CN101811779A - 耐盐净污菌剂的制备方法及其菌剂 - Google Patents
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Abstract
一种耐盐净污菌剂的制备方法及其菌剂，属于含盐废水生物处理技术领域。耐盐净污菌剂的制备方法，其中，1)将耐盐净污菌试管种接种于营养琼脂培养基中培养；2)将上述培养好的菌种，按培养基重量的1％-2％的接种量接入到预设容积量的发酵罐培养基中，培养至对数生长期；3)发酵罐生产过程中，无菌空气的通气量为4.0-6.0升/分钟，搅拌速度为60-120转/分钟，培养温度为25℃-40℃，全流程培养时间为24-48小时，发酵完成后培养液分装，或采用无菌附着物吸附、干燥，制成固体菌剂。菌剂的菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCC No.3314。本发明采用生物强化技术，大大提高含盐废水处理能力，成本低，效果显著。
Description
技术领域
本发明属于含盐废水生物处理技术领域，特别是涉及一种耐盐净污菌剂的制备方法及其菌剂。
背景技术
目前，许多常规的物理、化学和生化的方法可以应用于含盐废水处理，但由于海水成分的复杂性以及不同性质的含盐废水中污染物结构的特点，而使含盐废水处理与陆源污水处理产生较大的差异，尤其是高盐度的影响，增加了污水处理的难度。
经研究发现，高浓度无机盐对废水生物处理的毒害作用主要是通过升高的环境渗透压而破坏微生物的细胞膜和菌体内的酶，从而破坏微生物的生理活动。另外，废水中的盐度使废水的密度增加，造成废水与微生物的比重差减小，菌胶团絮体难以沉降，使得活性污泥容易上浮流失，出水水质变坏。
一般微生物不具有耐盐、嗜盐特点，不具有净化含盐污水能力，具备耐盐、嗜盐性的细菌分离和培养不容易，不易产业推广应用；
已知技术，如已公开的中国专利申请200810100231.4复合型活菌生物净水剂及其制备方法，该生物净水剂包含枯草芽孢杆菌KX-1 CCTCC NO.M 208057、枯草芽孢杆菌KX-2 CCTCC NO.M 208058、枯草芽孢杆菌KX-4 CCTCC NO.M 208060，且总菌数大于1×108CFU/G。该生物净水剂能有效去除水中氨氮和亚硝酸盐，改善水体污染；降解有机大分子，减轻水中富营养程度；并且上述的三株菌能将水体内的有机大分子物质分解成动植物能吸收的糖类、氨基酸、维生素、生物活性物质(激素)等，实现营养互补、协调共生，在水中增殖形成一个复杂而稳定的微生物系统。
又如已公开的中国专利200410081504.7一种处理炼油废水的微生物菌剂、其制备方法及其应用，针对目前废水处理中处理效率不高和处理后仍含难降解污染物等缺点，本菌剂包括0-10∶0-10∶0-10∶0-10∶0-10∶0-10的红球菌属、微小杆菌属、芽孢杆菌、假丝酵母和短状杆菌等菌种，通过活化培养后处理炼油废水，具有处理效果好，使用方便等优点。
再如已公开的中国专利申请200910029185.8一种高盐工业废水BOD的快速测定方法，取10克高盐废水排污口污泥，加入90毫升无菌生理盐水，在牛肉膏蛋白胨培养基平板划线分离，37℃培养2天，直至获得纯的耐盐菌菌株；将菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，恒温振荡箱中振荡培养24小时，4500转/分钟离心5分钟，0.9％的氯化钠溶液洗涤得耐盐菌；将5毫克碳纳米管分散在水中形成5毫克/毫升的碳纳米管悬液；耐盐菌以磷酸盐缓冲液配成0.2克/毫升菌悬液；菌悬液以体积比1∶2与碳纳米管悬液混合，30毫升的混合液均匀涂布于孔径为0.2M的纤维素薄膜上，凉置至半干，固定于溶氧电极上形成BOD电极；将溶解氧分析仪设置为自动测量，以雷磁数据采集软件即时记录输出电流。
已知技术不能解决含盐废水的净化处理问题，而生物强化处理技术具有高效、稳定、节省投资的特点，因此高效菌种和菌剂的研制是业界的期待，市场亟待一种微生物耐盐净污菌剂问世，以提供海水净化的新途径。
发明内容
本发明所要解决的问题在于，克服袭用技术存在的上述缺陷，而提供一种耐盐净污菌剂的制备方法及其菌剂。
本案首要目的是提供一种耐盐净污菌剂的制备方法。
本案又一目的是提供一种前述方法制得的耐盐净污菌剂。
本案提供的耐盐净污菌菌株是采取以下技术方案来实现的：
一种耐盐净污菌菌株，其中：它保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCC No.3314。保藏时间2009.9.29，存活；
本案提供的耐盐净污菌菌株还可以采取以下技术方案来实现：
前述的耐盐净污菌菌株，其中：所述耐盐净污菌的菌株16S rDNA序列为：
1 gggggacttg acatgattac gactcgtcct cggttcccgg cgatcctctg gagattagag
61 tttgatcctg gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgagcgcag
121 gaaaccgtct gaaccctccg gggggacgac ggcggaatga gcggcggacg ggtgagtaac
181 acgtaaagaa cctgcccata ggtctgggat aaccacgaga aatcggggct aataccggat
241 gtgtcatcgg accgcatggt ccgctgatga aaggcgcttc ggcgtcgccc atggatggct
301 ttgcggtgca ttagctagtt ggtggggtaa cggcccacca aggcgacgat gcatagccga
361 cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca
421 gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgaacgatg
481 aaggctttcg ggtcgtaaag ttctgttgta agggaagaac aagtgccgca ggcaatggcg
541 gcaccttgac ggtaccttgc gagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa
601 tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgca ggcggcctct
661 taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggc cattggaaac tgggaggctt
721 gagtatagga gagaagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag
781 gaacaccagt ggcgaaggcg actctttggc ctataactga cgctgaggcg cgaaagcgtg
841 gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaggtgt
901 tggagggttt ccgcccttca gtgctgaagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta
961 cggtcgcaag gctgaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg tggagcatgt
1021 ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaactctt gacatccccc tgaccggtac
1081 agagatgtac cttccccttc gggggcaggg gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct
1141 cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgtcc ttagttgcca
1201 gcattaagtt gggcactcta gggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga
1261 cgtcaaatca tcatgcccct tatgagttgg gctacacacg tgctacaatg gacggtacaa
1321 agggcagcga agccgcgagg tggagccaat cccagaaggc cgttctcagt tcggattgca
1381 ggctgcaact cgcctgcatg aagtcggaat cgctagtaat cgcaggtcag catactgcgg
1441 tgaatacgtt cccgggtctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgcaacaccc
1501 gaagtcggtg aggtaaccgt aaggagccag ccgccgaagg tggggcagat gattggggtg
1561 aagtcgtaac aaggtagccg taatcgtcca cttgccgtca tgctcttgca ctgcgtcacg
1621 c
前述的耐盐净污菌菌株，其中：所述耐盐净污菌的最大耐盐度为10％。
前述的耐盐净污菌菌株，其中：所述耐盐净污菌的主要生物学特性为革兰氏阳性，幼龄培养物为杆状，老培养物为球状，有鞭毛，菌体大小0.5×3.0微米；在营养琼脂上菌落平坦，橙黄色，边缘整齐。
前述的耐盐净污菌菌株，其中：所述耐盐净污菌，接触酶、过氧化氢酶、硝酸盐的任一种还原反应均为阳性。
前述的耐盐净污菌菌株，其中：所述耐盐净污菌氧化酶、脲酶试验、吲哚反应均为阴性。
前述的耐盐净污菌菌株，其中：所述耐盐净污菌利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖和其他一些糖类产酸。
前述的耐盐净污菌菌株，其中：所述耐盐净污菌适宜的pH值在5.5-10之间，适宜生长温度为35℃。
前述耐盐净污菌菌株，其中：耐盐净污菌DNA的G+C含量为49.0mol％。
本发明耐盐净污菌菌株之用途解决现有技术问题的是采取以下技术方案来实现的：
前述任一耐盐净污菌菌株的用途，其中：用于含盐废水处理。
本案耐盐净污菌菌株之用途解决现有技术问题还可以采用以下技术措施来进一步实现：
前述的耐盐净污菌菌株的用途，其中：用于海水利用后的废水处理。
前述任一耐盐净污菌菌株的用途，其中：将该菌株制备成微生物制剂后用于含盐废水处理。
前述任一耐盐净污菌菌株的用途，其中：将该菌株制备成微生物制剂后用于海水利用后的废水处理。
本发明耐盐净污菌剂的制备方法解决现有技术问题的是采取以下技术方案来实现的：
一种耐盐净污菌剂的制备方法，其中，菌剂通过以下方法生产而成：
1)将耐盐净污菌试管种接种于营养琼脂培养基中，培养温度为25℃-40℃、振荡速度为120-180转/分钟，摇瓶振荡培养至对数期；
2)将上述培养好的菌种，按培养基重量的1％-2％的接种量接入到预设容积量的发酵罐培养基中，培养至对数生长期；
3)发酵罐生产过程中，无菌空气的通气量为4.0-6.0升/分钟，搅拌速度为60-120转/分钟，培养温度为25℃-40℃，全流程培养时间为24-48小时，发酵完成后培养液分装，或采用无菌附着物吸附、干燥，制成固体菌剂。
本案耐盐净污菌剂的制备方法解决现有技术问题还可采用以下技术措施来进一步实现：
前述耐盐净污菌剂的制备方法，其中，步骤1)所述耐盐净污菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCC No.3314；
前述耐盐净污菌剂的制备方法，其中，步骤1)中耐盐净污菌试管种接种于营养琼脂培养基中的培养温度为25℃-30℃或31℃-35℃或36℃-37℃或37℃-40℃的任一范围值；
前述耐盐净污菌剂的制备方法，其中，步骤1)所述的耐盐净污菌试管种接种于营养琼脂培养基中的摇瓶振荡的速度为120-150转/分钟或150-160转/分钟或116-170转/分钟或170-180转/分钟的任一范围值；
前述耐盐净污菌剂的制备方法，其中，步骤2)中所述耐盐净污菌的接种量为培养基重量百分比的1％-1.5％或1.5％-2％的任一范围值；
前述耐盐净污菌剂的制备方法，其中，步骤3)中所述的无菌空气通气量为4.0升/分钟或5.0升/分钟或6.0升/分钟的任一范围值；
前述耐盐净污菌剂的制备方法，其中，步骤3)中所述搅拌速度为60-90转/分钟或90-120转/分钟的任一范围值；
前述耐盐净污菌剂的制备方法，其中，步骤3)中所述培养温度为25℃-30℃或30℃-35℃或35℃-40℃的任一范围值；
前述耐盐净污菌剂的制备方法，其中，步骤3)中所述全流程培养时间为24-30小时或30-36小时或36-42小时或42-48小时的任一范围值；
前述耐盐净污菌剂的制备方法，其中，所述营养琼脂培养基包括：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％，琼脂1.5％，pH7.2；
前述耐盐净污菌剂的制备方法，其中，所述发酵罐用的培养基包括：蛋白胨0.5％、酵母提取物0.1-0.5％或0.5％-1％、高磷酸铁0.001％、原海水pH7.0-7.5；
前述耐盐净污菌剂的制备方法，其中，所述耐盐净污菌为微小杆菌属(Exiguobacterium sp.NY0931)，主要生物学特性为革兰氏阳性，幼龄培养物为杆状，老培养物为球状，有鞭毛，菌体大小0.5×3.0微米；在营养琼脂上菌落平坦，橙黄色，边缘整齐。
前述耐盐净污菌剂的制备方法，其中，所述耐盐净污菌，接触酶、过氧化氢酶、硝酸盐还原反应为阳性，氧化酶、脲酶试验、吲哚反应为阴性；利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖和其他一些糖类产酸。
前述耐盐净污菌剂的制备方法，其中，所述耐盐净污菌适合pH值在5.5-10之间，适于生长温度为35℃或36℃或37℃任一种。
前述耐盐净污菌剂的制备方法，其中，所述耐盐净污菌，适合pH值在5.5-6.5或6.6-7.5或7.6-8.5或8.6-9.5或9.6-10任一范围值。
前述耐盐净污菌剂的制备方法，其中，所述耐盐净污菌，最适pH值在6或7或8或9的任一值；
前述耐盐净污菌剂的制备方法，其中，所述耐盐净污菌DNA的G+C含量为49.0mol％。
前述耐盐净污菌剂的制备方法，其中，所述耐盐净污菌16S rDNA序列：即对分离得到的菌株16S rDNA序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，碱基序列如下：
1 gggggacttg acatgattac gactcgtcct cggttcccgg cgatcctctg gagattagag
61 tttgatcctg gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgagcgcag
121 gaaaccgtct gaaccctccg gggggacgac ggcggaatga gcggcggacg ggtgagtaac
181 acgtaaagaa cctgcccata ggtctgggat aaccacgaga aatcggggct aataccggat
241 gtgtcatcgg accgcatggt ccgctgatga aaggcgcttc ggcgtcgccc atggatggct
301 ttgcggtgca ttagctagtt ggtggggtaa cggcccacca aggcgacgat gcatagccga
361 cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca
421 gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgaacgatg
481 aaggctttcg ggtcgtaaag ttctgttgta agggaagaac aagtgccgca ggcaatggcg
541 gcaccttgac ggtaccttgc gagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa
601 tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgca ggcggcctct
661 taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggc cattggaaac tgggaggctt
721 gagtatagga gagaagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag
781 gaacaccagt ggcgaaggcg actctttggc ctataactga cgctgaggcg cgaaagcgtg
841 gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaggtgt
901 tggagggttt ccgcccttca gtgctgaagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta
961 cggtcgcaag gctgaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg tggagcatgt
1021 ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaactctt gacatccccc tgaccggtac
1081 agagatgtac cttccccttc gggggcaggg gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct
1141 cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgtcc ttagttgcca
1201 gcattaagtt gggcactcta gggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga
1261 cgtcaaatca tcatgcccct tatgagttgg gctacacacg tgctacaatg gacggtacaa
1321 agggcagcga agccgcgagg tggagccaat cccagaaggc cgttctcagt tcggattgca
1381 ggctgcaact cgcctgcatg aagtcggaat cgctagtaat cgcaggtcag catactgcgg
1441 tgaatacgtt cccgggtctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgcaacaccc
1501 gaagtcggtg aggtaaccgt aaggagccag ccgccgaagg tggggcagat gattggggtg
1561 aagtcgtaac aaggtagccg taatcgtcca cttgccgtca tgctcttgca ctgcgtcacg
1621 c
前述耐盐净污菌剂的制备方法，其中，发酵罐生产过程中，发酵完成后培养液直接用塑料包装桶分装，或采用活性炭吸附制成固体菌剂。
本发明耐盐净污菌剂的制备方法制得菌剂之用途解决现有技术问题的是采取以下技术方案来实现的：
前述任一项耐盐净污菌剂的制备方法制得菌剂的用途，其中：用于含盐废水处理。
本案耐盐净污菌剂的制备方法制得菌剂之用途解决现有技术问题还可以采用以下技术措施来进一步实现：
前述的耐盐净污菌剂的制备方法制得菌剂的用途，其中：用于海水利用后的废水处理。
本发明与现有技术相比具有显著的优点和有益效果。由以上技术方案可知，本发明的技术措施至少有如下的优点：
本案耐盐净污菌的成功分离恰恰可以解决含盐污水处理中长期困扰的难题，本案耐盐净污菌分离方法简单，又耐盐、嗜盐细菌来源广泛，分离和培养也较容易，随着培养技术的发展，它们可以利用许多有机物(包括难降解和有毒物质)作为其碳源，因此，本案耐盐净污菌作为耐盐、嗜盐高效净污微生物菌剂的生物材料，具有优异的产业推广和应用价值。
本案菌剂的制备措施进一步配置，可使菌剂的制造成本更低廉，更有益于产业推广应用；由本案的耐盐净污菌剂制备方法得到的菌剂特别能满足海水利用后废水(主要是冲厕海水)的净化处理的实际问题和需求，使用本菌剂能够快速启动新建含盐污水处理设施的生物净化能力和恢复恶化的生物系统的强化处理能力。
本案耐盐净污菌NY0931具有良好的有机物去除效果，实验室摇瓶试验结果表明，污水化学需氧量(COD)去除率达到70％以上。小型污水处理装置试验结果表明，用本发明生产的菌剂直接投加至污水处理装置中，可以使化学需氧量(COD)的去除率由原来的75％左右提高到90％以上。
可见，本发明所述的用于含盐废水治理的微生物制剂，针对目前常规污水处理技术不能有效地处理含盐废水的情况，采用本案的优秀生物强化技术，通过向污水处理设施中投加本案的菌剂，可大大缩短污泥驯化时间、显著提高处理效果，可有效节省投资和运行成本，从而解决当前含盐废水生物处理中存在的出水水质差和污泥驯化时期过长等迫切需要解决的问题。
本发明对比现有技术有显著的贡献和进步，确实是具有新颖性、创造性、实用性的好技术。
本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
图1是本发明菌体原子力显微镜照片；
图2是本发明耐盐净污菌最适pH值示意图；
图3是本发明耐盐净污菌最适温度示意图；
图4是本发明耐盐净污菌最适摇床转速示意图；
图5是本发明耐盐净污菌最佳接种量示意图；
图6是本发明耐盐净污菌最佳通气量示意图；
图7是本发明耐盐净污菌最佳培养时间示意图；
图8是本案制备方法中发酵培养基中酵母提取物的最佳浓度示意图；
图9是本发明耐盐净污菌耐盐性示意图；
图10是本发明对人工污水化学需氧量(COD)的去除示意图；
图11是本发明CAST装置出水化学需氧量(COD)和去除率随运行周期的变化示意图。
具体实施方式
以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提供的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。
参见图1-11所示，本案涉及组分引用重量百分比，下不赘述。
一种耐盐净污菌，该生物材料保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC No.3314，保藏时间2009.9.29，存活，见保藏证明；图1是菌体原子力显微镜照片；
该耐盐净污菌的具体描述如下：
该耐盐净污菌经鉴定为微小杆菌属(Exiguobacterium sp.NY0931)，主要生物学特性为革兰氏阳性，幼龄培养物为杆状，老培养物为球状，有鞭毛，菌体大小0.5×3.0微米；在营养琼脂上菌落平坦，橙黄色，边缘整齐；
所述耐盐净污菌，接触酶、过氧化氢酶、硝酸盐的任一种还原反应均为阳性；其氧化酶、脲酶试验、吲哚反应均为阴性；利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖和其他一些糖类产酸。参见耐盐净污菌NY0391生理生化特征表。所述耐盐净污菌适宜的pH值在5.5-10之间，优选适宜生长温度为35℃。所述耐盐净污菌DNA的G+C含量为49.0mol％；其中，“G+C含量”是通常指的“DNA分子中鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)所占的摩尔百分比值”
耐盐净污菌NY0391生理生化特征
该菌株16SrDNA的Genbank登陆号为GQ451843。
对分离得到的菌株16SrDNA序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，聚合酶链式反应(PCR)产物送上海生工测序，碱基序列如下：
1 gggggacttg acatgattac gactcgtcct cggttcccgg cgatcctctg gagattagag
61 tttgatcctg gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgagcgcag
121 gaaaccgtct gaaccctccg gggggacgac ggcggaatga gcggcggacg ggtgagtaac
181 acgtaaagaa cctgcccata ggtctgggat aaccacgaga aatcggggct aataccggat
241 gtgtcatcgg accgcatggt ccgctgatga aaggcgcttc ggcgtcgccc atggatggct
301 ttgcggtgca ttagctagtt ggtggggtaa cggcccacca aggcgacgat gcatagccga
361 cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca
421 gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgaacgatg
481 aaggctttcg ggtcgtaaag ttctgttgta agggaagaac aagtgccgca ggcaatggcg
541 gcaccttgac ggtaccttgc gagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa
601 tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgca ggcggcctct
661 taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggc cattggaaac tgggaggctt
721 gagtatagga gagaagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag
781 gaacaccagt ggcgaaggcg actctttggc ctataactga cgctgaggcg cgaaagcgtg
841 gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaggtgt
901 tggagggttt ccgcccttca gtgctgaagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta
961 cggtcgcaag gctgaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg tggagcatgt
1021 ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaactctt gacatccccc tgaccggtac
1081 agagatgtac cttccccttc gggggcaggg gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct
1141 cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgtcc ttagttgcca
1201 gcattaagtt gggcactcta gggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga
1261 cgtcaaatca tcatgcccct tatgagttgg gctacacacg tgctacaatg gacggtacaa
1321 agggcagcga agccgcgagg tggagccaat cccagaaggc cgttctcagt tcggattgca
1381 ggctgcaact cgcctgcatg aagtcggaat cgctagtaat cgcaggtcag catactgcgg
1441 tgaatacgtt cccgggtctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgcaacaccc
1501 gaagtcggtg aggtaaccgt aaggagccag ccgccgaagg tggggcagat gattggggtg
1561 aagtcgtaac aaggtagccg taatcgtcca cttgccgtca tgctcttgca ctgcgtcacg
1621 c
NCBI分析结果表明，NY0931菌株的16SrDNA序列与Exiguobacterium sp.多个菌株的序列同源性在99％以上。
该耐盐净污菌的最大耐盐度为10％，说明它具有耐盐、嗜盐的高效性能，参见图9，随着培养基中NaCl浓度的不断增加，菌株NY0931的生长速度变慢，当NaCl浓度大于10％时，培养48h，菌株NY0931的生长明显受到抑制，说明其有较强的耐盐能力，最大耐盐度为10％。
一种耐盐净污菌剂的制备方法，其中，菌剂通过以下方法生产而成：
步骤1)将耐盐净污菌试管种接种于营养琼脂培养基中，
培养温度为25℃-40℃、振荡速度为120-180转/分钟，摇瓶振荡培养至对数期；营养琼脂培养基可以是一般市售品；
步骤1进一步的实施例是：
优选的营养琼脂培养基具有：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％，琼脂1.5％，pH7.2，余量为惯常的添加剂不予赘述；
所述耐盐净污菌为前述的保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌种，保藏编号为CGMCC No.3314；
所述耐盐净污菌试管种接种于营养琼脂培养基中的培养温度优选为25℃-30℃或31℃-35℃或36℃-37℃或38-40℃的任一范围值；
参见图3，试验表明，在温度为20℃～40℃时，菌株都能生长良好，且在温度为35℃时，生物量达到最大。
所述的耐盐净污菌试管种接种于营养琼脂培养基中的摇瓶振荡的速度优选为120-150转/分钟或150-160转/分钟或160-170转/分钟或170-180转/分钟的任一范围值；
参见图4，试验表明摇床转速对菌株生长的影响，摇瓶振荡的速度过低不利于菌株NY0931的生长，随着转速加快，细胞生物量增多，但过高的转速容易使培养液溢出，因此，适宜的菌株培养转速为120-180转/分钟，最佳的转速为160转/分钟。
步骤2)将上述培养好的菌种，按培养基重量的0.5％-2％的接种量接入到预设容积的发酵罐中，发酵罐中有预设量的培养基，如将上述培养好的菌种，按1％的接种量接入到预设容积量的发酵罐中，如10升发酵罐，培养至对数生长期；
步骤2进一步的实施例是：
优选的发酵罐所用的培养基具有：蛋白胨0.5％、酵母提取物为0.1-0.5％或0.5％-1％、高磷酸铁0.001％、原海水、pH7.0-7.5，余量为惯常的添加剂不予赘述；
所述耐盐净污菌的接种量与培养基的重量百分比优选为1％-1.5％或1.5％-2％的任一范围值；
参见图5，此试验表明了耐盐净污菌的接种量对制备菌剂的影响。当培养24h后，随着接种量增加，菌剂生长量变化不大，因此，菌剂发酵的适宜接种量在1-2％均可，但结合成本因素，选择1％接种量可有效降低成本；
步骤3)发酵罐生产过程中，无菌空气的通气量为4.0-6.0升/分钟，搅拌速度为60转/分钟120转/分钟，培养温度为25℃-40℃，全流程培养时间为24-48小时，发酵完成后培养液分装，或采用无菌附着物吸附、干燥，制成固体菌剂。
步骤3进一步的实施例是：
所述的无菌空气通气量优选为4.0升/分钟或5.0升/分钟或6.0升/分钟的任一范围值；
参见图6，试验表明通气量对菌种发酵的影响较大，其中，通气量为4.0-6.0升/分钟时，菌剂生长良好。
搅拌速度优选为120-150转/分钟或150-180转/分钟的任一范围值；
培养温度优选为25℃-30℃或31℃-35℃或36℃-40℃的任一范围值；
所述全流程培养时间优选为24-30小时或30-36小时或36-42或42-48小时任一范围值；
参见图7，试验表明，随着发酵培养时间的增加，菌体不断生长，其中，发酵时间为24-48小时时，菌剂处于最佳的生长状态。
所述发酵罐用的培养基包括：蛋白胨0.5％、酵母提取物0.1-1％、高磷酸铁0.001％、原海水，pH7.0-7.5；
参见图8，试验表明酵母提取物浓度对菌剂发酵有较大的影响，其中，酵母提取物浓度在酵母提取物为0.1-0.5％或0.5％-1％范围时，菌剂生长良好。
所述耐盐净污菌适合pH值在5.5-10之间，适于生长温度还可以进一步优选为35℃或36℃或37℃任一种。
所述耐盐净污菌，适合pH值优选在5.5-6.5或6.6-7.5或7.6-8.5或8.6-9.5或9.6-10任一范围值。
所述耐盐净污菌，最适pH值优选在6或7或8或9的任一值；
参见图2，试验表明菌株NY0931适应pH值范围较广，在初始pH值5.5～10.0范围均能内能良好生长。
发酵完成后还可以：培养液直接用塑料包装桶分装，或采用活性炭吸附制成固体菌剂。
由前述方法制得菌剂用于含盐废水处理，污水净化效果显著。
由前述方法制得菌剂用于海水利用后的废水处理，污水净化效果显著。
由前述各实施例制得的耐盐净污菌剂应用于含盐污水或海水利用后的废水处理，而且不断进一步的菌剂制备措施配置，可使菌剂的制造成本更低廉，更有益于产业推广应用，有下述试验可说明本案耐盐净污菌剂净化含盐污水的优异效果。
1.实验室摇瓶试验
从污染海滩泥样中分离出菌株NY0931，
将活化后的NY0931菌液按1％接种量转接到100mL没有灭菌的人工污水中(250mL三角瓶)，37℃、160转/分钟摇床培养24小时后离心取上清液，测定化学需氧量(COD)值。参见图10可知，与空白相比较，人工污水化学需氧量(COD)值显著降低，化学需氧量(COD)去除率达到72％，说明菌株NY0931对人工污水具有较好的净化效果。
2.NY0931菌剂对污水处理装置的生物强化作用
利用含盐污水处理装置进行生物强化处理试验，该中试装置采用先进的循环式活性污泥法(CAST)污水处理工艺，PLC编程自动控制。经过半年多运行试验表明(参见图11)，进水化学需氧量(COD)在300mg/L左右的条件下，生物强化前，化学需氧量(COD)去除率在70％左右，将NY0931发酵菌液离心后按1％的比例投加至主反应池中，经过三次强化投加，化学需氧量(COD)去除率达到了90％以上，且稳定运行，说明投加耐盐净污菌NY0931可以强化污水处理装置的生物净化能力，生物强化效果显著。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (18)
1.一种耐盐净污菌剂的制备方法，其特征在于，菌剂通过以下方法生产而成：
1)将耐盐净污菌试管种接种于营养琼脂培养基中，培养温度为25℃-40℃、振荡速度为120-180转/分钟，摇瓶振荡培养至对数期；
2)将上述培养好的菌种，按培养基重量的1％-2％的接种量接入到预设容积量的发酵罐培养基中，培养至对数生长期；
3)发酵罐生产过程中，无菌空气的通气量为4.0-6.0升/分钟，搅拌速度为60-120转/分钟，培养温度为25℃-40℃，全流程培养时间为24-48小时，发酵完成后培养液分装，或采用无菌附着物吸附、干燥，制成固体菌剂。
2.如权利要求1所述耐盐净污菌剂的制备方法，其特征在于，步骤1)所述耐盐净污菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCC No.3314。
3.如权利要求2所述耐盐净污菌剂的制备方法，其特征在于，步骤1)中耐盐净污菌试管种接种于营养琼脂培养基中的培养温度为25℃-30℃或31℃-35℃或36℃-37℃或37℃-40℃的任一范围值。
4.如权利要求2或3所述耐盐净污菌剂的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的耐盐净污菌试管种接种于营养琼脂培养基中的摇瓶振荡的速度为120-150转/分钟或150-160转/分钟或116-170转/分钟或170-180转/分钟的任一范围值。
5.如权利要求4所述耐盐净污菌剂的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述耐盐净污菌的接种量为培养基重量百分比的1％-1.5％或1.5％-2％的任一范围值。
6.如权利要求5所述耐盐净污菌剂的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述的无菌空气通气量为4.0升/分钟或5.0升/分钟或6.0升/分钟的任一范围值。
7.如权利要求6所述耐盐净污菌剂的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述搅拌速度为60-90转/分钟或90-120转/分钟的任一范围值。
8.如权利要求7所述耐盐净污菌剂的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述培养温度为25℃-30℃或30℃-35℃或35℃-40℃的任一范围值。
9.如权利要求8所述耐盐净污菌剂的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述全流程培养时间为24-30小时或30-36小时或36-42小时或42-48小时的任一范围值。
10.如权利要求9所述耐盐净污菌剂的制备方法，其特征在于，所述发酵罐用的培养基包括：蛋白胨0.5％、酵母提取物0.1-0.5％或0.5％-1％、高磷酸铁0.001％、原海水pH7.0-7.5。
11.如权利要求10所述耐盐净污菌剂的制备方法，其特征在于，发酵罐生产过程中，发酵完成后培养液直接用塑料包装桶分装，或采用活性炭吸附制成固体菌剂。
12.如权利要求1-11之一所述制备方法制得的耐盐净污菌剂，其特征在于，耐盐净污菌为微小杆菌属(Exiguobacterium sp.NY0931)，主要生物学特性为革兰氏阳性，幼龄培养物为杆状，老培养物为球状，有鞭毛，菌体大小0.5×3.0微米；在营养琼脂上菌落平坦，橙黄色，边缘整齐。
13.如权利要求12所述耐盐净污菌剂，其特征在于，所述耐盐净污菌，接触酶、过氧化氢酶、硝酸盐还原反应为阳性，氧化酶、脲酶试验、吲哚反应为阴性；利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖和其他一些糖类产酸。
14.如权利要求13所述耐盐净污菌剂，其特征在于，所述耐盐净污菌适合pH值在5.5-10之间，适于生长温度为35℃或36℃或37℃任一种。
15.如权利要求14所述耐盐净污菌剂，其特征在于，所述耐盐净污菌DNA的G+C含量为49.0mol％。
16.如权利要求15所述耐盐净污菌剂，其特征在于，所述耐盐净污菌，适合pH值在5.5-6.5或6.6-7.5或7.6-8.5或8.6-9.5或9.6-10任一范围值。
17.如权利要求16所述耐盐净污菌剂，其特征在于，所述耐盐净污菌，最适pH值在6或7或8或9的任一值。
18.如权利要求17所述耐盐净污菌剂，其特征在于，
所述耐盐净污菌16S rDNA序列：
1 gggggacttg acatgattac gactcgtcct cggttcccgg cgatcctctg gagattagag
61 tttgatcctg gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgagcgcag
121 gaaaccgtct gaaccctccg gggggacgac ggcggaatga gcggcggacg ggtgagtaac
181 acgtaaagaa cctgcccata ggtctgggat aaccacgaga aatcggggct aataccggat
241 gtgtcatcgg accgcatggt ccgctgatga aaggcgcttc ggcgtcgccc atggatggct
301 ttgcggtgca ttagctagtt ggtggggtaa cggcccacca aggcgacgat gcatagccga
361 cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca
421 gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgaacgatg
481 aaggctttcg ggtcgtaaag ttctgttgta agggaagaac aagtgccgca ggcaatggcg
541 gcaccttgac ggtaccttgc gagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa
601 tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgca ggcggcctct
661 taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggc cattggaaac tgggaggctt
721 gagtatagga gagaagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag
781 gaacaccagt ggcgaaggcg actctttggc ctataactga cgctgaggcg cgaaagcgtg
841 gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaggtgt
901 tggagggttt ccgcccttca gtgctgaagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta
961 cggtcgcaag gctgaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg tggagcatgt
1021 ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaactctt gacatccccc tgaccggtac
1081 agagatgtac cttccccttc gggggcaggg gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct
1141 cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgtcc ttagttgcca
1201 gcattaagtt gggcactcta gggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga
1261 cgtcaaatca tcatgcccct tatgagttgg gctacacacg tgctacaatg gacggtacaa
1321 agggcagcga agccgcgagg tggagccaat cccagaaggc cgttctcagt tcggattgca
1381 ggctgcaact cgcctgcatg aagtcggaat cgctagtaat cgcaggtcag catactgcgg
1441 tgaatacgtt cccgggtctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgcaacaccc
1501 gaagtcggtg aggtaaccgt aaggagccag ccgccgaagg tggggcagat gattggggtg
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