CN103602616A - 一种解淀粉芽孢杆菌y10及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）Y10及其应用，该解淀粉芽孢杆菌于2013年10月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCCNo.8362。本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌分离自土壤，适宜生长温度25～35℃，pH值为6.8～7.5，不仅具有产淀粉酶，而且还具有产蛋白酶和脂肪酶能力。本发明中的解淀粉芽孢杆菌Y10应用于餐厨垃圾厌氧发酵，提高沼气产气量15～40%。还可有效提高其他含蛋白、淀粉和脂肪等的废弃物或废水厌氧发酵水解及产沼气效率，对促进有机废弃物无害化、资源化和能源化利用有重要意义。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌Y10及其应用

技术领域

本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Y10及其应用，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

随经济发展和人民生活水平的提高，我国餐厨垃圾产量快速增长。据统计，中国城市每年产生餐厨垃圾不低于6000万吨，而无害化处理率不到5%，部分餐厨垃圾未经处理而加工成“地沟油”进入市场或地下养殖场成为饲料，严重威胁着人民的生命健康。2012年起政府给予产业高度重视，相关政策密集颁布。

目前，餐厨垃圾主要采用焚烧、堆肥、填埋、制作饲料等几种处理方式，其中：焚烧和填埋处理成本高、占地面积大、资源化利用水平低，极易造成二次污染。由于餐厨垃圾含水率高达80%，堆肥过程需要加入其他辅料，不仅增大处理量和占地面积，而且严重影响肥效及品质。用餐厨垃圾研制动物饲料对人类也存在安全隐患和潜在风险。

厌氧发酵技术是有机废弃物无害化、资源化和能源化利用的有效途径之一。餐厨垃圾含有丰富的淀粉、纤维素、蛋白质、脂类和无机盐等营养物质，是厌氧发酵的优良原料，其厌氧发酵处理已成为近些年的研究热点。投加高效功能微生物是提高餐厨垃圾厌氧发酵效率的有效途径，筛选能够高效降解餐厨垃圾的菌株是关键所在。

解淀粉芽孢杆菌在近些年多有研究，其代谢产物丰富，主要应用于抑制真菌和细菌活性等方面，如专利CN201110389068.X（申请日2011年11月30日）公开了一种解淀粉芽孢杆菌在防治花生果腐病中的应用个，但是其在餐厨垃圾等有机废弃物厌氧发酵方面尚未见相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种编号为Y10的解淀粉芽孢杆菌，其代谢产物具有降解蛋白、淀粉、脂肪的能力。另一方面本发明还提供了上述菌株的用途。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：

本发明的解淀粉芽孢杆菌Y10于2013年10月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No. 8362。

进一步的，本发明的解淀粉芽孢杆菌Y10合成蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶。

进一步的，本发明的解淀粉芽孢杆菌Y10具有降解有机物的能力。

进一步的，本发明的解淀粉芽孢杆菌Y10具有降解蛋白质、淀粉及脂肪的能力。

进一步的，本发明的解淀粉芽孢杆菌Y10应用于降解餐厨垃圾、沼气发酵或有机废水处理。

进一步的，本发明的解淀粉芽孢杆菌Y10应用于降解餐厨垃圾时的接种量为餐厨垃圾发酵液体积的5～20%（体积比），且解淀粉芽孢杆菌Y10菌液的含菌量不低于10⁹ 个/mL。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌Y10（CGMCC No. 8362），在LB培养基上生长，菌落圆形、乳白色、四周光滑、湿润、不透明、菌落边缘整齐。菌体杆状，长度约 1.9～4.0 μm，宽度约 0.8～1.1 μm，革兰氏阳性、杆状、形成芽孢，芽孢椭圆或柱形。兼性厌氧，化能异养，接触酶阳性，M.R 试验阳性，VP 试验阴性，可水解明胶、淀粉、酪蛋白，硝酸盐还原阳性，柠檬酸盐利用阳性。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌Y10适宜生长温度为25～35 ℃，pH值为6.8～7.5。

本发明的解淀粉芽孢杆菌Y10在常温和中温条件下，可提高餐厨垃圾沼气产量15～40%。其次，本发明的解淀粉芽孢杆菌Y10，可同时产生蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶，显著提高含多种有机混杂底物的降解效率。再者，本发明的解淀粉芽孢杆菌Y10除用于餐厨垃圾厌氧发酵外，还可有效提高其他含蛋白、淀粉和脂肪等的废弃物或废水厌氧发酵水解及产沼气效率。本发明的实现，不仅可以有效提高餐厨垃圾厌氧发酵效率，而且对促进有机废弃物无害化、资源化和能源化利用有重要意义，有着切实的经济、社会效益和广阔的应用前景。

生物样品保藏信息

解淀粉芽孢杆菌Y10，分类命名为Bacillus amyloliquefaciens，已于2013年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCC  No. 8362。

附图说明

图1为本发明解淀粉芽孢杆菌Y10的系统发育树。

具体实施方式

实施例1 解淀粉芽孢杆菌Y10分离和保藏

解淀粉芽孢杆菌Y10是从河北省科学院食堂周边土壤中，通过梯度稀释方法分离获得。

具体方法是：从河北省科学院食堂周边剩饭剩菜污染的地方，称取10 g土壤，加入装有90 mL 无菌水、带玻璃珠的三角瓶中，摇床振荡30 min (150 r/min)，逐级稀释，制成10^-5、10^-6 稀释悬液，在其中各吸取100μL，加到初筛培养基平板上，用涂布棒涂布均匀，每个处理重复3 次。将上述培养皿，置于25 ℃恒温培养箱中培养2～3 d。挑选透明圈大且长得快的单菌落转接到LB试管斜面上，于4 ℃保存。再将分离的菌株分别在蛋白酶产生菌初筛培养基平板、脂肪酶初筛培养基平板上，25 ℃恒温培养箱中培养2～3 d。挑选透明圈大且生长快的菌落，落转接到LB试管斜面上，4 ℃保存。

通过酶活测定法进行复筛。将分离得到的菌株接到LB液体培养基中，于25 ℃培养箱培养 48～72 h，发酵液在温度4 ℃，转速 8000 r/min下离心10 min，取上清液测定淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活力。测定方法分别采用国标GB/T 24401—2009（淀粉酶测定方法）、GB/T 23527—2009（蛋白酶测定方法）和GB/T 23535—2009（脂肪酶测定方法）。获得菌株Y10的蛋白酶活力达80～120 u/mL，淀粉酶活力达200～300 u/ mL, 脂肪酶活力达10～20 u/mL。

采用培养基：

淀粉酶初筛培养基：氯化钠5 g，牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，可溶性淀粉 10 g，琼脂粉 15 g，曲利苯蓝适量，1000 mL去离子水定容，pH 7.0～7.2。

蛋白酶初筛培养基：脱脂奶粉 10 g，琼脂粉 15 g， 1000 mL去离子水定容，pH 7.0～7.2。

脂肪酶初筛培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，吐温80 2 g，橄榄油 10 mL，琼脂粉10 g，1000 mL去离子水定容，pH7.0～7.5。

LB培养基：酵母提取物 5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，氯化钠 10.0 g，琼脂15.0 g，水1000 mL，pH7.0～7.4。

该菌株Y10，在LB培养基上生长，菌落圆形、乳白色、四周光滑、湿润、不透明、菌落边缘整齐。菌体杆状，长度约 1.9～4.0 μm，宽度约 0.8～1.1 μm，革兰氏阳性、杆状、形成芽孢，芽孢椭圆或柱形。兼性厌氧，化能异养，接触酶阳性，M.R 试验阳性，VP 试验阴性，可水解明胶、淀粉、酪蛋白，硝酸盐还原阳性，柠檬酸盐利用阳性。

菌株16S rDNA序列分析：选取处于对数生长期的菌液，用天根公司细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA，以其为模板，进行PCR扩增。

扩增引物为细菌通用引物：

 正向引物为5′-AGAGTTTGACC TGGCTCAG-3′（序列表seq 2），

反向引物为Pr：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′（序列表seq 3）。

PCR反应程序：在95 ℃进行预变性4 min；95 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，30个循环延伸；72 ℃ 10 min。

由北京天根公司进行PCR产物测序，其16S rDNA序列见序列表seq1。测序完成之后用DNAMAN软件构建系统发育树（具体见图1）。根据菌株形态学、生理生化和16S rDNA序列分析，菌株Y10被鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。将解淀粉芽孢杆菌Y10于2013年10月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No. 8362。

实施例2  解淀粉芽孢杆菌Y10酶活测定

将分离得到的菌株接到LB液体培养基中，于25 ℃培养箱培养 72 h，发酵液在温度4 ℃，转速 8000 r/min下离心10 min，取上清液测定淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活力。

测定方法分别采用：

淀粉酶测定方法：国标GB/T 24401—2009。

酶活定义：1 g固体酶粉（或1 mL液体酶），于60 ℃ 、pH值6.0条件下，1 h液化1 g可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。

蛋白酶测定方法：国标GB/T 23527—2009（福林法）。

酶活定义：1 g固体酶粉（或1 mL液体酶），在一定温度和pH条件下（本专利采用40℃、pH7.0），1 min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。

脂肪酶测定方法：国标GB/T 23535—2009。

酶活定义：1 g固体酶粉（或1 mL液体酶），在一定温度和pH条件下（本专利采用40 ℃、pH 7.0），1 min水解底物（本专利以橄榄油为底物）产生1 umol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活力单位，以“u/g（u/mL）”表示。

结果：蛋白酶活力达118 u/mL，淀粉酶活力达285 u/ mL, 脂肪酶活力达18.6 u/mL。

实施例3-7  解淀粉芽孢杆菌Y10在餐厨垃圾厌氧发酵中的应用

采用5 L全混式厌氧发酵装置，以餐厨垃圾为原料，接种物来源于正常发酵沼气池，接种量20～30%（体积比），最终厌氧发酵液TS为6～10%（TS又称干物质浓度，指将一定量的发酵料液放置在105 ℃烘箱内，烘干至恒重，烘干物质占总重的百分比），按厌氧发酵液总量的5～20%接入解淀粉芽孢杆菌Y10菌液，菌液含细菌总数≥10⁹ 个/mL。在常温（25±1 ℃）条件下发酵50 d，提高沼气产量20～38%。中温（35±1 ℃）条件下发酵30 d，提高沼气产量15～40%。具体见表1。

表1解淀粉芽孢杆菌Y10对餐厨垃圾厌氧发酵产沼气的影响

 

SEQUENCE LISTING

 

<110>   河北省科学院生物研究所

 

<120>  一种解淀粉芽孢杆菌Y10及其应用

 

<130>  2013

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1432

<212>  DNA

<213>  解淀粉芽孢杆菌Y10

 

<400>  1

ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg     60

 

ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct   120

 

aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac      180

 

ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcaacg     240

 

atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc    300

 

ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc    360

 

gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg       420

 

ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca      480

 

gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc     540

 

gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga     600

 

aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg    660

 

tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag     720

 

gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat    780

 

gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc        840

 

cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag    900

 

cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc        960

 

tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt      1020

 

tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat       1080

 

cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa      1140

 

ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat      1200

 

ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag   1260

 

ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca      1320

 

gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt    1380

 

ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttaggagcc agccgccgaa gg           1432

 

 

 

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

agagtttgac ctggctcag                                          19

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

acggctacct tgttacgact                                          20

 

Claims (6)

1.一种解淀粉芽孢杆菌Y10，该解淀粉芽孢杆菌于2013年10月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No. 8362。

2.根据权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌Y10，其合成蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶。

3.根据权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌Y10，其具有降解有机物的能力。

4.根据权利要求3所述的一种解淀粉芽孢杆菌Y10，其特征在于其具有降解蛋白质、淀粉及脂肪的能力。

5.根据权利要求1-4的任意一项所述的一种解淀粉芽孢杆菌Y10的应用，其特征在于：用于降解餐厨垃圾、沼气发酵或有机废水。

6.根据权利要求5所述的一种解淀粉芽孢杆菌Y10的应用，其特征在于解淀粉芽孢杆菌Y10的接种量为餐厨垃圾发酵液体积的5～20%（体积比），且解淀粉芽孢杆菌Y10菌液的含菌量不低于10⁹ 个/mL。

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