性淀粉 | 325±15 |
| 几丁质 | 1±0.2 |
| 高粱杆 | 833±23 |
| 白酒酒糟 | 1664±47 |
| 麸皮 | 1807±66 |
| 稻草 | 418±21 |
以燕麦为碳源时，粗酶液的β-葡聚糖酶酶活最高，可达4055±143U/mL。说明以燕麦为碳源时β-葡聚糖酶产量最高。
二、发酵培养基中氮源的筛选
本步骤中的发酵培养基的配制方法：燕麦(0.18-0.3mm粒径范围的粉末)30g、氮源10g，KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCl2 0.3g，加水到1L，自然pH。分别采用10种氮源：酵母提取物、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨、豆粕粉、蛋白胨、酵母蛋白胨混合物(酵母提取物∶胰蛋白胨＝1∶1；质量比)、尿素、硝酸铵和磷酸氢二铵。
其它所有步骤均同步骤一。
采用各个氮源的培养基得到的粗酶液的β-葡聚糖酶酶活见表2。
表2氮源对米黑根毛霉CAU432摇瓶液体发酵产β-葡聚糖酶活性的影响
| 氮源种类 | β-葡聚糖酶酶活力(U/mL粗酶液) |
| 酵母提取物 | 3081±122 |
| 胰蛋白胨 | 2580±84 |
| 大豆蛋白胨 | 2149±89 |
| 牛肉膏蛋白胨 | 4901±158 |
| 豆粕粉 | 2530±74 |
| 蛋白胨 | 4681±133 |
| 酵母蛋白胨混合物 | 3250±111 |
| 尿素 | 1176±39 |
| 硝酸铵 | 238±10 |
| 磷酸氢二铵 | 4016±163 |
以牛肉膏蛋白胨为氮源时，粗酶液的β-葡聚糖酶酶活最高，可达4901±158U/mL。说明以牛肉膏蛋白胨为氮源时β-葡聚糖酶产量最高。
三、发酵培养时间的筛选
本步骤中的发酵培养基的配制方法：燕麦(0.18-0.3mm粒径范围的粉末)30g、牛肉膏蛋白胨10g，KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCl2 0.3g，加水到1L，pH 5。
1、菌种活化
同步骤一的1。
2、种子液制备
同步骤一的2。
3、摇瓶液体发酵产β-葡聚糖酶
在250mL三角瓶中装入50mL发酵培养基，然后接种步骤2的种子液，接种量为3％(体积百分比)；在50℃恒温空气浴往复式摇床上以200rpm振荡培养一段时间(1、2、3、4、5或6天)；取发酵液10000×g冷冻离心10min，取上清液(粗酶液)，进行β-葡聚糖酶酶活测定(β-葡聚糖酶酶活的具体测定方法同步骤一的3)和蛋白质含量测定。
结果见图1。培养5天的粗酶液的酶活为6300U/mL。结果表明，米黑根毛霉CAU432发酵5天时β-葡聚糖酶产量最高。
实施例3、固体发酵发酵制备β-葡聚糖酶的条件
一、固体发酵培养基中碳源的筛选
1、菌种活化
同实施例2的步骤一的1。
2、种子液制备
同实施例2的步骤一的2。
3、固体发酵产β-葡聚糖酶
基础培养液甲：蛋白胨10g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCl2 0.3g，加水到1L，自然pH。
称取5g碳源(0.18-0.3mm粒径范围的粉末)于250mL三角瓶中，倒入基础培养液甲，得到固体发酵培养基(通过基础培养液甲的加入量调整固体发酵培养基的含水量为80％)，用玻璃棒搅拌均匀，121℃灭菌20min；固体发酵培养基冷却后接种1mL步骤2的种子液，混匀后置于50℃培养箱中静置培养5天，得到固体发酵物(固体发酵物的重量即干基重量)。分别采用8种碳源：高粱秆、玉米秆、白酒酒糟、啤酒酒糟、燕麦、麸皮、甘蔗渣、麦麸。每克固体发酵物加入10mL 50mM pH 6.0柠檬酸缓冲液，室温下200rpm震荡浸提2h，10000×g冷冻离心10min，取上清液(粗酶液)。
将粗酶液行β-葡聚糖酶酶活测定(β-葡聚糖酶酶活的具体测定方法同实施例2的步骤一的3)和蛋白质含量测定。
采用各个碳源的培养基得到的固体发酵物的β-葡聚糖酶酶活见表3。
表3碳源对米黑根毛霉CAU432固体发酵产β-葡聚糖酶活性的影响
| 碳源种类 | β-葡聚糖酶酶活力(U/g干基) |
| 高粱杆 | 5248±193 |
| 玉米杆 | 5013±138 |
| 白酒酒糟 | 2721±84 |
| 啤酒酒糟 | 20760±412 |
| 燕麦 | 24812±467 |
| 麸皮 | 4484±118 |
| 甘蔗渣 | 3838±126 |
| 麦麸 | 10772±239 |
以燕麦为碳源时，固体发酵物的β-葡聚糖酶酶活最高，可达24812±467U/g。说明以燕麦为碳源时β-葡聚糖酶产量最高。
二、固体发酵培养基中初始水分含量的筛选
1、菌种活化
同实施例2的步骤一的1。
2、种子液制备
同实施例2的步骤一的2。
3、固体发酵产β-葡聚糖酶
基础培养液甲的配方同步骤一的3。
称取5g燕麦(0.18-0.3mm粒径范围的粉末)于250mL三角瓶中，倒入基础培养液甲，得到固体发酵培养基(通过基础培养液甲的加入量调整固体发酵培养基的含水量分别为70％、75％、80％、85％和90％)，用玻璃棒搅拌均匀，121℃灭菌20min；固体发酵培养基冷却后分别接种1mL步骤2的种子液，混匀后置于50℃培养箱中静置培养5天，得到固体发酵物。每克固体发酵物加入10mL 50mM pH6.0柠檬酸缓冲液，室温下200rpm震荡浸提2h，10000×g冷冻离心10min，取上清液(粗酶液)。
将粗酶液进行β-葡聚糖酶酶活测定(β-葡聚糖酶酶活的具体测定方法同实施例2的步骤一的3)和蛋白质含量测定。
采用各个初始含水量的培养基得到的固体发酵物的β-葡聚糖酶酶活见表4。
表4初始含水量对米黑根毛霉CAU432固体发酵产β-葡聚糖酶活性的影响
| 初始含水量(％) | β-葡聚糖酶酶活力(U/g干基) |
| 70 | 16628±437 |
| 75 | 25585±680 |
| 80 | 24647±714 |
| 85 | 12121±396 |
| 90 | 6246±217 |
当固体培养液的初始含水量为75％时，固体发酵物的β-葡聚糖酶酶活最高，可达25585±680U/g。
实施例4、发酵罐发酵制备β-葡聚糖酶的条件
本步骤中的发酵培养基的配制方法：燕麦(0.18-0.3mm粒径范围的粉末)20g、牛肉膏蛋白胨10g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCl2 0.3g，加水2.5L，pH 5。
1、菌种活化
同实施例2的步骤一的1。
2、种子液制备
同实施例2的步骤一的2。
3、发酵罐液体发酵生产β-葡聚糖酶
在5L发酵罐(装有2.5L发酵培养基)中接种步骤2的种子液，接种量为2％(体积百分比)；50℃培养，通气量是1.2vvm，搅拌速率是500rpm，发酵周期为72h。发酵过程中定时取发酵液10000×g冷冻离心10min，收集上清液(粗酶液)；将粗酶液进行β-葡聚糖酶酶活测定(β-葡聚糖酶酶活力的具体测定方法同实施例2的步骤一的3)和蛋白质含量测定。
发酵过程中粗酶液的β-葡聚糖酶酶活和蛋白质含量的结果见图2。
米黑根毛霉CAU432发酵50h时产酶最高，粗酶液的酶活可达7800U/mL。
实施例5、β-葡聚糖酶的纯化与酶学性质
一、β-葡聚糖酶的纯化
本步骤中的发酵培养基的配制方法：燕麦(0.18-0.3mm粒径范围的粉末)10g、蛋白胨10g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCl2 0.3g，加水到1L，自然pH。
1、菌种活化
同实施例2的步骤一的1。
2、种子液制备
同实施例2的步骤一的2。
3、摇瓶液体发酵产β-葡聚糖酶
在250mL三角瓶中装入50mL发酵培养基，然后接种步骤2的种子液，接种量为2％(体积百分比)；在50℃恒温空气浴往复式摇床上以200rpm振荡培养96h；取发酵液10000×g冷冻离心10min，取上清液(粗酶液)。
4、硫酸铵沉淀
向粗酶液中缓慢加入40％饱和度的硫酸粉末，冰水浴中搅拌1h，然后10000×g冷冻离心10min，取上清液；向上清液中继续添加硫酸铵粉末达到60％硫酸铵饱和度，冰水浴中搅拌1h，10000×g冷冻离心10min，取沉淀(粗蛋白)；将沉淀用少量20mMpH 7.5磷酸缓冲液溶解后用20mM pH 7.5磷酸缓冲液透析。
5、离子交换层析
(1)将步骤4得到的溶液进行DEAE52弱阴离子交换层析，参数如下：5cm×1.5cm；用0-300mM NaCl水溶液线性梯度洗脱10个柱体积，流速为1.0mL/min，收集具有β-葡聚糖酶酶活组分。
(2)将步骤(1)收集的过柱收集的溶液进行超滤(滤膜选择可截留分子量在10kDa以上蛋白质)，收集蛋白大分子溶于20mM pH 7.0的磷酸缓冲液。
(3)将步骤(2)的溶液进行QSFF强阴离子交换层析，参数如下：10cm×1.5cm；流速为1.0mL/min；首先用0.05-0.15mM NaCl水溶液线性梯度洗脱5个柱体积，去除吸附的杂蛋白；然后用0.15-0.3mM NaCl水溶液线性梯度洗脱8个柱体积，收集具有β-葡聚糖酶酶活组分(将β-葡聚糖酶液)，检测其蛋白浓度为0.97mg/mL。
β-葡聚糖酶的纯化过程中的SDS-PAGE电泳图见图3。纯化得到电泳纯β-葡聚糖酶，分子量为35.4kDa。
二、β-葡聚糖酶的酶学性质
用于步骤1和步骤2的各种缓冲液如下：柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、CHES缓冲液。
1、β-葡聚糖酶最适pH的测定
将β-葡聚糖酶液的稀释液(分别采用不同缓冲液进行稀释)进行β-葡聚糖酶酶活测定和蛋白质含量测定。β-葡聚糖酶酶活力的具体测定方法同实施例2的步骤一的3，差别仅在于采用50℃的反应温度，且采用与制备稀释液相同的缓冲液配制底物溶液。
比活力(U/mg)＝酶活(U/mL)÷蛋白浓度(mg/mL)。
将采用50mM pH 6.0柠檬酸缓冲液时将β-葡聚糖酶液的酶活作为100％，采用其它缓冲液时β-葡聚糖酶液的相对酶活见图4。
2、β-葡聚糖酶pH稳定性的测定
将β-葡聚糖酶液用不同pH值的各种不同缓冲液稀释，50℃水浴锅中处理30min，迅速置于冰水中冷却30min，然后进行β-葡聚糖酶酶活测定和蛋白质含量测定。β-葡聚糖酶酶活力的具体测定方法同实施例2的步骤一的3，差别仅在于采用50℃的反应温度。
将采用50mM pH 6.0柠檬酸缓冲液且没有进行水浴和冷却处理时将β-葡聚糖酶液的酶活作为100％，各种处理后β-葡聚糖酶液的相对酶活见图5。在pH 5-6.5之间的缓冲液中处理30min后，60℃下测定酶活力能保持在80％以上。
3、β-葡聚糖酶最适反应温度测定
将β-葡聚糖酶液的稀释液(用50mM pH 6.0柠檬酸缓冲液进行稀释)进行β-葡聚糖酶酶活测定(β-葡聚糖酶酶活力的具体测定方法同实施例2的步骤一的3，差别仅在于采用40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的反应温度)和蛋白质含量测定。
将采用60℃时β-葡聚糖酶液的酶活作为100％，其它缓冲液下β-葡聚糖酶液的相对酶活见图6。
4、β-葡聚糖酶温度稳定性测定
将β-葡聚糖酶液的稀释液(用50mM pH 6.0柠檬酸缓冲液进行稀释)在不同温度(40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃)下孵育30min，迅速置于冰水中冷却30min，然后作为各个待测溶液，进行β-葡聚糖酶酶活测定(β-葡聚糖酶酶活力的具体测定方法同实施例2的步骤一的3，差别仅在于采用40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃)和蛋白质含量测定。
将没有进行孵育和冷却处理的β-葡聚糖酶液的酶活作为100％，其它处理后β-葡聚糖酶液的相对酶活见图7。该酶具有很好的温度稳定性，在60℃下处理30min后酶活力基本没有变化，70℃下处理30min后酶活力仍能保持80％以上，且100℃下处理30min后酶活力仍能保持40％以上。
实施例6、固体发酵制备凝乳酶的条件优化
一、固体发酵中氮源种类对产凝乳酶的影响
1、菌种活化
同实施例2的步骤一的1。
2、种子液制备
同实施例2的步骤一的2。
3、固体发酵产凝乳酶
基础培养液乙：CaCl2，0.3g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g、吐温-80 0.34g，加水至1L，pH 7.0。
将麸皮(0.18-0.3mm粒径范围的粉末)5g、基础培养液乙5mL、氮源1.0g，用玻璃棒搅拌均匀，121℃灭菌20min，即为固体发酵培养基；固体发酵培养基冷却后接种1mL步骤2的种子液，混匀后置于37℃培养箱中静置培养3天，得到固体发酵物。分别采用7种氮源：黄豆粉、脱脂奶粉、酵母提取物、大豆蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、尿素。每克固体发酵物加入10mL去离子水，37℃下200rpm震荡浸提2h，纱布过滤，10000rpm冷冻离心10min，取上清液(粗酶液)。将粗酶液进行凝乳酶酶活测定。
凝乳酶酶活测定方法：将1mL底物溶液(由脱脂奶粉、CaCl2和50mM pH5.3醋酸-醋酸钠缓冲液组成，脱脂奶粉的质量百分含量为8.4％，CaCl2的浓度为10mM)37℃预热5min，然后加入0.1mL待测溶液，准确记录从加入待测溶液到乳凝固的时间(s)计算酶活。凝乳酶的活力单位定义为：40min凝固1mL底物溶液所需的酶量。
采用各个氮源的培养基得到的固体发酵物的凝乳酶酶活见表5。
表5氮源对米黑根毛霉CAU432固体发酵产凝乳酶酶活性的影响
| 氮源种类 | 凝乳酶活(U/g) |
| 对照(无氮源) | 60000±593 |
| 脱脂奶粉 | 67500±1474 |
| 酵母提取物 | 48000±1895 |
| 黄豆粉 | 85714±2951 |
| 大豆蛋白胨 | 53553±883 |
| 硫酸铵 | 34105±1086 |
| 硝酸铵 | 49090±1560 |
| 尿素 | 23736±770 |
当以黄豆粉作为氮源时粗酶液的凝乳酶酶活最高，可达85714±2951U/g干基。
二、固体发酵培养基中初始水分含量对产凝乳酶的影响
1、菌种活化
同实施例2的步骤一的1。
2、种子液制备
同实施例2的步骤一的2。
3、固体发酵产凝乳酶
将麸皮5g、基础培养液乙和氮源1.0g，用玻璃棒搅拌均匀，121℃灭菌20min，即为固体发酵培养基(通过基础培养液乙的加入量调整固体发酵培养基的含水量分别为33.3％、50％、60％、66.7％、71.4％)；固体发酵培养基冷却后分别接种1mL步骤2的种子液，混匀后置于37℃培养箱中静置培养3天，得到固体发酵物。每克固体发酵物加入10mL去离子水，37℃下200rpm震荡浸提2h，纱布过滤，10000rpm冷冻离心10min，取上清液(粗酶液)。将粗酶液进行凝乳酶酶活测定(方法同步骤一的3)。
采用各个初始含水量的培养基得到的固体发酵物的凝乳酶酶活见表6。
表6固液比对米黑根毛霉产凝乳酶的影响
| 初始含水量(％) | 凝乳酶活(U/g) |
| 33.3 | 16000±793 |
| 50 | 47058±1049 |
| 60 | 32876±923 |
| 66.7 | 34285±830 |
| 71.4 | 30000±1267 |
当初始含水量为50％时菌株粗酶液的凝乳酶酶活最高，为47058±1049U/g干基。
三、固体发酵中发酵培养时间对产凝乳酶的影响
1、菌种活化
同实施例2的步骤一的1。
2、种子液制备
同实施例2的步骤一的2。
3、固体发酵产凝乳酶
将麸皮(0.18-0.3mm粒径范围的粉末)5g、基础培养液乙5mL、黄豆粉1.0g，用玻璃棒搅拌均匀，121℃灭菌20min，即为固体发酵培养基；固体发酵培养基冷却后接种1mL步骤2的种子液，混匀后置于37℃培养箱中静置培养(1d、2d、3d、4d、5d或6d)，得到固体发酵物。每克固体发酵物加入10mL去离子水，37℃下200rpm震荡浸提2h，纱布过滤，10000rpm冷冻离心10min，取上清液(粗酶液)。将粗酶液进行凝乳酶酶活测定(方法同步骤一的3)。
结果见图8。
第2天的产酶水平达到105000U/g干基，比发酵第1天明显增加。随着发酵天数继续增加，凝乳酶活无明显变化。
实施例7、摇瓶液体发酵制备凝乳酶的条件
一、发酵培养基中碳源的筛选
本步骤中的发酵培养基的配制方法：碳源(0.45-0.9mm粒径范围的粉末)、大豆蛋白胨10g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCl2 0.3g，加水到1L，pH 6.0。分别采用如下3种碳源：葡萄糖(设置一种加入量，10g)、麸皮(设置一种加入量，10g)和燕麦(设置五种加入量，10g、20g、30g、40g、50g)。
1、菌种活化
同实施例2的步骤一的1。
2、种子液制备
同实施例2的步骤一的2。
3、摇瓶液体发酵产凝乳酶
在250mL三角瓶中装入30mL发酵培养基，然后接种1mL步骤2的种子液；在37℃恒温空气浴往复式摇床上以200rpm振荡培养48h。取发酵液10000rpm离心10min，取上清液(粗酶液)，进行凝乳酶酶活测定(方法同实施例6的步骤一的3)。
碳源对CAU432产凝乳酶活性的影响见图9。以燕麦为碳源且每升培养基中含量为20g时粗酶液的凝乳酶酶活最高，可达3333U/mL。
二、发酵培养基中氮源的筛选
本步骤中的发酵培养基的配制方法：燕麦20g(0.45-0.9mm粒径范围的粉末)、氮源10g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCl2 0.3g，加水到1L，pH 6.0。分别采用如下6种氮源：脱脂奶粉、大豆蛋白胨、硫酸铵、尿素、黄豆粉和硝酸铵。
1、菌种活化
同实施例2的步骤一的1。
2、种子液制备
同实施例2的步骤一的2。
3、摇瓶液体发酵产凝乳酶
在250mL三角瓶中装入30mL发酵培养基，然后接种1mL步骤2的种子液；在37℃恒温空气浴往复式摇床上以200rpm振荡培养48h。取发酵液10000rpm离心10min，取上清液(粗酶液)，进行凝乳酶酶活测定(方法同实施例6的步骤一的3)。
氮源对CAU432产凝乳酶活性的影响见图10。以黄豆粉为氮源时粗酶液的凝乳酶酶活最高，可达4138U/mL。
三、发酵培养时间的筛选
本步骤中的发酵培养基的配制方法：燕麦20g(0.45-0.9mm粒径范围的粉末)、黄豆粉10g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCl2 0.3g，加水到1L，pH 6.0。
1、菌种活化
同实施例2的步骤一的1。
2、种子液制备
同实施例2的步骤一的2。
3、摇瓶液体发酵产凝乳酶
在250mL三角瓶中装入30mL发酵培养基，然后接种1mL步骤2的种子液；在37℃恒温空气浴往复式摇床上以200rpm振荡培养。分别培养1、2、3、4、5、6天(d)时取发酵液10000rpm离心10min，取上清液(粗酶液)，进行凝乳酶酶活测定(方法同实施例6的步骤一的3)。
培养时间对CAU432产凝乳酶活性的影响如图11所示。发酵5d时凝乳酶产量最高，可达5450U/mL。
Claims (10)
1.米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432，其保藏编号为CGMCC No.4967。
2.用于培养权利要求1所述米黑根毛霉的培养基，由碳源、氮源、无机盐和水组成；所述碳源为如下物质中的至少一种：甘蔗皮、玉米苞皮、玉米杆、燕麦、麦麸、甘蔗渣、玉米芯、啤酒酒糟、稻壳、可溶性淀粉、几丁质、高粱杆、白酒酒糟、麸皮、稻草和葡萄糖；所述氮源为如下物质中的至少一种：酵母提取物、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨、豆粕粉、黄豆粉、脱脂奶粉、蛋白胨、尿素、磷酸氢二铵、硫酸铵、酵母提取物和胰蛋白胨等质量混合得到的酵母蛋白胨混合物、硝酸铵和大豆蛋白胨；所述无机盐为如下物质中的至少一种：KH2PO4、MgSO4和CaCl2。
3.如权利要求2所述的培养基，其特征在于：所述培养基由所述碳源、所述氮源、KH2PO4、MgSO4、CaCl2和水组成；
所述培养基优选为如下(a)至(d)中任一所述的培养基：
(a)将所述碳源10g-50g、氮源10g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g和CaCl2 0.3g溶于水并用水定容至1L得到的培养基；
(b)将所述碳源和基础培养液甲混合得到的培养基；所述基础培养液甲的制备方法为：将所述氮源10g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g和CaCl2 0.3g溶于水并用水定容至1L得到的培养基；所述培养基的初始含水量为70-90％；
(c)将所述碳源、所述氮源和基础培养液乙混合得到的培养基；所述基础培养液乙的制备方法为：将CaCl2 0.3g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g和吐温-80 0.34g溶于水并用水定容至1L；所述培养基的初始含水量为30-75％；所述碳源和所述氮源的质量比为5∶1；
(d)将所述碳源10g-50g、所述氮源10g、KH2PO4 5g、MgSO4·7H2O 0.3g和CaCl20.3g溶于水并用水定容至2.5L得到的培养基。
4.一种制备β-葡聚糖酶和/或凝乳酶的方法，是采用权利要求2或3所述培养基发酵权利要求1所述米黑根毛霉，得到β-葡聚糖酶和/或凝乳酶。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法为如下(1)至(5)中的任意一种：
(1)采用权利要求3的(a)所述培养基50℃振荡发酵权利要求1所述米黑根毛霉，得到β-葡聚糖酶；所述发酵的时间为1天以上，优选为1-6天，最优选为3-5天；
(2)采用权利要求3的(b)所述培养基50℃静置发酵权利要求1所述米黑根毛霉，得到β-葡聚糖酶；所述发酵的时间为1天以上，优选为1-6天，最优选为3-5天；
(3)采用权利要求3的(c)所述培养基37℃静置发酵权利要求1所述米黑根毛霉，得到凝乳酶；所述发酵的时间为1天以上，优选为1-6天，最优选为2天；
(4)采用权利要求3的(a)所述培养基37℃振荡发酵所述米黑根毛霉CAU432，得到凝乳酶；所述发酵的时间为1天以上，优选为1-6天，最优选为3-5天；
(5)在发酵罐中采用权利要求2的(d)所述培养基发酵权利要求1所述米黑根毛霉，得到β-葡聚糖酶；所述发酵的条件为：40-55℃、通气量为1-2vvm、搅拌速率为300-600rpm、发酵时间为10h以上。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述方法(1)和/或所述方法(5)还包括如下步骤：将所述发酵得到的发酵液10000×g冷冻离心10min，取上清液，即为含有β-葡聚糖酶的溶液；
所述方法(2)还包括如下步骤：将所述发酵得到的固体发酵物加入50mM pH 6.0柠檬酸缓冲液，室温下200rpm震荡浸提2h，10000×g冷冻离心10min，取上清液，即为含有β-葡聚糖酶的溶液；
所述方法(3)还包括如下步骤：将所述发酵得到的固体发酵物加入去离子水，37℃、200rpm震荡浸提2h，10000rpm冷冻离心10min，取上清液，即为含有凝乳酶的溶液；
所述方法(4)还包括如下步骤：将所述发酵得到的发酵液10000rpm冷冻离心10min，取上清液，即为含有凝乳酶的溶液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法(1)和/或所述方法(2)和/或所述方法(5)还包括如下步骤：将所述含有β-葡聚糖酶的溶液依次进行硫酸铵沉淀、DEAE52弱阴离子交换层析和QSFF强阴离子交换层析，得到纯化后的β-葡聚糖酶。
8.权利要求4至7中任一所述方法得到的β-葡聚糖酶或凝乳酶。
9.权利要求8所述β-葡聚糖酶作为β-葡聚糖酶的应用。
10.权利要求8所述凝乳酶作为凝乳酶的应用。
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| 《Appl Microbiol Biotechnol.》 20070623 Boyce A, Walsh G. Production, purification and application-relevant characterisation of an endo-1,3(4)-beta-glucanase from Rhizomucor miehei 摘要、第836－839页 10、11 第76卷, 第4期 * |
| BOYCE A, WALSH G.: "Production, purification and application-relevant characterisation of an endo-1,3(4)-β-glucanase from Rhizomucor miehei", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL.》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107338234A (zh) * | 2017-05-26 | 2017-11-10 | 中国农业大学 | 一种新型米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的生产方法及其应用 |
| CN107338234B (zh) * | 2017-05-26 | 2020-08-18 | 中国农业大学 | 一种新型米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的生产方法及其应用 |
| CN109207376A (zh) * | 2018-10-11 | 2019-01-15 | 山东隆科特酶制剂有限公司 | 一株高产凝乳酶的微小毛霉菌株及生产凝乳酶的方法 |
| CN109306346A (zh) * | 2018-10-11 | 2019-02-05 | 山东隆科特酶制剂有限公司 | 一种高产凝乳酶的方法及其所产凝乳酶 |
| CN109306346B (zh) * | 2018-10-11 | 2021-09-07 | 山东隆科特酶制剂有限公司 | 一种高产凝乳酶的方法及其所产凝乳酶 |
| CN109207376B (zh) * | 2018-10-11 | 2021-09-07 | 山东隆科特酶制剂有限公司 | 一株高产凝乳酶的微小毛霉菌株及生产凝乳酶的方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103045485B (zh) | 2015-04-22 |
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