CN114107127B - 一株能降解脂多糖并高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌d1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株能降解脂多糖并高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)D1菌株，该菌株于2021年11月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：62088。该菌株具有显著的脂多糖降解能力，在8h对60EU的脂多糖去除率高达97％，将其配制成发酵液后其降解效果显著优于只含菌体的菌液，同时D1菌株还能高产蛋白酶，通过福林酚法复筛测量蛋白酶活性达60.77U/mL。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌D1菌株不仅能高效降解脂多糖还高产蛋白酶，为降解脂多糖的微生物菌株提供一种新的降解菌。

Description

一株能降解脂多糖并高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌D1及其 应用

技术领域

本发明属于微生物降解技术领域。更具体地，涉及一株能降解脂多糖并高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌D1及其应用。

背景技术

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为芽孢杆菌属，是革兰氏阳性好氧细菌，广泛分布于自然界，能抑制多种真菌和细菌。由于芽孢杆菌可以形成芽孢的特性，故芽孢杆菌对环境动荡具有极强的抵抗力，芽孢杆菌可以在胃肠道中发芽、生长和繁殖。在缺乏营养或不良环境时，芽孢杆菌可以生成芽孢来增强抗逆性进入消化道，其芽孢在在肠道内发芽可以迅速消耗肠道中残留氧气，维持肠道内厌氧环境。芽孢杆菌作为益生菌增强宿主健康的机制包括刺激免疫系统，合成不同的抗菌素，如细菌素，促进其他有益微生物的生长，抑制病原体及其诱导的肠道黏膜炎症反应，还能产生淀粉酶、蛋白酶等消化酶有助于消化和减少过敏原。芽孢杆菌产生的蛋白酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性对病原菌具有拮抗功能，产生的高活性中性蛋白酶、糖化酶、纤维素酶和脂肪酶具有防腐、增加酱香型大酱风味物质等功能。

细菌内毒素(Endotoxin)，是G^-菌细胞壁外层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。细菌内毒素的主要化学成分为脂多糖。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的组成成分，是由脂质和多糖构成的物质(糖脂质)，它包含O特异链、核心多糖和类脂A三个部分，类脂A由2个葡萄糖脂、磷酸盐和一定量的脂肪酸组成。内毒素可以通过快速诱导细胞生物合成和释放促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)和其他生物活性代谢物，引起机体发热、内皮细胞损伤、肠道屏障功能改变，导致全身性炎症反应综合征和脓毒症发生，严重者可导致低血压、中毒性休克、弥漫性血管内凝血、急性呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭甚至死亡。在非感染条件下，少量的LPS也会从肠道转运到循环中，可以引起低度炎症，导致代谢综合征的发生(主要指肥胖，高血糖，高血压，血脂异常，高血黏稠性，高尿酸，高脂肪肝发生，高胰岛素血症，还包括一组动脉粥样硬化的症候群)。

目前对于解淀粉芽孢杆菌的研究大多集中于研究其产酶能力上，其产蛋白酶的能力很强，也有研究表明解淀粉芽孢杆菌可以用于降解脂肪、亚硝酸盐、玉米赤霉烯酮、降解含氮化合物以及酸性蓝、铬黑T、刚果红等染料等，均是筛选出不同的解淀粉芽孢杆菌株，其具有的作用也不相同。迄今为止，鲜有关于微生物菌株能降解脂多糖的研究报道，大多旨在减少工业上的污染，如现有技术公开了一株未确定分类地位的芽孢杆菌SL-187在工业污泥减量减毒中的应用，该芽孢杆菌在用于在污泥减量减毒与无害化处理(龚小娟,张大伟,姜怡勤,习昌雄.一种芽孢杆菌在工业污泥减量减毒中的应用[P].江苏省：2021-08-06.)；邓媛等利用黑曲霉产生的柚苷酶处理不同浓度的内毒素，发现内毒素降解率呈递增趋势，截止到60min，5EU/mL的内毒素降解率为79.9％(邓媛,毛勇,杨国武,李飞,李皎,张美丽,etal.黑曲霉TC-01产柚苷酶分离纯化及其降解内毒素研究初探.中国食品添加剂2018:80-86.)，目前还未发现其他不同的微生物菌株能用于降解内毒素或脂多糖。因此筛选获得能降解脂多糖的菌株是微生物降解脂多糖的新策略办法，在医药、工业等领域都具有很好的应用价值。

发明内容

本发明提供一株能降解脂多糖并高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌，为降解脂多糖提供更多更高效的菌株选择。

本发明的目的是提供一种能降解脂多糖并高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌D1菌株。

本发明的第二个目的是提供所述菌株D1的应用。

本发明的第三个目的是提供一种脂多糖降解菌剂。

本发明的第四个目的是提供一种降解脂多糖的方法。

本发明的第五个目的是提供一种高产蛋白酶的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一株能降解脂多糖并高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)D1菌株，所述菌株于2021年11月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏编号为GDMCC NO：62088；其菌株D1的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

本发明从巴楚菇中分离获得解淀粉芽孢杆菌D1菌株，菌落呈白色、半透明、边缘整齐、中央与边缘颜色一致，湿润，凸起，易挑取菌落为乳白色，在显微镜下该菌株呈杆状，适宜生长温度范围30～37℃，适宜生长pH范围5～7。菌株D1通过16S rRNA鉴定引物PCR扩增后，再进行TA克隆测序，通过NCBI的进行BLAST比对，结果表明该菌株与Bacillusamyloliquefaciens 16SrRNA序列相似性超过99.8％，通过用邻接法构建的进化树显示的结果，结合16S rRNA序列比对结果，最终鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

本发明通过牛奶平板法初筛溶蛋白圈和福林酚法复筛测量蛋白酶活性获得了一株解淀粉芽孢杆菌D1能高产中性蛋白酶，蛋白酶活性高达60.77U/mL。本发明研究表明，采用解淀粉芽孢杆菌D1发酵产物的稀释溶液，通过鲎试剂动态显色法处理60EU的脂多糖在0h、4h和8h，可以在体外显著降低脂多糖的浓度，对脂多糖的去除超过97％。

因此，解淀粉芽孢杆菌D1菌株或其发酵上清液在制备脂多糖降解菌剂中的应用，以及在降解脂多糖中的应用均在本发明的保护范围之内。

本发明提供一种脂多糖降解菌剂，含解淀粉芽孢杆菌D1菌株发酵液。

优选地，所述发酵液为去除菌体的上清液。

优选地，所述发酵液浓度为1.0×10⁵～1.0×10¹⁰CFU/mL。

本发明提供一种降解脂多糖的方法，其特征在于，采用解淀粉芽孢杆菌D1菌株在培养基上进行发酵培养，取发酵后的菌液对脂多糖进行处理。

优选地，菌株在培养基中添加量为0.1％～0.5％，发酵条件为30～37℃，8～24h。

更优选地，菌株在培养基中添加量为0.2％，发酵条件为37℃，12h。

优选地，所述发酵后的菌液为去除菌体的上清液。

本发明还提供一种高产蛋白酶的方法，采用所述解淀粉芽孢杆菌D1菌株接种到TSB培养基中，培养条件为35～40℃，24～48h。

优选地，培养条件为37℃，48h。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的一株能降解脂多糖并高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)D1菌株，该菌株具有显著的脂多糖降解能力，在8h对60EU的脂多糖去除率高达97％，将其配制成发酵液后其降解效果显著优于只含菌体的菌液，同时D1菌株还能高产蛋白酶，通过福林酚法复筛测量蛋白酶活性高达60.77U/mL。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌D1菌株不仅能高效降解脂多糖还高产蛋白酶，为降解脂多糖的微生物菌株提供一种新的降解菌。

附图说明

图1为菌株在牛奶培养基的溶蛋白圈；

图2为菌株的菌落图；

图3为菌株的用邻接法构建的进化树；

图4为自动分析仪0h的内毒素标曲；

图5为自动分析仪4h的内毒素标曲；

图6为自动分析仪8h的内毒素标曲；

图7为降解脂多糖检测结果(注：TSB为没有接种菌的培养基，D1为只含有菌体的无菌水浊液，Supernatant为去除菌体的上清液)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中采用的培养基配方如下：

TSA培养基：胰蛋白胨17g/L，大豆蛋白胨3g/100L，氯化钠5g/L，K₂HPO₄ 2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，琼脂15g/L，用蒸馏水配制而成。

TSB培养基：胰蛋白胨17g/L，大豆蛋白胨3g/100L，氯化钠5g/L，K₂HPO₄ 2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，用蒸馏水配制而成。

实施例1菌株的筛选和鉴定

(1)菌株的筛选：

样品来自于新疆喀什地区的巴楚菇，称取巴楚菇1g，放置在含有99mL的无菌三级水中，置于室温200rpm/min的摇床中6h，使微生物得到充分分散，此三角瓶中的菌悬液的菌浓度即为原始样品的10^-2倍。采用梯度稀释的方法，将适宜稀释度的菌悬液涂布在TSA培养基上，平板倒置放在37℃培养箱培养24h，依据菌落形态，在TSA培养基上多次划线纯化，获得纯化菌株。纯化后菌株分别涂布于用于初筛含有10％脱脂牛奶琼脂培养基平板上，37℃培养3天，观察透明圈的有无，结果如图1所示，为解淀粉芽孢杆菌在牛奶琼脂培养基上的透明圈，产生透明圈后分别测量透明圈和菌落的直径并计算其比值，选择比值较大的菌株进行复筛。

取初筛获得的蛋白酶菌株分别接种到TSB培养基中，37℃，180rpm培养48h，用福林(Folin)法测定(参照《中华人民共和国行业标准》SB/T 10317-1999蛋白酶活力测定法)，其原理是蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，经过福林酚法复筛测量蛋白酶活性获得了一株高产中性蛋白酶的菌株，其产的蛋白酶活性高达60.77U/mL。从中选择出酶活力最高的菌株作为目的菌株，进行革兰氏染色和生理生化鉴定。

(2)形态学鉴定：

将菌株接种于培养基平板上37℃倒置培养24h，观察其菌落形态。菌株在培养基培养24h的菌落形态如图2所示，呈现白色半透明，菌体饱满湿润并凸起，菌株通过革兰氏染色呈阳性，经测定该菌的适宜生长温度范围30～37℃，适宜生长pH范围5～7。

(3)TA克隆生物学鉴定：

纯化后的菌株于TSB培养基培养活化24h后，菌株通过16S rRNA鉴定引物27f：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和1492r：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，经过PCR扩增后，把PCR产物通过TA克隆测序，结果在NCBI数据库通过BLAST进行比对，其菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，比对结果显示菌株与Bacillus amyloliquefaciens菌株相似性达99.8％，同时利用Mega软件邻接法进行进化树构建结果如图3所示，最终D1菌株分类地位确定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。基于上述鉴定结果，将该菌株命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)D1菌株，并于2021年11月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：62088，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2菌株D1的降解脂多糖实验

(1)脂多糖检验方法：

采用鲎试剂动态显色法，来自湛江安度斯生物有限公司的鲎试剂。

(2)降解率定义为：

可降解成分中，已降解部分的质量占可降解成分初始质量的百分比。

(3)菌株培养：

配制TSB培养基，将30g TSB粉末放入1L无菌水中混匀，将其放入至试管中，每管为5mL，灭菌后以0.2％的接种量将D1接入，在37℃，180rmp摇床中培养12h。

(4)样品处理：

脂多糖来源于湛江安度斯细菌内毒素工作标准品60EU。

从培养好的菌液中吸取5mL的菌液至于去热源的离心管中，离心条件为4000rmp，10min，将上清液转移到去热源的试管中，菌泥用无LPS的无菌水重悬3次洗去残留培养基，并用无脂多糖的无菌水补足5mL。

实验的处理组为：只含有D1菌体的无菌水浊液、去除菌体的上清液Supernatant；对照组为：没有接入菌液的空白TSB培养基。

分别取菌液上清液，菌液沉淀物置于TSB培养基内，准备TSB空白培养基，各加入1mL 60EU的脂多糖中，在30～37℃条件下分别反应0h、4h和8h；分别取0h反应后溶液、4h反应后溶液和8h反应后溶液分别稀释200倍、400倍以及800倍稀释液，然后各取0.1mL的稀释后的溶液，加到除热原微孔板内，每一浓度加3孔，再分别加入0.1mL鲎试剂，采用中速振摇10s混匀后，将微孔板放入已预热好的内毒素自动分析仪ELx808中进行检测，同时建立标准曲线，采用0.005EU/mL、0.05EU/mL、0.5EU/mL和5EU/mL浓度的标准内毒素，每一浓度内毒素溶液至少3个平行孔，阴性对照平行2孔，检测的结果取三个平行处理的结果平均值。制作的标准曲线如图4～6所示，用于计算内毒素浓度。

实验结果如图7所示，在0h时TSB培养基(未去除脂多糖)和60EU的脂多糖总共含脂多糖83.21EU，在8h中脂多糖有小幅度降低(p<0.05)，8h后脂多糖含量为72.48EU；在D1组中，8h处理脂多糖后，脂多糖含量由78.87EU仅降低至62.78EU，是由于在D1组中只含有菌体和无菌水，其芽孢杆菌无法进行正常的代谢，所以无法降解脂多糖；而在上清液组中，0h处理脂多糖后，脂多糖含量迅速降低至34.11EU，随着处理时间的增加，4h处理脂多糖后，脂多糖含量显著降低至4.19EU；8h时脂多糖几乎全部降解，为2.24EU，脂多糖降解率超过97％，结果表明解淀粉芽孢杆菌D1的发酵上清液可以显著降解脂多糖。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 一株能降解脂多糖并高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌D1及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1511

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）D1菌株(SIPOSequenceListing1.0)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120

cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat gcttgtttga 180

accgcatggt tcaaacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240

cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300

ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360

gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420

cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt 480

gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540

gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600

gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660

gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720

agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840

tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900

aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960

ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag 1020

gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080

agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140

tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200

atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat gggcagaaca aagggcagcg 1260

aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320

tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1380

tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440

gaggtaacct ttttggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500

acaaggtagc c 1511

Claims (10)

1.一株能降解脂多糖并高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)D1菌株，其特征在于，所述菌株于2021年11月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCC NO：62088。

2.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌D1菌株或其发酵上清液在制备脂多糖降解菌剂中的应用。

3.一种脂多糖降解菌剂，其特征在于，含权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌D1菌株和/或其发酵液。

4.根据权利要求3所述降解菌剂，其特征在于，所述发酵液为去除菌体的上清液。

5.根据权利要求3所述降解菌剂，其特征在于，所述发酵液浓度为1.0×10⁵～1.0×10¹⁰CFU/mL。

6.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌D1菌株或其发酵上清液在降解脂多糖中的应用。

7.一种降解脂多糖的方法，其特征在于，采用权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌D1菌株在培养基上进行发酵培养，取发酵后的菌液对脂多糖进行处理。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，菌株在培养基中添加量为0.1％～0.5％，发酵条件为30～37℃，8～24h。

9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述发酵后的菌液为去除菌体的上清液。

10.一种高产蛋白酶的方法，其特征在于，将权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌D1菌株接种到TSB培养基中，培养条件为35～40℃，24～48h。

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