CN103667075B - 一种降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株。该降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株，命名为扩展青霉菌Penicillium？expansum？N53，本发明所述扩展青霉（Penicillium？expansum）N53可将白酒酒糟中的纤维素降解成葡萄糖，且具有纤维素酶酶活高，纤维素转化生成葡萄糖的转化率高等特点，极大程度上提高了白酒酒糟的利用率，对于后续生成蛋白饲料提供了保证，是一株极具研究开发价值的白酒酒糟纤维素分解菌株。利用扩展青霉（Penicillium？expansum）发酵降解白酒酒糟纤维素的研究较少。
Description
（一）技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株。
（二）背景技术
白酒酒糟是白酒生产中的副产物。由于白酒酒糟呈酸性，且含有未能完全利用的淀粉、蛋白质及各种氨基酸、维生素、矿物元素等营养成分，是微生物生长的良好基质，若未能及时处理，会对酒糟存放地周边带来严重的污染，不符合我国大力建设资源节约型、环境友好型社会的发展方针。近年来，白酒产业的日趋发展，仅2012年1-11月，全国白酒产量高达1023.32万千升，比2011年同期增长了112.02万千升。因此，白酒酒糟的综合利用对于我国构建节约型社会和环境保护方面具有十分重要的意义。
据统计，每100g白酒糟中就含有粗蛋白10-16g、粗纤维18-24g、粗脂肪3.83g、钙0.21g、磷0.38g、维生素A625mg、维生素B27.9mg、维生素C37.5mg、维生素PP419.92mg、烟酰胺182.69mg等[1]。纤维素是由葡萄糖分子以β-1，4糖苷键组成的大分子多糖，由于含有许多高能氢键，因此较难被一般微生物分解、利用。半纤维素是由几种不同类型的单糖构成的异质多聚体，单糖聚合体间分别以共价键、氢键、醚键和酯键连接，他们与伸展蛋白、其他结构蛋白、壁酶、纤维素和果胶等构成具有一定硬度和弹性的细胞壁，因而呈现稳定的化学结构。
目前，国内对白酒酒糟的应用研究主要是利用酒糟生产饲料蛋白、直接烘干作为生产饲料[2]、提取植酸和植酸钙及复合氨基酸等物质[3,4]、制取甘油[3]、用于原酒再生产、制备糖用活性炭、酿醋、厌氧发酵回收沼气、培养食用菌[3]等方面。但从解决酒糟的彻底性角度考虑，目前只有直接或发酵后用作饲料、农肥方面可以从根本上解决酒糟废弃物的污染问题[1]。随着当今社会经济的发展，人们对于生态环境更加注重，因而在白酒生产中更加注重其对生态环境的影响，最大限度地利用资源，并尽可能地减少对环境的污染，把生产过程中各阶段的副产物及废弃物资源化利用，从而保护环境，达到人与自然环境协调发展。
由于白酒酒糟中粗纤维含量较高，直接利用酒糟生产菌体蛋白具有产值较低、利用不完全等缺点。因此选择一株能够分解利用白酒酒糟中的纤维素和半纤维素，将其转化为较易被微生物吸收利用的葡萄糖，对于利用白酒酒糟生产菌体蛋白具有显著地影响，能够极大程度上提高白酒酒糟的利用率。发酵后的饲料营养更均衡，含有丰富的维生素、多种微生物酶、生物活性物质及成长调节剂，动物更易吸收利用，解决了目前配合饲料中营养水平低、吸收效率不高的问题。目前，能够降解纤维素的菌株有很多，主要为绿色木霉、康宁木霉及黑曲霉[5]等几个菌株。然而现在这些已研究或应用的纤维素分解菌株仍存在着酶活活性不稳定、纤维素降解能力差、产酶成本高等问题，难以应用在白酒酒糟的纤维素降解中。本专利利用筛选得到的一株扩展青霉菌（Penicilliumexpansum）菌株分解利用白酒酒糟，产纤维素酶的酶活较高，性能稳定，是一种具有应用潜力的白酒酒糟稻壳纤维素降解菌株。
（三）发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株，该菌株可有效地将纤维素降解成葡萄糖，其纤维素酶的酶活较高，性能稳定，是一株极具研究开发价值的白酒酒糟纤维素降解菌株。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株，其特殊之处在于：命名为扩展青霉菌PenicilliumexpansumN53，该菌株的18SrDNA序列如下：
tctagtataagcactttatactgtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatcgttt60
atttgatagtaccttactacatggatacctgtggtaattctagagctaatacatgctaaa120
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ttagagaa1688，
上述18SrDNA序列全长1688个核苷酸。
本发明所述产降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌（Penicilliumexpansum）N53是一株通过自然选育获得的扩展青霉菌株，菌株已于2013年3月5日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCCN0.7275。
上述降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌N53，其生物学特征（6）是：在固体培养（分离培养基）平板上30℃培养96h后观察，菌落圆形铺展，向四周成辐射状，中间成绒状，孢子成暗绿色，有白色的边缘，最后变为褐色。光学显微镜下观察菌体分生孢子梗有隔膜且较长，比较光滑，顶端排列成帚状的分枝，分枝1-2次，顶层以切离法生成分生孢子，分生孢子串呈不分枝的链状，单个孢子成椭圆形，光滑无色。
对本发明的菌株CGMCCNO.7275测定18SrDNA的基因序列的结果显示，该菌属于扩展青霉，测序核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
通过使用美国生物工程信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI）BLAST程序比对，发现本发明的CGMCCNO.7275菌株18SrDNA的基因序列与NCBI注册的扩展青梅（Penicilliumexpansum）HDJZ-ZWM-17（GU227344）18SrDNA的基因序列具有高度同源性，并结合生理生化实验，初步鉴定CGMCCNO.7275菌株是一株扩展青梅（Penicilliumexpansum）。
上述用于菌体形态观察的固体培养基组成：
CMC-Na10g/L、K2HPO4·3H2O2g/L、(NH4)2SO44g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、FeSO4·7H2O0.15g/L、蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、琼脂20g/L，pH自然。
本发明所述的降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉（Penicilliumexpansum）菌种选育的基本方法是：
使用筛选培养基培养都得到单菌落，加入刚果红溶液染色，再经过NaCl溶液脱色筛选得到透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株，再将其接入到液体产酶培养基中，选取纤维素酶酶活较高的菌株，经过多次分离纯化，获得扩展青霉N53菌株（CGMCCNO.7275），其中刚果红溶液染色2h，NaCl溶液中NaCl的质量分数为1%，脱色1h。
本发明所述的降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉（Penicilliumexpansum）在白酒酒糟纤维素降解中的应用。
利用扩展青霉（Penicilliumexpansum）降解白酒酒糟纤维素的方法如下：
摇瓶发酵：取30℃培养3-4天的新鲜斜面倒入无菌水刮取孢子制备孢子悬液，接种发酵培养基，35℃摇瓶发酵72小时，发酵结束测定纤维素酶酶活及纤维素含量，纤维素酶活最高可达10-14u/ml，纤维素转化率为60-80％。
固体发酵：30℃培养3-4天的新鲜斜面倒入无菌水刮取孢子制备孢子悬液，按3%的接种量接入到预先准备好的发酵培养基中，30℃静置培养48h，发酵结束测定发酵培养基中的纤维素酶酶活和纤维素含量，纤维素酶活最高可达11-15u/ml，纤维素转化率为65%-85%。
上述筛选用平板培养基组成为：CMC-Na10g/L、K2HPO4·3H2O2g/L、(NH4)2SO44g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、FeSO4·7H2O0.15g/L、蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、琼脂20g/L，pH自然；
上述斜面培养基组成为：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，pH值自然；
上述发酵培养基的组成为：白酒酒糟10-90g/L、麸皮10-90g/L（两者比例从1：9至9：1均可）、豆粕5-40g/L、(NH4)2SO40-20g/L、KH2PO40-4g/L、MgSO4·7H2O0-1.5g/L、GaCl2·2H2O0.05-1g/L、MnSO4·H2O0-0.4g/L、ZnSO4·7H2O0-0.2g/L，pH4.0-8.0。
上述固体发酵培养基的组成为：白酒酒糟与麸皮的比例为7：3、料液比为1：0.8，其中营养液中豆粕5-40g/L、(NH4)2SO40-20g/L、KH2PO40-4g/L、MgSO4·7H2O0-1.5g/L、GaCl2·2H2O0.05-1g/L、MnSO4·H2O0-0.4g/L、ZnSO4·7H2O0-0.2g/L，pH4.0-8.0。
上述纤维素酶活按下述方法测定：
使用DNS闭塞法测定。测定原理是纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖，而寡糖和单糖能在沸水浴条件下与DNS试剂发生显色反应，反应颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，其又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。
上述纤维素含量按下述方法测定：
使用硫酸蒽酮比色法测定。测定原理是纤维素在酸性条件下加热水解成葡萄糖，然后在浓硫酸作用下，单糖脱水生成糠醛类化合物，利用蒽酮试剂与糠醛类化合物的蓝绿色反应即可进行比色测定。
上述纤维素转化率测定按下述方法测定：
纤维素转化率（%）=[初始培养基中纤维素含量（g/L)-发酵后培养基中纤维素含量（g/L)]/初始培养基中纤维素含量(g/L）
由于白酒酒糟中粗纤维含量较高，因而对其中的半纤维素进行酸解，提取具有较高经济价值的木糖，而后再将提取木糖后的白酒酒糟进行纤维素降解，使降解后的白酒酒糟生产的蛋白饲料营养更加全面、充足，并实现白酒酒糟的全面利用。
本发明所述扩展青霉（Penicilliumexpansum）N53可将白酒酒糟中的纤维素降解成葡萄糖，且具有纤维素酶酶活高，纤维素转化生成葡萄糖的转化率高等特点，极大程度上提高了白酒酒糟的利用率，对于后续生成蛋白饲料提供了保证，是一株极具研究开发价值的白酒酒糟纤维素分解菌株。利用扩展青霉（Penicilliumexpansum）发酵降解白酒酒糟纤维素的研究较少。
（四）附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
本发明提供的扩展青霉菌株菌（Penicilliumexpansum）N53，已于2013年3月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，邮政编码：100080，其保藏编号为CGMCCN0.7275。
图1扩展青霉菌（Penicilliumexpansum）N53平板透明圈；
图2扩张青霉菌（Penicilliumexpansum）N53菌落形态图；
图3扩张青霉菌（Penicilliumexpansum）N53光学显微镜下分生孢子梗；
图4扩张青霉菌（Penicilliumexpansum）N53构建系统发育树。
（五）具体实施方式
实施例1降解白酒酒糟纤维素扩展青霉菌株的筛选
白酒酒糟及土样中的微生物经富集培养后，梯度稀释至适当浓度涂布到筛选培养基中，30℃培养3-4天，挑取单菌落转接至斜面培养基中30℃培养3-4天，然后划线到筛选培养基中30℃培养，待长出单菌落后加入其质量分数1%的刚果红溶液染色2h，再经质量分数为1%NaCl溶液脱色1h，观察有无透明圈的产生，并记录透明圈直径及菌落直径的大小，如图1。选取透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株进行复筛。将初筛分离得到的菌株接种到液体产酶培养基中，30℃、180r/min培养3天后，测定各菌株发酵液的纤维素酶酶活，选取酶活较高的菌株。将测定出的纤维素酶酶活较高的菌株以一株接三瓶的方式接入发酵培养基中，30℃、180r/min培养3天后，测定各菌株纤维素酶的酶活，最终筛选出一株酶活较高且稳定的菌株，命名为扩展青霉（Penicilliumexpansum）N53。
上述菌株扩展青霉（Penicilliumexpansum）N53，已于2013年3月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，邮政编码：100080，其保藏编号为CGMCCN0.7275。
上述富集培养基组成为：CMC-Na10g/L、K2HPO4·3H2O1g/L、Na2CO35g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、FeSO4·7H2O0.15g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L，pH自然；
上述平板分离培养基组成为：CMC-Na10g/L、K2HPO4·3H2O2g/L、(NH4)2SO44g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、FeSO4·7H2O0.15g/L、蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、琼脂20g/L，pH自然；
上述斜面培养基组成为：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，pH自然。
上述摇瓶发酵培养基组成为：白酒酒糟10-90g/L、麸皮10-90g/L（两者比例从1：9至9：1均可）、豆粕5-40g/L、(NH4)2SO40-20g/L、KH2PO40-4g/L、MgSO4·7H2O0-1.5g/L、GaCl2·2H2O0.05-1g/L、MnSO4·H2O0-0.4g/L、ZnSO4·7H2O0-0.2g/L，pH4.0-8.0。
上述降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌N53，其生物学特征（6）是：在固体培养（分离培养基）平板上30℃培养96h后观察，菌落圆形铺展，向四周成辐射状，中间成绒状，孢子成暗绿色，有白色的边缘，最后变为褐色，如图2所示。光学显微镜下观察菌体分生孢子梗有隔膜且较长，比较光滑，顶端排列成帚状的分枝，分枝1-2次，顶层以切离法生成分生孢子，分生孢子串呈不分枝的链状，单个孢子成椭圆形，光滑无色，如图3所示。
上述用于菌体形态观察的固体培养基组成：
CMC-Na10g/L、K2HPO4·3H2O2g/L、(NH4)2SO44g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、FeSO4·7H2O0.15g/L、蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、琼脂20g/L，pH自然。
实施例2扩展青霉（Penicilliumexpansum）CGMCCNO.727518SrDNA测序
将实施例1选育得到的白酒酒糟纤维素降解菌株N53即CGMCCNO.7275菌株委托济南力戈科技有限公司进行18SrDNA测序。
实验方法是：挑取斜面培养物于700μl65℃预热的FPCBSolution和7μlβ-巯基乙醇中，65℃水浴后离心取上清液作为模板，使用UNIQ-10GenomicDNAPrepsKit，以NS1、NS6为引物，扩增目的片段。取5μl进行琼脂糖凝胶电泳，使用UNIQ-10SpinColumnDNAGelExtractionKit切胶回收目的片断，以SeqForward、SeqReverseSeqInternal为引物对上述回收产物进行DNA测序。
测序结果：扩展青霉（Penicilliumexpansum）CGMCCNO.727518SrDNA测序核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
通过使用美国生物工程信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation,NcBI）BLASTN程序比对，发现CGMCCNO.7275菌株18SrDNA序列与NCBI注册的扩展青霉（Penicilliumexpansum）HDJZ-ZWM-1718SrDNA序列具有高度同源性，结合菌落形态及镜检观察，如图2及图3，说明CGMCCNO.7275菌株是一株扩展青霉（Penicilliumexpansum）。
扩展青霉（Penicilliumexpansum）N53序列表：
SEQIDNO.1
SEQUENCELISTING
<110>山东省食品发酵工业研究设计院
<120>一种降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株
<130>2012-11-15
<160>1
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>1688
<212>DNA
<213>扩展青霉（Penicilliumexpansum）
<400>1
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实施例3扩展青霉（Penicilliumexpansum）CGMCCNO.7275菌株的应用
将扩展青霉（Penicilliumexpansum）CGMCCNO.7275菌株移接斜面活化；
按上述斜面培养基的组成配置斜面培养基，划线30℃3-4天后，倒入无菌水刮取孢子制备孢子悬液。按白酒酒糟10-90g/L、麸皮10-90g/L（两者比例从1：9至9：1均可）、豆粕5-40g/L、(NH4)2SO40-20g/L、KH2PO40-4g/L、MgSO4·7H2O0-1.5g/L、GaCl2·2H2O0.05-1g/L、MnSO4·H2O0-0.4g/L、ZnSO4·7H2O0-0.2g/L，pH4.0-8.0培养基的组成配制发酵培养基，初始纤维素含量为248g/L（根据前面麸皮及酒糟的含量适当变化），250ml三角瓶装液量为30ml，121℃蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温，接种孢子悬液液1ml，置旋转转速为150-220r/min、旋转半径为40mm摇床上，25-37℃培养64-72小时结束发酵，发酵液以4000r/min离心10分钟，取上清液测定纤维素酶酶活为10-14u/ml，沉淀测定纤维素含量为57g/L，纤维素转化率为60-80%。
或者：
按上述斜面培养基的组成配置斜面培养基，划线30℃3-4天后，倒入无菌水刮取孢子制备孢子悬液。按白酒酒糟与麸皮的比例为7：3、料液比为1：0.8，其中营养液中豆粕5-40g/L、(NH4)2SO40-20g/L、KH2PO40-4g/L、MgSO4·7H2O0-1.5g/L、GaCl2·2H2O0.05-1g/L、MnSO4·H2O0-0.4g/L、ZnSO4·7H2O0-0.2g/L，pH4.0-8.0上述固体发酵培养基的组成配制发酵培养基，初始纤维素质量分数为21.7%，121℃蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温，按3%的接种量接入到发酵培养基中，25-37℃静置培养36-48h，发酵结束测定发酵培养基中的纤维素酶酶活力和纤维素含量，纤维素酶活最高可达11-15u/ml，纤维素质量分数为3.23%，纤维素转化率为65-85%。
上述纤维素酶活按下述方法测定：
使用DNS闭塞法测定。测定原理是纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖，而寡糖和单糖能在沸水浴条件下与DNS试剂发生显色反应，反应颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，其又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。
上述纤维素含量按下述方法测定：
使用硫酸蒽酮比色法测定。测定原理是纤维素在酸性条件下加热水解成葡萄糖，然后在浓硫酸作用下，单糖脱水生成糠醛类化合物，利用蒽酮试剂与糠醛类化合物的蓝绿色反应即可进行比色测定。
上述纤维素转化率测定按下述方法测定：
纤维素转化率（%）=[初始培养基中纤维素含量（g/L)-发酵后培养基中纤维素含量（g/L)]/初始培养基中纤维素含量(g/L）。
参考文献：
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SEQIDNO.1
SEQUENCELISTING
<110>山东省食品发酵工业研究设计院
<120>一种降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株
<130>2012-11-15
<160>1
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>1688
<212>DNA
<213>扩展青霉（Penicilliumexpansum）
<400>1
tctagtataagcactttatactgtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatcgttt60
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ttgctcgaatacattagcatggaataatagaataggacgtgcggttctattttgttggtt780
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tcattaatcagggaacgaaagttaggggatcgaagacgatcagataccgtcgtagtctta960
accataaactatgccgactagggatcggacgggattctatgatgacccgttcggcacctt1020
acgagaaatcaaagtttttgggttctggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaag1080
aaattgacggaagggcaccacaaggcgtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggg1140
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ttggatggtggtgcatggccgttcttagttggtggagtgatttgtctgcttaattgcgat1260
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actggctcaggagggttggcaacgaccccccagagccggaaagttggtcaaactcggtca1680
ttagagaa1688
Claims (1)
1.一种降解白酒酒糟纤维素的扩展青霉菌株，其特征在于：命名为扩展青霉菌PenicilliumexpansumN53，保藏号为CGMCCN0.7275，该菌株的18SrDNA序列如下：
tctagtataagcactttatactgtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatcgttt60
atttgatagtaccttactacatggatacctgtggtaattctagagctaatacatgctaaa120
aaccccgacttcaggaaggggtgtatttattagataaaaaaccaacgcccttcggggctc180
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actggctcaggagggttggcaacgaccccccagagccggaaagttggtcaaactcggtca1680
ttagagaa1688，
上述18SrDNA序列全长1688个核苷酸。
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