CN102986536B - 一种毛柄金钱菌菌株及制备方法 - Google Patents

一种毛柄金钱菌菌株及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种毛柄金钱菌菌株培养基及菌种制备方法。本发明的菌株Flammulina velutipes KML‑19已于2012年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.6704。利用该菌株制备的液体及固体优良菌种，应用于毛柄金钱菌的促繁有着显著的社会、经济效益和广阔的应用前景。

Description

一种毛柄金钱菌菌株及制备方法
技术领域
本发明属微生物技术领域，具体涉及一种毛柄金钱菌菌株培养基及菌种制备方法。
背景技术
毛柄金钱菌Flammulina velutipes别名又称毛柄小火菇、构菌、朴菇、冬菇、朴菰、冻菌、金菇、智力菇等，属伞菌目白蘑科金针菇属。毛柄金钱菌营养丰富，清香扑鼻。其菌盖小巧细腻，黄褐色或淡黄色或白嫩。不仅味道鲜美，而且营养丰富，是拌凉菜和火锅食品的原料之一。
在毛柄金钱菌栽培技术中，优良菌种的获得是关键技术环节。毛柄金钱菌菌株的获得通常是利用子实体或孢子进行分离、纯化，直接应用于毛柄金钱菌的栽培或菌丝体生产。现有技术的不足在于其生物学特性目前仍处于试验研究阶段，生物转化率较低，而且还要用熟料栽培，生产工艺及技术要素要求较高，因而制约了毛柄金钱菌商品经济的发展。另外只能根据菌丝形态及分离物来初步确定是否为毛柄金钱菌纯培养物；生产的菌种一般用固体菌种。目前在国内采用液体菌种进行毛柄金钱菌资源的保护应用不广泛。
发明内容
本发明的主要目的就是克服现有技术不足，利用云南原产地毛柄金钱菌子实体筛选出优良菌株，采用生物技术进行菌种鉴定，制备毛柄金钱菌液体及固体优良菌种，为毛柄金钱菌资源保护提供优良菌种。
本发明采用的真菌是毛柄金钱菌Flammulina velutipes KML-19；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国北京市朝阳区大屯路；保藏日期：2012年10月31日；保藏登记入册的编号CGMCC NO.6704。
毛柄金钱菌的子实体由菌盖、菌褶、菌柄三部分组成，多数成束生长，肉质柔软有弹性。菌盖呈球形或呈扁半球形，直径1.5～7厘米，幼时球形，逐渐平展，过分成熟时边缘皱折向上翻卷。菌盖表面有胶质薄层，湿时有粘性，色黄白到黄褐，菌肉白色，中央厚，边缘薄，菌褶白色或象牙色，较稀疏，长短不一，与菌柄离生或弯生。菌柄中央生，中空圆柱状，稍弯曲，长3.5～15厘米，直径0.3～1.5厘米，菌柄基部相连，上部呈肉质，下部为革质，表面密生黑褐色短绒毛，担孢子生于菌褶子实层上，孢子圆柱形，无色。
本发明的技术方案：
①采集野生毛柄金钱菌子实体；
②组织分离或孢子分离；
③纯化菌株及菌株鉴定；
④生物学特性比较及生产性状比较；
⑤确定优良菌株；
⑥菌种生产及菌种应用；
经过反复筛选，获得菌丝体产量高、抗污染的毛柄金钱菌液体菌种专用菌株KML-19。
本发明真菌Flammulina velutipes培养方法(以下为重量百分比):
菌种分离纯化培养基：2%毛柄金钱菌下脚料、0.001%VB1、2%葡萄糖、2%琼脂；
毛柄金钱菌菌株分离及鉴定方法：
1、将毛柄金钱菌子实体组织块或孢子液接种到上述试管琼脂培养基斜面上，于18-24℃下培养5-10天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得毛柄金钱菌分离试管种。
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于18-24℃下培养5-7天，获得毛柄金钱菌纯化试管种。
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的毛柄金钱菌(Flammulina velutipes) Identities=518/532(97%)，Gaps=8/532(1%)，分析确定分离得到的纯培养物为毛柄金钱菌菌丝体。
本发明毛柄金钱菌菌种的制备方法分为：液体培养和固体培养两种。
液体菌种制备方法：
液体培养基配方为：10~20%麸皮、10~20%土豆、0.5~1%蔗糖、10%玉米粉，余下为水，pH自然。
1、将毛柄金钱菌的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，于18-24℃下培养5-7天，获得试管菌种。
2、将试管种接种到500ml三角瓶（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为前述液体培养基配方，于20-26℃下摇床培养，转速为120-160r/min，培养时间5-7天。
3、将摇瓶菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1：0.8v/(v·min)；搅拌转速为120-160r/min；接种量为5-10%；罐压：0.04Mpa； pH为6.0；温度为20-26℃；通气培养72-96小时，获得毛柄金钱菌液体菌种。
固体菌种制备方法：
固体培养基配方为：棉籽壳90%、麸皮9%、碳酸钙1%、pH自然。
1、将毛柄金钱菌的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，于18-24℃下培养5-7天，获得试管菌种。
2、将试管种接种到500ml三角瓶（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为前述液体培养基配方，于20-26℃下摇床培养，转速为120-160 r/min，培养时间5-7天。
2、采用前述固体培养基配方。将培养料混合后，加水拌均匀后，装入750ml的大口瓶中，压紧封口后在120℃灭菌60分钟，接入液体菌种，于20-26℃培养15-20天，直到菌丝长满。
具体实施方式
实施例一：
1、将毛柄金钱菌子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于18℃下培养10天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得毛柄金钱菌分离试管种。
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取菌丝块接种在培养基斜面上，于18℃下培养7天，获得毛柄金钱菌纯化试管种。
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的毛柄金钱菌(Flammulina velutipes) Identities=521/525(97%)，Gaps=2/525(0%)，分析确定分离得到的纯培养物为毛柄金钱菌菌丝体。
4、将Flammulina velutipes KML-19的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，18℃下培养7天，获得试管种。
5、将试管种接种到500ml三角瓶中（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为10%麸皮、10%土豆、0.5%蔗糖、10%玉米粉，余下为水，pH自然。于20℃下摇床培养，转速为120rpm，培养时间7天，获得一级液体菌种。
将一级液体菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1：0.8v/(v·min) ；搅拌转速为120r/min；接种量为5%；罐压：0.04Mpa； pH为6.0；温度为22℃；通气培养96小时，获得毛柄金钱菌液体菌种。
实施例二：
菌种制备的步骤与实施例一相同。
1、将毛柄金钱菌子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于22℃下培养6天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得毛柄金钱菌分离试管种。
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于22℃下培养6天，获得毛柄金钱菌纯化试管种。
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的毛柄金钱菌(Flammulina velutipes) Identities=521/525(97%)，Gaps=2/525(0%)，分析确定分离得到的纯培养物为毛柄金钱菌菌丝体。
4、将Flammulina velutipes KML-19的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，22℃下培养6天，获得试管种。
5、将试管种接种到500ml三角瓶中（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为15%麸皮、15%土豆、0.6%蔗糖、10%玉米粉，余下为水，pH自然。于22℃下摇床培养，转速为140rpm，培养时间6天，获得一级液体菌种。
将一级液体菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1：0.8v/(v·min) ；搅拌转速为140r/min；接种量为8%；罐压：0.04Mpa； pH为6.0；温度为24℃；通气培养84小时，获得毛柄金钱菌液体菌种。
实施例三：
1、将毛柄金钱菌子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于24℃下培养5天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得毛柄金钱菌分离试管种。
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于24℃下培养5天，获得毛柄金钱菌纯化试管种。
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的毛柄金钱菌(Flammulina velutipes) Identities=521/525(97%)，Gaps=2/525(0%)，分析确定分离得到的纯培养物为毛柄金钱菌菌丝体。
4、将Flammulina velutipesKML-19的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，24℃下培养5天，获得试管种。
5、将试管种接种到500ml三角瓶中（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为20%麸皮、20%土豆、0.5%蔗糖、10%玉米粉，余下为水，pH自然。于26℃下摇床培养，转速为160rpm，培养时间5天，获得一级液体菌种。
将一级液体菌种接种到固体培养基上，培养基配方为棉籽壳90%、麸皮9%、碳酸钙1%、pH自然。将各原料按比例称量后混合均匀，加水拌匀后装入750ml的菌种瓶中，每瓶装500ml，120℃灭菌60分钟后，接种后置于26℃培养15天，获得毛柄金钱菌固体菌种。
实施例四：
1、将毛柄金钱菌子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于24℃下培养5天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得毛柄金钱菌分离试管种。
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取菌丝块接种在培养基斜面上，于24℃下培养5天，获得毛柄金钱菌纯化试管种。
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的毛柄金钱菌(Flammulina velutipes) Identities=521/525(97%)，Gaps=2/525(0%)，分析确定分离得到的纯培养物为毛柄金钱菌菌丝体。
4、将Flammulina velutipesKML-19的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，24℃下培养5天，获得试管种。
5、将试管种接种到500ml三角瓶中（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为18%麸皮、10%土豆、1%蔗糖、10%玉米粉，余下为水，pH自然。于26℃下摇床培养，转速为160rpm，培养时间5天，获得一级液体菌种。
将一级液体菌种接种到固体培养基上，培养基配方为棉籽壳90%、麸皮9%、碳酸钙1%、pH自然。将各原料按比例称量后混合均匀，加水拌匀后装入750ml的菌种瓶中，每瓶装500ml，120℃灭菌60分钟后，接种后置于20℃培养20天，获得毛柄金钱菌固体菌种。

Claims (1)

1.一种毛柄金钱菌菌种制备方法，其特征在于所述毛柄金钱菌的菌株为Flammulina velutipes KML-19，该菌株的保藏号为CGMCC NO.6704，菌种培养基分为液体培养基和固体培养基，所述液体培养基配方为：10~20%麸皮、10~20%土豆、0.5~1%蔗糖、10%玉米粉，余下为水、pH自然；所述固体培养基配方为：棉籽壳90%、麸皮9%、碳酸钙1%、pH自然；所述毛柄金钱菌菌种制备方法包括液体菌种培养和固体菌种培养，具体包括：
A. 将毛柄金钱菌的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，于18~24℃下培养5-7天，获得试管菌种；
B. 将试管菌种接种到500ml三角瓶中的液体培养基，每瓶装200ml液体培养基，于20~26℃下摇床培养，转速为120~160r/min，培养时间5~7天；
C.将摇瓶菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1:0.8v/(v·min) ；搅拌转速为120~160r/min；接种量为5~10%；罐压：0.04Mpa；pH为6.0；温度为20~26℃；通气培养72~96小时，获得毛柄金钱菌一级液体菌种；
D. 将一级液体菌种接种到固体培养基上，将培养料混合后，加水拌均匀后，装入750ml的大口瓶中，压紧封口后在120℃灭菌60分钟，接入液体菌种，于20~26℃培养15~20天，直到菌丝长满，获得毛柄金钱菌固体菌种。
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