CN105441356A - 一种双酶梭菌z-13及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种双酶梭菌（<i>Clostridium？bifermentans</i>）Z-13及其应用，该双酶梭菌于2015年10月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC？No.？11561。本发明所提供的双酶梭菌分离自污水处理厂厌氧污泥，适宜生长温度25～35℃，pH值为6.8～7.2，不仅具有产蛋白酶能力，而且还能利用多种有机物产乙酸。本发明中的双酶梭菌Z-13应用于抗生素菌渣厌氧发酵，提高沼气产气量30%以上。还可有效提高其他含蛋白的废弃物或废水厌氧发酵水解及产沼气效率，对促进有机废弃物资源化和能源化利用有重要意义。

Description

一种双酶梭菌Z-13及其应用

技术领域

本发明涉及一种双酶梭菌Z-13（Clostridiumbifermentans）及其应用，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

由于抗生素菌渣对生态环境和人类健康存在潜在危害性，国家已将其明确列为危险废物，禁止用于饲料和肥料。抗生素菌渣如按危险废物处置，所产生的高额处置费用将使企业无法承受。另一方面，抗生素菌渣含水率一般在70％～93％，干基中含有大量的菌体蛋白（约40%以上）、粗脂肪（约2～20%）、多糖（约10%以上）、多种氨基酸（如天门冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、白氨酸等）、微量元素及培养基残留物等营养物质。如果直接丢弃，不仅会造成极大的资源浪费，而且由于其极易腐败，引发严重的环境污染。

抗生素菌渣含有丰富的有机物质，是厌氧发酵的优良原料。厌氧发酵技术也是抗生素菌渣无害化、资源化处理的一种有效途径。但是抗生素菌渣厌氧发酵系统运行有机负荷偏低，处理能力与产生量严重不匹配，远不能满足处理需求。投加高效功能微生物是提高有机废弃物厌氧发酵效率的有效方法，筛选能够高效降解抗生素菌渣的微生物是其关键所在。

发明内容

本发明的目的在于提供一种编号为Z-13的双酶梭菌，其代谢产物具有降解蛋白的能力，并且该菌可利用多种物质产挥发性有机酸，如乙酸、丁酸等。另一方面本发明还提供了上述菌株的用途。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：

本发明的双酶梭菌Z-13于2015年10月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCCNo.11561。

进一步的，本发明的双酶梭菌Z-13合成蛋白酶，具有降解蛋白质能力。

进一步的，本发明的双酶梭菌Z-13能利用碳源产乙酸。

进一步的，所述碳源优选葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、丙酸钠或丁酸钠。

本发明还提供了所述双酶梭菌Z-13的应用，用于含蛋白有机废弃物处理。

进一步的，本发明的双酶梭菌Z-13应用于抗生素菌渣厌氧发酵、沼气发酵或含蛋白有机废水处理。

进一步的，本发明的双酶梭菌Z-13应用于抗生素菌渣厌氧发酵、沼气发酵或含蛋白有机废水处理时菌液的接种量为1～20%（菌液与接种后料液的体积比），且双酶梭菌Z-13菌的含菌量不低于10⁸个/mL。

本发明所述的双酶梭菌Z-13（CGMCCNo.11561），在LB培养基上生长，菌落圆形、乳白色、四周光滑、湿润、不透明、菌落边缘整齐。菌体杆状，革兰氏阳性、形成芽孢，严格厌氧生长。VP试验阴性，可使明胶液化，水解酪蛋白，水解淀粉，硝酸盐还原和H₂S产生实验阴性，吲哚实验阳性。

本发明所述的双酶梭菌Z-13适宜生长温度为25～35℃，pH值为6.8～7.5。

本发明的双酶梭菌Z-13在常温和中温条件下，可提高抗生素菌渣沼气产量30%以上。其次，本发明的双酶梭菌Z-13，可利用多种底物产生蛋白酶、挥发性有机酸，显著提高含多种有机混杂底物的降解效率。再者，本发明的双酶梭菌Z-13除用于抗生素菌渣厌氧发酵外，还可有效提高其他含蛋白的废弃物或废水厌氧发酵水解及产沼气效率。本发明的实现，不仅可以有效提高抗生素菌渣厌氧发酵效率，而且对促进有机废弃物无害化、资源化和能源化利用有重要意义，有着切实的经济、社会效益和广阔的应用前景。

生物样品保藏信息

双酶梭菌Z-13，分类命名为Clostridiumbifermentans，已于2015年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCCNo.11561。

附图说明

图1为本发明双酶梭菌Z-13的系统发育树。

具体实施方式

实施例1双酶梭菌Z-13分离和保藏

双酶梭菌Z-13是从石家庄市某污水处理厂厌氧污泥中，通过富集培养、传代、梯度稀释方法分离获得。

具体方法是：从石家庄某污水处理厂取厌氧污泥，取少量污泥放到装有富集培养基的厌氧瓶中，35℃富集培养。传代稳定后，采用改良Hungate滚管技术，用蛋白酶产生菌初筛培养基进行分离筛选，35℃培养48～72h，挑选透明圈直径（D）与菌落直径（d）之比D/d值较大的菌落，接种于LB培养基，4℃保存备用。

通过酶活测定法进行复筛。将分离得到的菌株接到LB液体培养基中，于35℃培养箱培养48～72h，发酵液在温度4℃，转速8000r/min下离心10min，取上清液测定蛋白酶活力。测定方法采用国标GB/T23527—2009（蛋白酶测定方法）。获得菌株Z-13的蛋白酶活力达25～30u/mL。

采用培养基：

（1）富集培养基（g/L）：胰蛋白胨2.5，酪蛋白3，酵母提取物5，蛋白胨2.5，L-半胱氨酸盐酸盐0.5，NaCl5，KH₂PO₄1，MgSO₄0.5，0.1%的刃天青指示剂2滴，去离子水定容，pH值7.0～7.2。

（2）蛋白酶初筛培养基（g/L）：脱脂奶粉10，琼脂粉15，去离子水定容，pH7.0～7.2。

（3）LB培养基（g/L）：酵母提取物5，胰蛋白胨10，氯化钠10，琼脂15，去离子水定容，pH7.0～7.4。

该菌株Z-13，在LB培养基上生长，菌落圆形、乳白色、四周光滑、湿润、不透明、菌落边缘不整齐。菌体杆状，革兰氏阳性、形成芽孢，严格厌氧生长。VP试验阴性，可使明胶液化，水解酪蛋白和淀粉，硝酸盐还原和H₂S产生实验阴性，吲哚实验阳性。可利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖产酸产H₂。

菌株16SrDNA序列分析：选取处于对数生长期的菌液，用天根公司细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA，以其为模板，进行PCR扩增。

扩增引物为细菌通用引物：

正向引物为Pf：5′-AGAGTTTGACCTGGCTCAG-3′，

反向引物为Pr：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′。

PCR反应程序：在95℃进行预变性4min；95℃1min，52℃1min，72℃3min，30个循环延伸；72℃10min。

由北京天根公司进行PCR产物测序，其16SrDNA序列见序列表。测序完成之后用DNAMAN软件构建系统发育树（具体见图1）。根据菌株形态学、生理生化和16SrDNA序列分析，菌株Z-13被鉴定为双酶梭状芽孢杆菌（Clostridiumbifermentans）。将双酶梭菌Z-13于2015年10月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCCNo.11561。

实施例2双酶梭菌Z-13产蛋白酶活力测定

将分离得到的菌株接到LB液体培养基中，于35℃培养箱培养72h，发酵液在4℃，转速8000r/min下离心10min，取上清液测定蛋白酶。

测定方法：国标GB/T23527—2009（福林法）。

酶活定义：1mL液体酶（或1g固体酶粉），在一定温度和pH条件下（本专利采用40℃、pH7.0），1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以u/mL（u/g）表示。

结果：蛋白酶活力达27u/mL。

实施例3双酶梭菌Z-13产乙酸能力测定

基础培养基为：L-半胱氨酸盐酸盐0.5，NaCl1.5，KH₂PO₄1，MgSO₄0.5，0.1%的刃天青指示剂2滴，pH值7.0～7.2；分别以1%的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、柠檬酸、丙酸钠、丁酸钠为底物，35℃培养箱培养72h，测定乙酸含量。

乙酸含量测定方法：采用气相色谱仪分析法测量(Agilent7890A)，柱子为DB-FFAP（30m,0.53mm,0.50u），柱温箱100℃保持5min，以10℃/min由100℃升至250℃，在250℃保持12min；进样口250℃，分流比1:50；检测器为FID，300℃，氮气尾吹30mL/min。

结果表明，菌株Z-13能较好地利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉生长产酸，乙酸产量达800-1100mg/L，柠檬酸不利于菌株Z-13的代谢产酸。另外菌株Z-13能以丙酸钠、丁酸钠为唯一碳源发酵产乙酸，对于促进厌氧水解进程和解除厌氧消化过程中由丙酸积累导致的系统酸化问题具有积极意义。

实施例4-8双酶梭菌Z-13在抗生素菌渣厌氧发酵中的应用

采用5L全混式厌氧发酵装置，以青霉素菌渣为原料（含水率为88.2%），接种物来源于正常发酵沼气池，接种量20～30%（体积比），接种后厌氧发酵液TS为2～3%（TS又称干物质浓度，指将一定量的发酵料液放置在105℃烘箱内，烘干至恒重，烘干物质占总重的百分比），按接种量1～20%（菌液与接种菌液后厌氧发酵液的体积比）接入双酶梭菌Z-13菌液，菌液含细菌总数≥10⁸个/mL。在中温（35±1℃）条件下发酵30d，提高沼气产量30%以上。具体见表1。

表1双酶梭菌Z-13对青霉素菌渣厌氧发酵产沼气的影响

。

实施例9双酶梭菌Z-13在含蛋白废水中的应用

采用5L全混式厌氧发酵装置，以高蛋白浓度废水为原料（来源于乳制品厂生产废水），接种物来源于污水处理厂活性污泥，接种量20～30%（接种物与接种后厌氧发酵液的体积比），厌氧发酵液COD约20000mg/L（COD又称化学需氧量，是指在一定严格的条件下，水中的还原性物质在外加的强氧化剂的作用下，被氧化分解时所消耗氧化剂的数量，以氧的mg/L表示），按2%（菌液与接种菌液后厌氧发酵液的体积比）的接种量接入双酶梭菌Z-13菌液，菌液含细菌总数≥10⁸个/mL。在中温（35±1℃）条件下发酵10d，提高沼气产量18.5%。

SEQUENCELISTING

<110>河北省科学院生物研究所

<120>一种双酶梭菌Z-13及其应用

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1438

<212>DNA

<213>双酶梭菌Z-13

<400>1

CTACCATGCAAGTCGAGCGATCTCTTCGGAGAGAGCGGCGGACGGGTGAAAGTAACGCGT60

GGGTAACCTGCCCTGTACACACGGATAACATACCGAAAGGTATACTAATACGGGATAACA120

TATGAAAGTCGCATGGCTTTTGTATCAAAGCTCCGGCGGTACAGGATGGACCCGCGTCTG180

ATTAGCTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCAACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGG240

GTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGG300

AATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGCGATGAAGGCCTTC360

GGGTCGTAAAGCTCTGTCCTCAAGGAAGATAATGACGGTACTTGAGGAGGAAGCCCCGGC480

TAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCTAGCGTTATCCGGAATTACTGG540

GCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTTTTTAAGTCAGAAGTGAAAGGCTACGGCTCAACCGTA600

GTAAGCTTTTGAAACTAGAGAACTTGAGTGCAGGAGAGGAGAGTAGAATTCCTAGTGTAG660

CGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAATACCAGTAGCGAAGGCGGCTCTCTGGACTGTA720

ACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC780

GCCGTAAACGATGAGTACTAGGTGTCGGGGGTTACCCCCCTCGGTGCCGCAGCTAACGCA840

TTAAGTACTCCGCCTGGGAAGTACGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGA900

CCCGCACAAGTAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTAAG960

CTTGACATCCCACTGACCTCTCCCTAATCGGAGATTTCCCTTCGGGGACAGTGGTGACAG1020

GTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGC1080

GCAACCCTTGCCTTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGAGGGACTGCCGAGGAT1140

AACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGCTTAGGGCTACAC1200

ACGTGCTACAATGGGTGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCTTAA1260

AGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGAAACTCGCCTACATGAAGCTGGAGTTACTAGT1320

AATCGCAGATCAGAATGCTGCGGTGAATGCGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCA1380

CACCATGGAAGTTGGGGGCGCCCGAAGCCGGTTAGCTAACCTTTTAGGAAGCGGCCGT1438

Claims (7)

1.一种双酶梭菌Z-13，该双酶梭菌于2015年10月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCCNo.11561。

2.根据权利要求1所述的一种双酶梭菌Z-13，其特征在于：其能合成蛋白酶。

3.根据权利要求1所述的一种双酶梭菌Z-13，其特征在于：其能利用碳源产乙酸。

4.根据权利要求3所述的一种双酶梭菌Z-13，其特征在于：所述碳源为葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、丙酸钠或丁酸钠。

5.权利要求1-4任一项所述的双酶梭菌Z-13的应用，其特征在于：用于处理含蛋白废弃物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述双梅梭菌用于抗生素菌渣厌氧发酵、沼气发酵或含蛋白有机废水处理。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述双酶梭菌Z-13的菌液的接种量为1～20%（体积比），且双酶梭菌Z-13菌液的含菌量不低于10⁸个/mL。