CN108102943B - 一种脱氮微生物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株可用于高效脱除皮革废水中氨氮的微生物，命名为产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）TN‑10，于2017年4月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国武汉，保藏编号CCTCC NO:M2017193。此菌株是从皮革废水中筛选得到，本发明发现的产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）TN‑10可高效快速降解皮革废水中的氨氮，净化水质，减少含氮污染物对环境中水生生物的危害，具有广阔的应用前景。

Description

一种脱氮微生物及其应用
技术领域
本发明属于环境微生物及其应用领域。具体涉及一株产酸克雷伯菌以及该菌株在废水氨氮降解中的应用。
背景技术
随着工业的发展和人民生活水平的提高，城市污水和工业废水中的氮含量急剧上升。江河、湖泊等受纳水体中的氮含量已远远超过水体的自净能力，造成水体污染，引起地下水物质含量超标和地表水富营养化等现象。藻类可以在氮含量过高的水体中大量繁殖，使得水体中的溶解氧含量下降，造成鱼类的大量死亡，藻类死亡后在水体中厌氧发酵，使得水体腐败，恶臭。大量排放的含氮废水已经危害到农业、渔业、旅游业等诸多行业，对饮水卫生和食品安全也构成了巨大威胁。在废水氮素污染治理方面，生物法脱氮应用最广。
传统的自养型的硝化菌生长缓慢，成为污水脱氮的限制性因素。目前发现的异养硝化菌不仅具有高效脱除氨氮的作用，还具有生长速度快、高耐溶氧以及对环境适应力强等有点，使其在生物脱氮过程中具有重大的应用前景。但异养硝化细菌的研究起步晚，受现实环境中的复杂因素和实际运用中的许多问题，其工艺流程仍处于实验室的小试阶段，需进行大量的研究，才能尽早实现其在工业上的应用。
本研究发现的产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)TN-10能够高效快速脱除氨氮，为异养硝化菌的理论研究和应用提供材料，也为开发新的氮污染物净化技术提供新的理论和思路。
发明内容
本发明的目的在于克服传统自养硝化菌脱氮的技术缺陷，旨在开发一种高效脱氮菌及其简单实用的培养方法，为制革废水中氨氮的去除提供一种高效、安全、实用的生物技术。
为实现上述目的，本发明人从制革废水中筛选出一株高效脱氮的菌株产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)TN-10。
本发明通过以下技术方案实现：一株产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)TN-10，分离自制革废水，于2017年4 月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，保藏号CCTCC NO: M2017193。
本发明进一步公开了产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)TN-10在废水快速脱氮的应用。其中的快速脱氮指的是快速降解水体中的氨氮，在36h内对含有105.35mg/L氨氮的模拟废水降解率达到96.45％。
本发明进一步公开了产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)TN-10的开放培养方法，其特征在于该菌剂发酵流程是：甘油管菌种→菌种活化→脱氮培养→氨氮含量的检测；其中甘油管菌种：产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)TN-10，保藏号在甘油管中加入0.3mL丙三醇，121℃，灭菌20min，将菌种接种在基础培养基中，30℃，150 rpm/min，培养24h作为种子液,然后取0.7mL种子液放入灭菌后的甘油管中，摇匀，在-80℃条件下保藏。所述的基础培养基为(g/L)：丙酮酸钠7， (NH4)2SO4 0.5；FeSO4·7H2O 0.4；MgSO4 0.5；NaCl 1；K2HPO4 1，蒸馏水1000mL, pH为7.0菌种活化：取甘油管菌种1mL接入经过灭菌的含50mL基础培养基的三角瓶中，在30℃，150rpm/min条件下培养24h脱氮培养：取活化的菌种1mL接入经过灭菌的含100mL发酵培养基的三角瓶中在30℃，150rpm/min，培养36h；所述的发酵培养基为(g/L)：丙酮酸钠7， (NH4)2SO4 0.5；FeSO4·7H2O 0.4；MgSO4 0.5；NaCl 1；K2HPO4 1，蒸馏水1000mL, pH为7.0。
氨氮含量的检测：取1mL经过36h发酵的培养液，使用纳氏试剂法测其中的氨氮含量。
氨氮降解率的计算：发酵培养液发酵前后氨氮含量的变化来计算脱氮效率。其计算的公式如下：氨氮降解率(％)＝[(C1-C2)/C1]*100公式中的C1是发酵前培养基中氨氮的质量浓度；而C2则是发酵后培养基中氨氮的质量浓度。
本人更加详细的技术内容如下：(1)产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)TN-10的形态学特征：该菌为无芽孢杆菌；菌落为圆形，边缘整齐，呈乳脂色，半透明，凸起，表面光滑，粘稠，以接种环挑之，出现拉丝现象；单个排列，偶遇二联体(2)16S rDNA序列：GTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAA TGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCT AATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTG CCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCAC CTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAA CTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCA CAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTC GGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGATAAGGTTAATAACCTT GTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCA GCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAA GCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACC TGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTGGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGG CGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGG GGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTC GACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGG GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGC CTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGT GAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCC AGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGG AAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACA CGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGG ACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATG AAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTC CCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGGCTAATA CCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCAT CAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAG GCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGA GACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAAT GGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGG TTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGATAAGGTTAATAACCTTGTC GATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCC GCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCG CACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGG GAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTGGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAAT TCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCG AAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGG AGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGACT TGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGA CCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGG GCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAA CCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTT CGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGA AATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAG CGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAA GGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACG TGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGAC CTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGA AGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCC CGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTG
本发明的有益效果：本发明提供的产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)TN-10 能在较短时间内有效降解废水中的氨氮，为异养硝化菌的理论研究和应用提供材料，也为开发新的氮污染物净化技术提供新的理论和思路。
附图说明
图1为经过24h发酵后培养基中氨氮的降解率。
图2为生物保藏证明。
具体实施方式
实施例1：脱氮微生物的筛选(1)菌株来源：制革废水(2)富集培养方法：将采取的5mL水样放入到含100mL(0.5g/L(NH4)2SO4) 培养基的250ml三角瓶(经过121℃，20min灭菌)中，在30℃、150rpm/min 的条件下富集培养1-2d,取1mL富集培养液到新的(NH4)2SO4浓度为1g/L的培养基中，保持培养条件不变，培养1-2d，重复以上步骤，直到培养基的(NH4)2SO4浓度为2.5g/L(3)筛选：取上述富集的培养液，进行梯度稀释，涂布到含有2.5g/L(NH4)2SO4的平板上，培养1-2d，挑选单菌落进行下一步筛选。从平板上挑取200株长势优良的纯菌落，分别接种到含0.5g/L(NH4)2SO4的培养基中，摇瓶培养24h，测定氨氮的降解率。将脱氮率最高的菌株进行16S rDNA鉴定，命名为产酸克雷伯菌 (Klebsiella oxytoca)TN-10。并将菌株送至中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2017193，保藏地点为中国武汉。
实施例2：产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)TN-10降解废水中的氨氮 (1)种子液的制备：取-80℃保藏的菌株甘油管储存液以1％(V/V)的接种量接种于种子培养基中，置于30℃摇床，150rpm震荡培养24h；(2)发酵实验：取1mL种子液接种到含100mL(0.5g/L(NH4)2SO4)培养基的250ml三角瓶(经过121℃，20min灭菌)中，在30℃摇床，150rpm/min震荡培养24h；(3)氨氮含量的测定：经过24h发酵，测定发酵培养基中的氨氮含量。按氨氮降解率公式计算出降解率为96.45％(图1)。

Claims (4)

1.一株产酸克雷伯菌 (Klebsiella oxytoca) TN-10，分离自制革废水，于2017年4月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国武汉，保藏编号CCTCC NO:M2017193。
2.权利要求1所述产酸克雷伯菌TN-10在废水氨氮降解中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括种子培养步骤，所述种子培养步骤为：取-80℃保藏的甘油管菌种，按体积比1%的接种量接种至种子培养基，在30℃，150 rpm下培养24 h获得种子液；所述种子培养基组分如下：丙酮酸钠 7 g/L，(NH4)2SO4 0.5 g/L；FeSO4·7H2O 0.4 g/L；MgSO4 0.5 g/L；NaCl 1 g/L；K2HPO4 1 g/L，蒸馏水1000mL；pH为7.0。
4.根据权利要求2-3任一项所述的应用，其特征在于，应用于降解制革废水中的氨氮。
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