CN114480214A - 一株西藏阿里牦牛奶疙瘩中分离的副干酪乳杆菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株西藏阿里牦牛奶疙瘩中分离的副干酪乳杆菌及应用。本发明提供的副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA‑1菌株(Lactobacillus paracasei AL1 Plateau LPA‑1)，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 20211312。本发明提供的副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA‑1菌株由西藏阿里地区牦牛奶疙瘩中分离得到，此菌产生的代谢产物可以产生抑制肠道有害菌的物质。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株副干酪乳杆菌及应用。
背景技术
副干酪乳杆菌是益生菌的一类，被应用于食品、医药、饲料及保健品中。副干酪乳杆菌作为一种优良益生菌，对高脂饮食引起的肠屏障受损有积极的改善和修复作用,可有效改善宿主的肠道环境、抑制有害菌的生长、提高免疫力、调节肠道黏膜屏障功能，为宿主健康生长提供保证。利用副干酪乳杆菌可以抑制有害菌生长的这一特性，深入挖掘益生菌改善肠道功能。
人体的健康与肠道内的益生菌群结构息息相关。肠道菌群在长期的进化过程中，通过个体的适应和自然选择，菌群中不同种类之间，菌群与宿主之间，菌群、宿主与环境之间，始终处于动态平衡状态中，形成一个互相依存，相互制约的系统，因此，人体在正常情况下，菌群结构相对稳定，对宿主表现为不致病。肠道菌中的有害菌数量一旦失控大量生长，就会引发多种疾病，产生致癌物等有害物质，或者影响免疫系统的功能。
有害菌占优势菌株会导致：排泄不顺畅，肠内囤积粪便、蠕动过快或太慢、产生有害物质、再次地吸收对身体有害的物质、病原体容易侵入等不良症状。副干酪乳杆菌可以用于抗菌,特别是抑制沙门氏菌、金黄葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、福氏志贺氏菌及鼠伤寒沙门氏菌。
现有技术CN111286474A公开了一种副干酪乳杆菌，该现有技术中用牛津杯琼脂扩散法检测该副干酪乳杆菌对微生物的抑制作用，其中，该副干酪乳杆菌对沙门氏菌的抑菌圈为13.63mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈为11.84mm。
发明内容
针对现有技术中的微生物对致病细菌的抑制作用较差的问题，本发明提供一株具有抑制细菌作用的副干酪乳杆菌。
第一方面，本发明提供一株副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1菌株(Lactobacillus paracasei AL1 Plateau LPA-1)，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 20211312。
优选地，所述副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1菌株的16S rDNA基因序列如SEQID NO：1所示。
第二方面，本发明提供所述的副干酪乳杆菌菌剂的发酵制备方法，所述制备方法包括培养所述的副干酪乳杆菌菌株。
优选地，所述制备方法包含如下步骤：
(1)将所述的副干酪乳杆菌菌株放大培养；
(2)将步骤(1)得到的产物加入到液体培养基中，在35-38℃条件下发酵培养。
第三方面，本发明提供一种菌剂，所述菌剂通过所述的发酵制备方法得到。
第四方面，本发明提供所述的副干酪乳杆菌菌株或所述的菌剂发酵获得的发酵产物。
优选地，所述发酵产物具有抑制细菌能力；
优选地，所述细菌为革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌；
优选地，所述细菌为沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌。
第五方面，本发明提供所述的发酵产物的制备方法，所述制备方法包括培养所述的副干酪乳杆菌菌株或所述的菌剂。
第六方面，本发明提供所述的副干酪乳杆菌菌株或所述的菌剂或所述的发酵产物在制备具有抑制细菌作用或改善肠道产品中的应用。
优选地，所述产品为食品、药物、保健品及饲料。
本发明提供的副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1菌株分离自西藏阿里地区牦牛奶疙瘩。经过实验验证本发明提供的副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1菌株可抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，所得的试验结果证明该菌株具有较强的抑菌性，尤其是可以抑制肠道有害菌，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等，可广泛应用于可改善肠道的食品、医药、饲料及保健品中。
菌种保藏信息
本发明提供的副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1菌株(Lactobacillus paracaseiAL1 Plateau LPA-1)于2021年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 20211312，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：027-68754052。
附图说明
图1所示为副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1菌株菌落形态图；
图2所示为副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1菌株形态特征图；
图3所示为菌株LPA-1的系统发育树；
图4抑制沙门氏菌的抑菌圈图；
图5抑制金黄色葡萄球菌的抑菌圈图。
具体实施方式
本发明提供一株西藏阿里牦牛奶疙瘩中分离的副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1菌株。本发明提供的副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1菌株(Lactobacillus paracaseiAL1 Plateau LPA-1)于2021年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 20211312。
本发明提供的副干酪乳杆菌产生的代谢产物可以抑制肠道有害菌，尤其对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌具有较强的抑制效果，可广泛应用于可改善肠道的食品、医药、饲料及保健品中。
本发明实施例中所用仪器及试剂来源信息如下表1所示。
表1
实施例1菌株的筛选
取西藏阿里地区牦牛奶疙瘩样品，先使用选择培养基MRS和BL对菌进行初筛：称取适量样品用生理盐水溶解定容至10ml。将活化液振荡均匀，取活化液0.1mL至选择培养基上，进行稀释涂布，37℃培养48h，观察菌落形态特征，挑取单菌落，不断分离纯化，直到显微镜下看到纯菌落。随后在选择培养基中加入0.2％CaCO3进行复筛：将初筛得到的纯菌落，在复筛培养基中划线培养，培养24h-48h，结束培养后观察有无透明圈，选择透明圈大的单菌落进行革兰氏染色，经革兰氏染色后为紫色的菌株即为目的菌株。
得到的目的菌株呈乳白色，圆形，有光泽，表面光滑，有光泽，边缘规则，微凸起，不透明。图1所示为目的菌株菌落形态图；图2所示为目的菌株形态特征图。
实施例2分子生物学鉴定16S rRNA
使用高保真酶对实施例1得到的目的菌株进行16SrDNA测序及菌种鉴定，并绘出系统发育树。采用的引物为：正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'；反向引物1492R：5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应体系是：25μlMix；1μl样品；20μl ddH2O；2μl 27F；2μl 1492R；PCR反应温度：98℃，2min；98℃，10s，58℃，10s，72℃，7s，35x；72℃，2min；4℃保存。对得到的PCR产物测序，之后采用MEGA8.0构建系统发育树。系统发育树如图3。根据系统发育树可知该菌株为副干酪乳杆菌。
测得的副干酪乳杆菌的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO：1：
将获得的目的菌株命名为副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1菌株(Lactobacillusparacasei AL1 Plateau LPA-1)，并进行保藏，该副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1菌株(Lactobacillus paracasei AL1 Plateau LPA-1)于2021年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 20211312。
实施例3副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1菌株对沙门氏菌的抑制作用
将活化后的副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1菌株以5％(v/v)接种比例接入MRS液体发酵液，37℃培养，发酵液培养48h，将发酵48h的发酵液，1000rpm离心10min取上清，经过0.45μm的滤膜过滤得到发酵处理液。
将甘油管保存的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO：2所示的沙门氏菌在BS培养基上进行一次活化、二代活化、种子液制备，取100μl的沙门氏菌的种子液(1x108CFU/ml)涂布到BS培养基上，使用灭过菌并且烘干的牛津杯立在表面，A孔加入100μl的发酵处理液；B孔为空白对照，加入100μl的灭过菌的MRS液体培养基。48h观察并测量抑菌圈的大小。结果如图4所示，从图4可以看出：
(1)空白对照组(B孔)肉眼看不到抑菌圈，但是本发明提供的副干酪乳杆菌AL1Plateau LPA-1的发酵液(A孔)有明显的抑菌圈，测得抑菌圈直径为24±2mm。
(2)根据抑菌圈的大小可以看出副干酪乳杆菌的发酵液对沙门氏菌有明显的抑菌作用。
所述的沙门氏菌的16S rRNA基因序列SEQ ID NO：2如下所示：
实施例4副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1菌株对金黄色葡萄球菌的抑制作用
将活化后的副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1菌株以5％(v/v)接种比例接入MRS液体发酵液，发酵液37℃培养48h，将发酵48h的发酵液，1000rpm离心10min取上清，经过0.45μm的滤膜过滤到灭过菌并且烘干的离心管中备用。
将甘油管保存的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO：3所示的金黄色葡萄球菌在LB培养基上进行一次活化、二代活化、种子液制备，取100μl的金黄色葡萄球菌的种子液(1x108CFU/ml)涂布到LB培养基上，使用灭过菌并且烘干的牛津杯立在表面。A孔加入100μl的发酵处理液；B孔为空白对照，加入100μl的灭过菌的MRS液体培养基。48h观察并测量抑菌圈的大小。结果如图5所示。从图5可以看出：
(1)空白对照组(B孔)肉眼看不到抑菌圈，但是本发明提供的副干酪乳杆菌AL1Plateau LPA-1的发酵液(A孔)有明显的抑菌圈，测得抑菌圈直径20±2mm)。
(2)根据抑菌圈的大小可以看出副干酪乳杆菌的发酵液对金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用。
所述的金黄色葡萄球菌的16S rRNA基因序列SEQ ID NO：3如下所示：
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 西藏安琪生物科技有限公司
<120> 一株西藏阿里牦牛奶疙瘩中分离的副干酪乳杆菌及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1463
<212> DNA
<213> 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)
<400> 1
tttgtcactt agacggctcg ctcctaaaag ggttacgcca ccggcttcgg gtgttacaaa 60
ctctcatggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcgtgct 120
gatccgcgat tactagcgat tccgacttcg tgtaggcgag ttgcagccta cagtccgaac 180
tgagaatggc tttaagagat tagcttgacc tcgcggtctc gcaactcgtt gtaccatcca 240
ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct 300
tcctccggtt tgtcaccggc agtcttacta gagtgcccaa ctaaatgctg gcaactagtc 360
ataagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa 420
ccatgcacca cctgtcattt tgcccccgaa ggggaaacct gatctctcag gtgatcaaaa 480
gatgtcaaga cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc 540
ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt ttcaaccttg cggtcgtact ccccaggcgg 600
aatgcttaat gcgttagctg cggcactgaa gggcggaaac cctccaacac ctagcattca 660
tcgtttacgg catggactac cagggtatct aatcctgttc gctacccatg ctttcgagcc 720
tcagcgtcag ttacagacca gacagccgcc ttcgccactg gtgttcttcc atatatctac 780
gcatttcacc gctacacatg gagttccact gtcctcttct gcactcaagt ttcccagttt 840
ccgatgcgct tcctcggtta agccgagggc tttcacatca gacttaaaaa accgcctgcg 900
ctcgctttac gcccaataaa tccggataac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct 960
ggcacgtagt tagccgtggc tttctggttg gataccgtca cgccgacaac agttactctg 1020
ccgaccattc ttctccaaca acagagtttt acgacccgaa agccttcttc actcacgcgg 1080
cgttgctcca tcagacttgc gtccattgtg gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga 1140
gtttgggccg tgtctcagtc ccaatgtggc cgatcaacct ctcagttcgg ctacgtatca 1200
tcgccttggt gagccattac ctcaccaact agctaatacg ccgcgggtcc atccaaaagc 1260
gatagcttac gccatctttc agccaagaac catgcggttc ttggatctat gcggtattag 1320
catctgtttc caaatgttat cccccactta agggcaggtt acccacgtgt tactcacccg 1380
tccgccactc gttccatgtt gaatctcggt gcaagcaccg atcatcaacg agaactcgtt 1440
cgactgcatg tatagcaccg ccg 1463
<210> 2
<211> 1511
<212> DNA
<213> 沙门氏菌(salmonella)
<400> 2
aggatgacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgag cgaacagata aggagcttgc 60
tcctttgacg ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctacct ataagactgg 120
aataactccg ggaaaccggg gctaatgccg gataacatat agaaccgcat ggttctatag 180
tgaaagatgg ttttgctatc acttatagat ggacccgcgc cgtattagct agttggtaag 240
gtaacggctt accaaggcga cgatacgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg 300
aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatgggc 360
gaaagcctga cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaagggt ttcggctcgt aaaactctgt 420
tattagggaa gaacatatgt gtaagtaact gtgcacatct tgacggtacc taatcagaaa 480
gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga 540
attattgggc gtaaagcgcg cgtaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct 600
caaccgtgga gggtcattgg aaactgggaa acttgagtgc agaagaggaa agtggaattc 660
catgtgtagc ggtgaaatgc gcagagatat ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactttc 720
tggtctgtaa ctgacgctga tgtgcgaaag cgtggggatc aaacaggatt agataccctg 780
gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg 840
cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa actcaaagga 900
attgacgggg acccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa 960
ccttaccaaa tcttgacatc ctttgaccac tctagagata gagctttccc cttcggggga 1020
caaagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1080
ccgcaacgag cgcaaccctt aagcttagtt gccatcatta agttgggcac tctaggttga 1140
ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgat 1200
ttgggctaca cacgtgctac aatggacaat acaaagggca gctaaaccgc gaggtcatgc 1260
aaatcccata aagttgttct cagttcggat tgtagtctgc aactcgacta catgaagctg 1320
gaatcgctag taatcgtaga tcagcatgct acggtgaata cgttcccggg tcttgtacac 1380
accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac acccgaagcc ggtggagtaa ccatttatgg 1440
agctagccgt cgaaggtggg acaaatgatt ggggtgaagt cgtaacaagg tagccgtatc 1500
ggaaggtgcg g 1511
<210> 3
<211> 1491
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 3
cctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgaac ggtaacagga 60
agcagcttgc ctcttcgctg acgagtggcg gacgggtgag taatgtctgg gaaactgcct 120
gatggagggg gataactact ggaaacggta gctaataccg cataatgtcg caggaccaaa 180
gagggggacc ttcgggcctc ttgccatcag atgtgcccag atgggattag cttgttggtg 240
aggtaacggc tcaccaaggc gacgatccct agctggtctg agaggatgac cagccacact 300
ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg 360
gcgcaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg ccttcgggtt gtaaagtact 420
ttcagcgggg aggaagggga taaggctaat aaccttgttc attgacgtta cccgcagaag 480
aagcaccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcaa gcgttaatcg 540
gaattactgg gcgtaaagcg cacgcaggcg gtctgtcaag tcggatgtga aatccccggg 600
ctcaacctgg gaactgcatt cgaaactggc aggctggagt cttgtagagg ggggtagaat 660
tccaggtgta gcggtgaaat gcgtagagat ctggaggaat accggtggcg aaggcggccc 720
cctggacaaa gactgacgct caggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc 780
tggtagtcca cgccgtaaac gatgtctact tggaggttgt gcccttgagg cgtggcttcc 840
ggagctaacg cgttaagtag accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg 900
aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga 960
accttacctg gtcttgacat ccacagaagt ttgcagagat gcgaatgtgc cttcgggaac 1020
tgtgagacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgttg ggttaagtcc 1080
cgcaacgagc gcaaccctta tcctttgttg ccagcggtcc ggccgggaac tcaaaggaga 1140
ctgccagtga taaactggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgg cccttacgac 1200
cagggctaca cacgtgctac aatggcgcat acaaagagaa gcgacctcgc gagagcaagc 1260
ggacctcata aagtgcgtcg tagtccggac tggagtctgc aactcgactc catgaagtcg 1320
gaatcgctag taatcgtgga tcagaatgcc acggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1380
accgcccgtc acaccatggg agtgggtgca aaagaagtag gtagcttaac cttcgggagg 1440
gcgcttacca ctttgtgatt catgacttgg gtgaagtcgt aacaaggtag c 1491
Claims (10)
1.一株副干酪乳杆菌AL1 Plateau LPA-1菌株(Lactobacillus paracasei AL1Plateau LPA-1)，其特征在于，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 20211312。
2.权利要求1所述的副干酪乳杆菌菌株，其特征在于，所述副干酪乳杆菌AL1 PlateauLPA-1菌株的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO：1所示。
3.一种副干酪乳杆菌菌剂的发酵制备方法，其特征在于，所述制备方法包括培养权利要求1或2所述的副干酪乳杆菌菌株。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含如下步骤：
(1)将权利要求1或2所述的副干酪乳杆菌菌株放大培养；
(2)将步骤(1)得到的产物加入到液体培养基中，在35-38℃条件下发酵培养。
5.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂通过权利要求3或4所述的发酵制备方法得到。
6.权利要求1或2所述的副干酪乳杆菌菌株或权利要求5所述的菌剂发酵获得的发酵产物。
7.根据权利要求6所述的发酵产物，其特征在于，所述发酵产物具有抑制细菌能力；
优选地，所述细菌为革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌；
优选地，所述细菌为沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌。
8.根据权利要求7所述的发酵产物的制备方法，其特征在于，包括培养权利要求1或2所述的副干酪乳杆菌菌株或权利要求5所述的菌剂。
9.权利要求1或2所述的副干酪乳杆菌菌株或权利要求5所述的菌剂或权利要求6或7所述的发酵产物在制备具有抑制细菌作用或改善肠道产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述产品为食品、药物、保健品及饲料。
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2022
- 2022-03-07 CN CN202210217216.8A patent/CN114480214A/zh active Pending
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