CN103320356B - 产蛋白酶菌株微小杆菌属及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及产蛋白酶菌株微小杆菌属及其应用。采用酪蛋白平板初筛和摇瓶发酵复筛的方法从深海海泥中筛选到一株蛋白酶高产菌株，经鉴定为微小杆菌属。于2013年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7387。采用单因素试验优化了产蛋白酶的条件，其培养条件简单，易培养，遗传性质稳定。
Description
技术领域
本发明涉及深海来源的蛋白酶生产菌株，具体涉及微小杆菌属（Exiguobacterium sp.）SWJS2及其液体发酵产蛋白酶的方法。
背景技术
蛋白酶是分解蛋白质肽键的一类酶，与人类的生活息息相关，在全球酶制剂销售总额中占60%以上，但其更广泛的应用受到生产成本和酶学特性的制约，因此探索新型的蛋白酶资源及高产蛋白酶的菌种一直受到研究者们的关注。随着人类对生物资源的多样性及特异性需求的不断增加，已有的陆地资源在被不断挖掘的同时仍不能满足人类对新资源的的需求，研究者们将目光投向了极具潜力的海洋生物资源。海洋环境普遍具有高盐、高压、低温、低光照、寡营养等特性，并存在着局部高温、高酸、高碱、高辐射等极端环境，使得海洋微生物与陆生微生物在代谢系统和防御体上存在明显的差异，可能产生多种具有特殊结构和功能的生物活性物质。自1972年Nabou Kato等首次报道了海洋细菌Peseudomoas sp. No.548产生蛋白酶后，国内外许多课题组对海洋微生物来源的蛋白酶进行了研究，主要集中在新的产酶微生物及新型蛋白酶如适冷蛋白酶、高温蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等方面。
目前已发现的产蛋白酶的海洋细菌主要包括假单胞菌属、黄杆菌属、芽孢杆菌属、弧菌属、氧化短杆菌属等，深海来源的产蛋白酶的微小杆菌属尚未有报道。微小杆菌属可应用于生产乳酸、降解三苯甲烷类染料孔雀绿、降解阿特拉津等，其产蛋白酶的研究有少量报道。石卉等从腐败的碱性硅溶胶中分离出一株产碱性蛋白酶的金橙黄微小杆菌，优化条件下酶活为37.793U/mL。Kasana等从西部喜马拉牙雅山的土壤中分离出了微小杆菌属Exiguobacterium sp. SKPB5 (MTCC 7803)，所产蛋白酶最适温度为50℃，最适pH为8.0，酶活为1.46 U/mg 蛋白。Lee等从土壤样品中分离得到产碱性蛋白酶的Exiguobacteriumsp. YS1，酶活为150 U/mL左右。本发明中涉及的微小杆菌属（Exiguobacteriumsp.）SWJS2产中性蛋白酶活达600U/mL以上，遗传性质稳定，酶学性质与所报道的有差异，有巨大的工业应用的潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一个深海来源、高产蛋白酶的微生物菌株，及其液体发酵产蛋白酶的应用。
本发明的产蛋白酶菌株微小杆菌属分离自南海深海海泥样品，采用酪蛋白平板初筛和摇瓶发酵复筛筛选得到，分类命名为微小杆菌属（Exiguobacterium sp.）SWJS2。该菌株已于2013年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.7387。
经形态鉴定及生物生化特性研究，保藏编号为CGMCC No.7387的菌株具有以下特征：（1）菌落形态：菌落呈圆形，直径较小，光滑湿润，边缘整齐，淡橙黄色；（2）细胞形态：革兰氏染色阳性，生长早期全部呈杆状，后期部分细胞呈球状，无鞭毛，不产芽孢；（3）生理生化特征：需氧生长，能利用葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇，不能利用D-山梨醇，淀粉水解阳性、明胶液化阳性、甲基红试验阴性、V-P试验阴性、靛基质试验阴性、硝酸盐还原阴性、接触酶阳性、氧化酶阴性，不产氨，不产H2S。
对保藏编号为CGMCC No.7387菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增与序列测定，测得16S rRNA基因片段长度为1455bp，具体序列见序列表。该基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行分析得知，该菌株与Exiguobacterium acetylicum strain QD-3(FJ970034.1)相似性最高，同源性达99%。结合16S rRNA基因序列相似性及形态、生理生化特征，鉴定该菌株为微小杆菌属（Exiguobacteriumsp.）。
本发明还提供了产蛋白酶菌株微小杆菌属（Exiguobacterium sp.）SWJS2在液体发酵生产蛋白酶中的应用。本发明采用单因素试验对保藏编号为CGMCC No.7387菌株液体发酵产蛋白酶的条件进行了优化。
本发明采用单因素试验优化了产蛋白酶的条件，其培养条件简单，易培养，遗传性质稳定。关于微小杆菌属产蛋白酶的研究还比较少，加上其来自深海的特殊环境，可能成为新型蛋白酶资源的生产菌种，具有重要的后续开发及工业应用价值。
附图说明
图1为不同发酵温度对微小杆菌属SWJS2产蛋白酶的影响曲线。
图2为不同装液量对微小杆菌属SWJS2产蛋白酶的影响曲线。
图3为不同的种子液培养时间对微小杆菌属SWJS2产蛋白酶的影响曲线。
图4为不同发酵时间对微小杆菌属SWJS2产蛋白酶的影响曲线。
具体实施例
富集及种子培养基：蛋白胨5g,酵母粉1g，人工海水1L,pH 7.4-7.6。
酪蛋白培养基：酪蛋白10g，牛肉浸粉3g，磷酸二氢钾2g,琼脂粉15g，人工海水1L,pH 7.4左右。
发酵培养基：甘油3g，葡萄糖5g, 酵母粉 10g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.3g，硫酸铵1g，氯化钙1g，海盐10g， pH7.2左右。
产蛋白酶的CGMCC No.7387的分离筛选
富集培养：称取2g深海海泥样品样于50mL灭菌离心管中，加10mL无菌蒸馏水，在摇床中振摇20min充分分散，静置后取上清液1mL于富集培养中（50 mL /250mL），37℃，120rpm，培养48h。
初筛：取富集后的培养液1mL加入9mL无菌生理水中，用倍比法稀释到不同梯度（10-1-10-7）。选取10-4，10-5，10-6，10-7稀释度，各吸取0.1mL，加入已凝固的酪蛋白培养基中，涂布均匀。倒置放在37℃培养箱中培养48-60h。
分离纯化：挑选上述酪蛋白平板中有明显水解圈的菌落，在新的酪蛋白平板上连续划线分离三次以上，直到为纯培养物为止。挑选水解圈较大的单菌落保存于试管斜面上，保藏于4℃冰箱。
摇瓶发酵复筛：将上述保藏的菌株接种于种子培养基中，37℃，150rpm,活化12h,以2%接种量接种于发酵培养基中，37℃，150rpm,培养48h。发酵液在4℃，10000rpm条件下高速离心10min,取上清液即为粗酶液。采用福林（Folin）试剂显色法测定中性蛋白酶活力，复筛出液体发酵蛋白酶活力高的菌株。
产蛋白酶的CGMCC No.7387的鉴定
将活化的CGMCC No.7387接种于L-B培养基中，37℃，150rpm培养10h，取1.5mL新鲜菌液4℃，10000rpm离心5min，收集菌体于2mL离心管中，采用DNA提取试剂盒提取DNA。电泳检测后采用通用引物进行PCR（正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,反向引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。
扩增总反应体系为（20μL）:模板基因DNA 0.5μL；上下游引物(20μmol/l)各1.0μL；Taq DNA聚合酶0.2μL；10×buffer 2.0μL；4种脱氧核苷酸混合物dNTP(各2.5 mmol/L)1.6μL，25 mmol/L MgCl2 1.6μL，双蒸水(ddH2O)12.1μL。PCR扩增条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 1.5 min；72℃ 10 min；10℃，共30个循环。PCR产物纯化后完成测定的16S rRNA基因基因片段长度为1455bp，与Exiguobacterium acetylicum strain QD-3(FJ970034.1)相似性最高，同源性达99%，具体序列见序列表。根据菌株形态、生理生化特征，结合16S rRNA基因序列相似性鉴定CGMCC No.7387为微小杆菌属（Exiguobacteriumsp.）
微小杆菌属CGMCC No.7387液体发酵产蛋白酶的条件优化
发酵温度的优化：分别在20℃、25℃、30℃、37℃下发酵，装液量20%，150rpm,培养48h。测定不同发酵温度下粗酶液的中性蛋白酶活力，结果见图1，在25℃下发酵蛋白酶活力最高。
装液量的优化：摇瓶发酵在250mL锥形瓶中进行，装液量分别为10%、20%、30%、40%、60%、80%，在25℃，150rpm条件下发酵48h。
测定不同发酵温度下粗酶液的中性蛋白酶活力，结果见图2，装液量在10%或20%时蛋白酶活力都较高，装液量继续增加时，蛋白酶产量迅速降低。
种子液培养时间的优化：种子液在37℃，150rpm下分别培养8h、12h、16h、20h、24h,然后接种到发酵培养基中培养48h。测定种子液不同活化时间下粗酶液的中性蛋白酶活力，结果见图3，活化时间在8-16h时蛋白酶活力都比较高。
发酵时间的优化：在25℃，装液量10%，150rpm条件下发酵，从0-52h每隔4h连续取样，测定中性蛋白酶产量随发酵时间延长的变化趋势。结果见图4，中性蛋白酶在44h时积累量达到最大，随着时间继续延长，有一定的下降。
微小杆菌属CGMCC No.7387遗传稳定性
将保藏的微小杆菌属CGMCC No.7387连续传代培养并测定其蛋白酶活力，以酶活力作为指标综合评价菌株的遗传稳定性。结果见表1，传代8次，蛋白酶活力保持在600U/mL左右，遗传稳定性良好。
表1
| 传代次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 蛋白酶活U/mL | 594±38 | 630±41 | 663±49 | 595± 33 | 636± 36 | 589± 29 | 589± 29 | 616± 18 |
SEQUENCE LISTING
<110> 华南理工大学
<120> 产蛋白酶菌株微小杆菌属及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1455
<212> DNA
<213> Exiguobacterium sp.
<400> 1
acatcttcga cggctggctc cttgcggtta cctcaccggc ttcgggtgtt gcaaactctc 60
gtggtgtgac gggcggtgtg tacaagaccc gggaacgtat tcaccgcagt atgctgacct 120
gcgattacta gcgattccga cttcatgcag gcgagttgca gcctgcaatc cgaactggga 180
acggctttat gggattggct ccacctcgcg gtctcgctgc cctttgtacc gtccattgta 240
gcacgtgtgt agcccaactc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc 300
cggtttgtca ccggcagtct ccctagagtg cccaactgaa tgctggcaac taaggatagg 360
ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg 420
caccacctgt caccattgtc cccgaaggga aaacttgatc tctcaagcgg tcaatgggat 480
gtcaagagtt ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg 540
tgcgggtccc cgtcaattcc tttgagtttc agccttgcgg ccgtactccc caggcggagt 600
gcttaatgcg ttagcttcag cactgagggg cggaaacccc ccaacaccta gcactcatcg 660
tttacggcgt ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct ccccacgctt tcgcgcctca 720
gcgtcagtta cagaccaaag agtcgccttc gccactggtg ttcctccaca tctctacgca 780
tttcaccgct acacgtggaa ttccactctt ctcttctgta ctcaagcctt ccagtttcca 840
atggccctcc ccggttgagc cgggggcttt cacatcagac ttaaaaggcc gcctgcgcgc 900
gctttacgcc caataattcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc 960
acgtagttag ccgtggcttt ctcgtaaggt accgtcaagg tacgagcatt tcctctcgta 1020
cgtgttcttc ccttacaaca gagttttacg atccgaaaac cttcatcact cacgcggcgt 1080
tgctccatca gactttcgtc cattgtggaa gattccctac tgctgcctcc cgtaggagtc 1140
tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggccga tcaccctctc aggtcggcta tgcatcgtcg 1200
ccttggtggg ccgttacccc accaactagc taatgcaccg caaggccatc tcaaggtgac 1260
gccgaagcgc ctttcatcag cggaccatgc ggtccgttga actatccggt attagctccg 1320
atttctcgga gttatcccaa tccttgaggc aggttcctta cgtgttactc acccgtccgc 1380
cgctcattcc actgccttcc ctccgaagag ttccgtcagc ttcctgcgct cgacttgcat 1440
gtatagcacg cgcaa 1455
Claims (2)
1.产蛋白酶菌株微小杆菌属（Exiguobacterium sp.）SWJS2，该菌株于2013年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7387。
2.权利要求1所述的产蛋白酶菌株微小杆菌属（Exiguobacterium sp.）SWJS2在液体发酵生产蛋白酶中的应用。
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| Debora F Rodrigues 等.Architecture of thermal adaptation in an Exiguobacterium sibiricum strain isolated from 3 million year old permafrost: A genome and transcriptome approach.《BMC Genomics》.2008,第9卷1-17. * |
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