CN112143671B - 微小杆菌whx-1及其在处理生活污水的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微小杆菌WHX‑1，于2018年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16733。并公开了其粗酶液在处理生活污水的应用。本发明的微小杆菌WHX‑1具有高盐耐受性，可快速高效的降解生活污水中的蛋白质，在生活污水处理中具有很好的应用前景和研究价值。

Description

微小杆菌WHX-1及其在处理生活污水的应用
技术领域
本发明涉及一种微小杆菌WHX-1及其粗酶液在处理生活污水中的应用。
背景技术
生活污水处理问题是当今世界面临的重要问题之一。利用微生物处理污水具有高效、简便、经济及安全等特点。环境污水或淤泥中存在的菌株，对污水中常见的污染物具有较好的耐受性和分解能力，可作为污水处理的菌种来源。从环境中分离菌株进行驯化或者利用基因工程方法合成特殊的酶类，可以作为生活污水处理的一个有效途径。
微小杆菌(Exiguobacteria)是一种革兰阳性杆菌，在环境中普遍存在，不仅可分解污水中常见的碳水化合物、脂质及蛋白质，还对污水中多种有毒有害、难处理的成分有一定降解作用。另外微小杆菌还具有耐碱、耐盐及适应温度范围广等特点，对消毒剂也具有一定抵抗力。因此，微小杆菌在生活污水处理中具有很好的应用前景和研究价值。
发明内容
1、发明目的。
本发明筛选出一株对生活污水中蛋白有很强分解能力的微小杆菌菌株WHX-1及其粗酶液。
2、本发明所采用的技术方案。
本发明的微小杆菌WHX-1，于2018年11月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101)保藏，分类命名为微小杆菌(Exiguobacteria sp)，保藏编号为CGMCC No.16733。
本发明的微小杆菌WHX-1菌株具有以下微生物学特征：
(1)菌落形态：在营养培养基上37℃培养24h表现为圆形、光滑、隆起、黄色的中等大小菌落。
(2)菌体形态：革兰阳性杆菌。
(3)生理生化特征：氧化酶、触酶阳性，发酵葡萄糖产酸，动力、麦芽糖、七叶苷阳性，硫化氢、吲哚、脲酶、枸橼酸、硝酸盐、赖氨酸、鸟氨酸、ONPG阴性。
(4)培养特征：最适生长温度25℃，20℃-37℃范围在72小时内可保持较高活性，25℃环境细菌活性和数量(80％)可维持超过10 天。
营养要求不高。在普通培养基或LB中生长良好，在低于普通培养基或LB的较低营养浓度(1/2,1/4)细菌存活和数量保持更长时间。
可耐受5％氯化钠，最适盐度范围0.5％-3.0％。
在30℃河水中可繁殖，24h后菌量可达最大值并可维持超过84 小时。
(4)16S rDNA鉴定为金橙黄微小杆菌(Exiguobacteriumaurantia cum)。
(5)对常用抗生素敏感
本发明的微小杆菌WHX-1可应用于处理富含蛋白的生活污水， 37℃时菌株作用24h对水中蛋白质的降解率达94.28％。
微小杆菌WHX-1粗酶液对模拟动物蛋白和植物蛋白污水的降解率分别为66.70％和38.70％；对福氏志贺菌的抑制率达76.5％。
3、本发明所产生的技术效果。
本发明的微小杆菌WHX-1具有高盐耐受性，可快速高效的降解生活污水中的蛋白质，其粗酶液同样具有降解蛋白的作用，在生活污水处理中具有很好的应用前景和研究价值。
附图说明
图1不同温度条件下菌株WHX-1的生长曲线。
图2不同营养条件下菌株WHX-1的生长曲线。
图3菌株WHX-1在不同氯化钠浓度生长状况，其中A：1％；B： 3％；C：5％；D：7％。
图4 30℃河水中菌株WHX-1的生长曲线。
图5菌株WHX-1对动物蛋白的降解效率。
图6菌株WHX-1对植物蛋白的降解效率。
具体实施方式
应该指出，以下具体说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本文所使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。若为特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1微小杆菌菌株的分离与鉴定
取环境污水，酪蛋白琼脂平板法筛选微小杆菌，常规生化法和 16S rDNA鉴定细菌，K-B法测定药物敏感性，绘制不同生长条件的生长曲线。筛选出3株金橙黄微小杆菌(Exiguobacteriumaurantiacum)，以菌株WHX-1的粗酶液活性最高 (4.20UmL)。菌株WHX-1已于2018年11月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为微小杆菌(Exiguobacteria)，保藏编号为CGMCC No.16733。
本发明的微小杆菌WHX-1菌株具有以下微生物学特征：
(1)菌落形态：在营养培养基上37℃培养24h表现为圆形、光滑、隆起、黄色的中等大小菌落。
(2)菌体形态：革兰阳性杆菌。
(3)生理生化特征：氧化酶、触酶阳性，发酵葡萄糖产酸，动力、麦芽糖、七叶苷阳性，硫化氢、吲哚、脲酶、枸橼酸、硝酸盐、赖氨酸、鸟氨酸、ONPG阴性。
(4)培养特征：如图1所示，最适生长温度25℃，20℃-37℃范围在72小时内可保持较高活性，25℃环境细菌活性和数量(80％)可维持超过10天。
如图2所示，营养要求不高。在普通培养基或LB中生长良好，在低于普通培养基或LB的较低营养浓度(1/2,1/4)细菌存活和数量保持更长时间。
如图3所示，可耐受5％氯化钠，最适盐度范围0.5％-3.0％。
如图4所示，在30℃河水中可繁殖，24h后菌量可达最大值并可维持超过84小时。河水取自温州温瑞塘河。
(5)对常用抗生素敏感(K-B法)
表1微小杆菌对抗生素敏感程度表
Figure BDA0002680195750000051
实施例2：用菌直接处理污水：将过夜培养的细菌培养物，经离心后取菌直接混入污水中。
如图5所示，按5％接种量将105CFU/mL细菌接种至模拟水样(含 10％脱脂牛奶)，30℃静置72小时蛋白降解率大于90％。
如图6所示，按5％接种量将105CFU/mL细菌接种至模拟水样(含 10％大豆蛋白)，30℃静置48小时蛋白降解率大于90％。
将过夜培养的细菌配制成108cfu/ml溶液，以每10L水中加入0. 5-1ml菌液(最终菌液浓度为103-4/L)，混匀，25℃静置48-72小时模拟水样牛奶蛋白和大豆蛋白降解率可大于90％。
将过夜培养的细菌配制成108cfu/ml溶液，以每10L水中加入0. 5-1ml菌液(最终菌液浓度为103-4/L)，混匀，25℃静置72小时河水中添加牛奶蛋白和大豆蛋白降解率大于90％。
实施例3
粗酶液制备：将过夜培养的细菌以5％接种量，103CFU/mL的WHX-1 接种至发酵培养基中，37℃摇床180rpm培养48h，4℃8000rpm离心 10min，上清用除菌滤器过滤后为粗酶液。
粗酶液处理模拟动物蛋白(脱脂牛奶)和植物蛋白(豆浆：黄豆与水比例为20mg/ml)污水2h，不同时间蛋白降解情况见表2，表2 中每次粗酶液的用量为20ul，每次蛋白酶K的用量为20ul50μg/mL 的蛋白酶K。蛋白降解率随反应时间均呈现先升高后平稳的趋势，粗酶液的蛋白降解率高达66.0％(动物蛋白)和38.7％(植物蛋白)。
表2粗酶液对模拟污水蛋白降解作用
Figure BDA0002680195750000061
粗酶液对致病菌的抑制作用。
在96孔板中，每孔加入100μL的2×LB肉汤，然后分别加入用无菌生理盐水稀释到105CFU/mL致病菌菌液50μL，再加入50μL粗酶液。以无菌生理盐水及LB为空白对照，以50μL生理盐水替代粗酶液为生长对照，100μL的LB和50μL粗酶液及50μL生理盐水为阴性对照，37℃培养18h，测定OD600。抑制率＝{(生长对照－空白对照)－(实验孔－阴性对照)}/(生长对照－空白对照)×100％。实验结果见表4。可见，粗酶液对水中致病菌均具有抑制作用，对沙门菌和志贺菌的抑制率较高。
表3粗酶液对致病菌的抑制作用
抑制率(％) 粗酶液
甲型副伤寒沙门菌 70.1
鼠伤寒沙门菌 52.0
福氏志贺菌 76.5
宋内志贺菌 43.3
铜绿假单胞菌 56.7

Claims (6)

1.一株金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum)WHX-1，于2018年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16733。
2.权利要求1所述的金橙黄微小杆菌WHX-1在处理生活污水中的应用。
3.权利要求1所述的金橙黄微小杆菌WHX-1在降解蛋白中的应用。
4.一种金橙黄微小杆菌蛋白粗酶液，其特征在于：将权利要求1所述的金橙黄微小杆菌WHX-1接种发酵，离心收集上清液，即为金橙黄微小杆菌蛋白粗酶液。
5.权利要求4所述的金橙黄微小杆菌蛋白粗酶液在处理生活污水中的应用。
6.权利要求4所述的金橙黄微小杆菌蛋白粗酶液在降解蛋白中的应用。
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