CN109810918B - 一株对枸杞叶枯病有防效的萎缩芽孢杆菌、生物菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株对枸杞叶枯病有防效的芽孢杆菌，该菌株为拮抗芽孢杆菌LKYLW‑5，属于萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)，其16S rDNA核苷酸序列长度为1492bp，于2018年11月29日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCC No.16837。本发明的菌株是从枸杞种植区耕作土壤中经平板对峙培养筛选获得，可用于防治由链格孢菌Alternaria alternata引起的枸杞叶枯病，其可抑制枸杞叶枯病病菌菌丝生长和链格孢孢子的萌发，在枸杞植株接种枸杞叶枯病病原菌后预防防治效果为62.96％、治疗防治效果为60.15％；对枸杞叶枯病具有高效、显著的防治效果，是一种防效高，环境安全性好的生物防治潜力菌株，具有良好的开发应用前景。

Description

一株对枸杞叶枯病有防效的萎缩芽孢杆菌、生物菌剂及其 应用

技术领域

本发明涉及菌株领域，具体涉及一株对枸杞叶枯病有防效的萎缩芽孢杆菌、生物菌剂及其应用。

背景技术

枸杞既是传统名贵中药材，又是一种营养滋补品。在卫生部公布的63种药食两用的名单中，名列榜首。作为传统中药，枸杞性平味甘，具有滋补肝肾、益精明目、润肺的功效。通过化学成分分析，枸杞的果实检测出含有丰富的天然胡萝卜素、维生素C、枸杞蛋白多糖、甜菜碱、亚油酸以及铁、磷、钙等营养成分，有补虚安神、明目祛风、滋肾润肺以及护肝抗肿瘤等作用。

枸杞人工栽培时间长，病害发生种类多且危害严重。枸杞叶枯病，其病原为链格孢菌(Alternaria alternata)。枸杞叶枯病的田间症状主要表现为危害叶片，也可侵染叶柄和果实，叶片病斑长椭圆形，浅棕褐色，发病严重时病斑呈黑褐色，脱落，叶片枯死，叶柄病斑长梭形，深褐色，果实发病时呈黑褐色，腐烂。据申请人田间调查植株发病率为91.0％，病叶率为61.46％。

目前，枸杞病害的防治仍以化学防治为主，长期使用化学农药不仅使植物病原菌产生抗药性，同时造成农药的残留，杀伤天敌，污染环境，威胁人类健康，破坏生态平衡。利用拮抗微生物防治植物病害对人畜无毒，不污染环境，无残留，能保持农产优良品质，对害虫天敌和有益生物安全，有助于保持生态平衡等优点。

从枸杞种植区耕作土壤分离筛选获得的对枸杞叶枯病菌有拮抗作用的生防菌株，对于枸杞叶枯病的防治具有非常重要的意义。目前，应用拮抗微生物防治植物病害已经有很多的报道，但能够有效防治枸杞叶枯病的拮抗菌在国内外鲜有报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一株对枸杞叶枯病有防效的萎缩芽孢杆菌，和以所述芽孢杆菌为活性成分的生物菌剂,该菌株对枸杞叶枯病菌有拮抗作用，能够用于防治枸杞叶枯病，对环境友好，无生态污染。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：一株对枸杞叶枯病有防效的萎缩芽孢杆菌，其特征在于：该菌株为拮抗芽孢杆菌LKYLW-5，属于萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus，其16SrDNA核苷酸序列长度为1492bp，该菌株从枸杞种植区耕作土壤中分离得到，于2018年11月29日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCCNo.16837，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明所述拮抗枸杞叶枯病菌的芽孢杆菌菌株的形态特征：拮抗芽孢杆菌LKYLW-5为好氧菌，透过电镜显示LKYLW-5呈杆状，长约2μm，革兰氏阳性，周生鞭毛，芽孢呈椭圆形；在LB固体培养基上LKYLW-5菌落呈现乳白色，不透明，菌落光滑，中间凸起，有褶皱，边缘完整。

其中，每1000mL所述LB固体培养基含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂粉15g，pH7.0-7.2。

所述拮抗芽孢杆菌LKYLW-5的16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明对枸杞叶枯病菌具有拮抗作用的萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeusLKYLW-5的分离筛选方法包括以下步骤：

1)将采集的枸杞种植区耕作土壤称取10g，加入装有90mL无菌水并放有玻璃珠的250mL锥形瓶中，80℃水浴30min，再充分振荡30min，10倍倍比稀释，用无菌涂布棒涂于LB培养基平板上，以无菌水为对照；纯化的细菌经革兰氏染色和芽孢染色，显示菌体呈杆状、产芽孢、G+的分离物为芽孢杆菌；将采用上述方法分离得到的芽孢杆菌编号，观察菌落形态。

2)将已培养3d的枸杞叶枯病病原真菌(申请人从武威市凉州区长城乡枸杞种植区发病植株分离、鉴定获得)用5mm打孔器打孔，其中枸杞叶枯病菌菌饼的直径为5mm，将菌饼移到马铃薯琼脂培养基(PDA)中央，28℃培养24h后，在离真菌等距离的四周接上待测芽孢杆菌，放置于培养箱中，28℃恒温倒置对峙培养，每个对峙实验平行重复3次。

5d后观察并记录抑菌带的有无以及大小，选出对枸杞叶枯病菌具有最强抑制效果，抑菌带最宽的菌株。

本发明拮抗芽孢杆菌LKYLW-5的菌株的筛选及防治枸杞叶枯病菌特性测定采用的培养基如下：

筛选培养基成分：每1000mLLB培养基含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，pH 7.0-7.2。

发酵培养基成分：每1000mLLB液体培养基含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，pH7.0-7.2。

本发明的拮抗芽孢杆菌LKYLW-5的培养特性：拮抗芽孢杆菌LKYLW-5最高生长温度为45℃，最低生长温度为15℃，最适生长温度为25～30℃；最高pH值为10.0，最低pH值为4.0，最适pH值为7；具有耐盐性，可以在10％的NaCl培养基中生长。能氧化L-阿拉伯糖、甘露醇，产酸；能氧化葡萄糖，但不产气，而且卵黄水解呈阳性；但不能氧化D-木糖产酸。

本发明的拮抗芽孢杆菌LKYLW-5的分子生物学分类：拮抗芽孢杆菌LKYLW-5与Bacillus atrophaeus的16SrDNA序列同源性为98％，在GenBank注册的序列号为MF375906。从基于邻接法构建的16SrDNA系统发育树(如图5所示)可以发现；菌株LKYLW-5与菌株萎缩芽孢杆菌(NR024689.1)聚类在同一大分支内(支持率98％)，并结合菌株的形态学及生理生化特征，最终确定菌株LKYLW-5为萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus。

以上述拮抗芽孢杆菌LKYLW-5，微生物保藏号为CGMCCNo.16837为活性成分的生物制剂也属于本发明的保护范围。在需要的时候，该菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。

本发明拮抗芽孢杆菌菌种通过下述培养基培养得到的培养物、发酵液或发酵液的过滤液用于拮抗枸杞叶枯病菌的处理，所述液体培养基为LB培养基。

固体培养基按1.5％添加琼脂。高压灭菌后备用。

液体培养时将本发明的拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株先经过LB固体培养基活化，于28℃下培养36h，将经活化后的拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株接种于发酵培养基中于28℃下150r/min振荡培养24h，制成种子液，种子液按5％的接种量接入装有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，150r/min振荡培养28℃下，进行恒温发酵培养，培养3d后的发酵液可用于拮抗枸杞叶枯病菌，所述的拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌剂稀释至有效成分含量1.0×10⁶～1.0×10⁸cfu/mL后使用。

本发明的拮抗枸杞叶枯病菌的拮抗芽孢杆菌LKYLW-5在防治枸杞叶枯病方面的应用，所述应用包括抑制枸杞叶枯病病菌；致畸枸杞叶枯病病菌的菌丝；抑制枸杞叶枯病病菌的分生孢子的萌发，田间防病实验通过施用拮抗芽孢杆菌LKYLW-5发酵液也具有很好的防治效果。

抑制枸杞叶枯病病菌是指抑制枸杞叶枯病菌的生长，拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株对枸杞叶枯病菌链格孢菌的拮抗活性较好，抑菌带宽19.8mm，甚至培养10天后依然能保持较高的抑菌效果；拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株主要使菌丝体膨大变粗，生长畸形，菌丝顶端和分枝处较为膨大；菌丝分枝增多，粗而短；菌丝体内部细胞原生质体分布不均匀，浓缩成不规则体，部分菌丝内有原生质流出形成空壳的现象。拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株发酵液过滤液对枸杞叶枯病病菌孢子萌发有明显的抑制作用，孢子萌发抑制率为97.10％，EC50为6.76mL/L，拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株发酵液在枸杞植株接种枸杞叶枯病病原菌后预防防治效果为62.96％、治疗防治效果为60.15％。

本发明的拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株的发酵液中及发酵液过滤液中含有对枸杞叶枯病菌有高效抑制作用的活性成分，表明拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株在发酵培养过程中产生了对枸杞叶枯病菌有抑制作用、致畸作用的代谢产物。

本发明的拮抗芽孢杆菌LKYLW-5对温度、pH等自然环境条件的适应范围广，在10-45℃、pH 4-10的范围内都具有拮抗枸杞叶枯病菌的能力。本发明的菌株来源于枸杞种植区耕作土壤，容易培养和保持，能拮抗枸杞叶枯病菌。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1、本发明的拮抗枸杞叶枯病菌的拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株在防治枸杞叶枯病方面的作用极为显著，对枸杞叶枯病菌有很强的抑制作用，能明显抑制枸杞叶枯病菌菌丝的生长，并使菌丝畸形，也能明显抑制枸杞叶枯病菌孢子的萌发，具有很好的防治枸杞叶枯病菌引起的植物病害的潜力。它作为枸杞种植区耕作土壤中菌为防治由枸杞叶枯病菌引起的植物病害提供了一条环保、简单、有效的途径，利于环境保护。

2、本发明解决了目前枸杞叶枯病的病害日趋严重的问题，作为一种微生物农药，可减少化学农药的污染问题，并减弱致病病菌的抗药性问题。

3、本发明筛选出的拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株具有巨大的经济价值，能够为农民带来更大的经济效益。

以下通过附图说明和具体实施例对本发明的技术方案进一步详细说明。

附图说明

图1为本发明拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株的形态特征；图1中a：LKYLW-5菌株菌落；图1中b：LKYLW-5菌株革兰氏染色。

图2为本发明拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株在PDA培养基上对枸杞叶枯病菌链格孢的拮抗效果，图2中a：受拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株影响的链格孢，图2中b：正常生长的链格孢。

图3为本发明拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株抑制后链格孢菌丝的生长情况(400×)；图3中a：正常的链格孢菌丝；图3中b：拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株抑制的链格孢菌丝。

图4为本发明拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株发酵液过滤液对链格孢孢子萌发的抑制作用(400×)；图4中：a：正常的链格孢孢子萌发情况；图4中b：受LKYLW-5菌株发酵液过滤液抑制的链格孢孢子。

图5为本发明拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株的系统进化树。

图6为本发明拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株在酪蛋白培养基上的透明水解圈。

图7为本发明拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株在淀粉培养基上的透明水解圈。

图8为本发明拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株在纤维素培养基上的透明水解圈。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

下述实施例中的方法，无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1

本实施例的拮抗芽孢杆菌LKYLW-5的分离筛选方法及其鉴定如下所述。其中本实施例的菌株采自武威市凉州区长城乡枸杞种植区耕作土壤中。

1、拮抗芽孢杆菌LKYLW-5的筛选，该筛选过程包括以下步骤：

1)将采集的枸杞种植区耕作土壤称取10g，加入装有90mL无菌水并放有玻璃珠的250mL锥形瓶中，80℃水浴30min，再充分振荡30min，10倍倍比稀释，用无菌涂布棒涂于LB培养基平板上，以无菌水为对照。纯化的细菌经革兰氏染色和芽孢染色，显示菌体呈杆状、产芽孢、G+的分离物为芽孢杆菌。将采用上述方法分离得到的芽孢杆菌编号，观察菌落形态，其中每1000mL LB培养基含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，pH 7.0-7.2。

2)将已培养3d的枸杞叶枯病病原真菌(申请人从武威市凉州区长城乡枸杞种植区发病植株分离、鉴定获得)用5mm打孔器打孔，其中枸杞叶枯病菌菌饼的直径为5mm，将菌饼移到马铃薯琼脂培养基(PDA)中央，28℃培养24h后，在离真菌等距离的四周接上待测芽孢杆菌，放置于培养箱中，28℃恒温倒置对峙培养，每个对峙实验平行重复3次。

3)5d后观察并记录抑菌带的有无以及大小，选出对枸杞叶枯病菌具有最强抑制效果的1株菌株。结果表明LKYLW-5菌株的抑菌效果最好，抑菌带宽度最宽，抑菌带宽度达到19.8mm(如图2a)。

4)无菌操作从具有抑菌效果最明显的PDA平板上筛选出抑菌效果最明显(抑菌活性最强)的菌株进行纯化培养，获得一株对枸杞叶枯病菌具有强

拮抗作用的菌株LKYLW-5。

2、枸杞叶枯病菌拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株的鉴定

采用菌落形态观察、常规生理生化及分子生物学方法对LKYLW-5菌株进行鉴定，鉴定出该菌株属于萎缩芽孢杆菌。

1)拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株在LB培养基(1000mLLB培养基含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂粉15g，pH7.0-7.2)平板上呈乳白色，不透明，菌落光滑，中央隆起，有褶皱，边缘完整。

2)通过显微镜观察表明拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌体大小约0.5-0.8um×1.5-2.5um之间，无荚膜，有芽孢，周生鞭毛，能运动，革兰氏染色阳性(如图1a和图1b所示)。

3)生化实验结果表明，拮抗芽孢杆菌LKYLW-5具有运动性，好氧，V-P反应呈阳性，甲基红反应呈阳性，氧化酶反应呈阳性，接触酶反应呈阳性，能还原硝酸盐，水解淀粉和酪蛋白，能液化明胶，能氧化葡萄糖、L-阿拉伯糖、甘露醇产酸，不能氧化D-木糖产酸，氧化葡萄糖但不产气。能在0.5％-10％的NaCl浓度的LB培养液(每1000mL含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，pH 7.0～7.2)中生长。本实施例的拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株的生物学特性如表1所示。

表1拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株的基本生物学特性

革兰氏染色	+	接触酶	+
				淀粉水解	+	甲基红反应	+
需氧性测定	+	10％NaCl	+
				V-P测试	+	PH5.7	+
葡萄糖	+	温度生长范围	15℃-45℃
				阿拉伯糖	+	石蕊-牛奶	变红Red
形成吲哚	﹣	卵磷脂酶测定	+
				酪氨酸水解	﹣	硫化氢生成	+
甘露醇	+	酪蛋白水解	+
				硝酸盐还原	+	利用碳水化合物产酸	+
柠檬酸利用	+	V-P反应后pH值	6.77-7.33
				明胶	+	L-阿拉伯糖	+
最适生长pH	7	最适生长温度	28℃
				氧化酶试验	+	利用葡萄糖产气	﹣
丙二酸盐利用	+	pH生长范围	4-10
				D-木糖产酸	﹣

注：“+”表示阳性，“－”表示阴性。

4)拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株的分子生物学鉴定

16SrDNA基因序列测定及其系统进化树的构建。提取细菌基因组DNA为模板，以7f(5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3')和1540r(5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)为上、下游引物扩增菌株的16S rDNA。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后送往该公司进行序列测定。测得该菌株的16S rDNA核苷酸序列长度为1492bp(如SEQ ID NO:1所示)，GenBank登录号为MF375906。将该序列与GenBank中相关数据进行相似性分析，通过与NCBI中菌株的16SrDNA序列比对分析和系统发育树的构建(如图5所示)，可以发现：菌株LKYLW-5与萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus(GenBank登录号为NR024689.1)聚类在同一大分支内(支持率98％)，说明该菌株与萎缩芽孢杆菌菌株相似性最高。

综合菌株的培养特征、形态和生理生化特征及16SrDNA序列分析结果，最终确定LKYLW-5菌株为萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus。

实施例2

本实施例的拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株对枸杞叶枯病菌的拮抗作用进行如下实验。

对峙培养试验：将直径为5mm的新鲜的枸杞叶枯病菌(申请人从武威市凉州区长城乡枸杞种植区发病植株分离、鉴定获得)菌饼置于PDA平板中央，28℃培养24h后，在离真菌等距离的四周接上待测拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株，对照组为不接种拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株；将PDA平板放入28℃培养箱中进行对峙培养，培养5d后，观察拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株的拮抗效果。

对峙培养试验结果发现：对照组叶枯病菌生长正常(如图2b)，处理组即本发明筛选得到的拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株对枸杞叶枯病菌有很强的拮抗作用(如图2a)，抑菌带宽度达到19.8mm。

实施例3

拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株对枸杞叶枯病病原菌链格孢菌丝的影响。

采用平板对峙法，在PDA平板中央接病原真菌(申请人从武威市凉州区长城乡枸杞种植区发病植株分离、鉴定获得)菌饼，在距离中心3cm的两侧接种培养48h且生长良好的拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株，28℃倒置培养4d。观察靠近芽孢杆菌的抑菌圈边缘菌丝生长情况，以远离拮抗芽孢杆菌的边缘菌丝为对照，显微观察菌丝的生长情况，每次3个视野以上，结果显示：对照菌丝生长细长而均匀，细胞结构较为清晰，并无膨大畸形现象(图3a)，拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株主要使菌丝体膨大变粗，生长畸形，菌丝顶端和分枝处较为膨大；菌丝分枝增多，粗而短；菌丝体内部细胞原生质体分布不均匀，浓缩成不规则体，部分菌丝内有原生质流出形成空壳的现象(如图3b)，进而说明拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株对枸杞叶枯病病原菌链格孢菌丝具有拮抗作用。

实施例4

采用凹玻片孢子萌发法检测拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株对枸杞叶枯病菌的孢子萌发的影响。

1、制备拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株发酵液过滤液：将本发明的拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株先经过LB固体培养基活化，于28℃下培养36h，将经活化后的拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株接种于发酵培养基中于28℃下150r/min振荡培养24h，制成种子液，种子液按5％的接种量接入装有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，150r/min振荡培养28℃下，进行恒温发酵培养，培养3d后，得到发酵液，发酵液用无菌水稀释至有效成分含量1.0×10⁸cfu/mL后经10000r/min离心过滤，0.22μm滤膜过滤除菌得到发酵液过滤液。

2、将链格孢孢子制备成孢子悬浮液(400倍显微镜下，每个视野中可看到20个孢子)，将发酵液过滤液与孢子悬浮液等体积混合取1滴滴在凹玻片上。以清水为对照，每处理3次重复。28℃恒温培养8～10h，检查对照处理的孢子萌发情况(以孢子芽管长度大于孢子短半径者判为萌发)，统计其萌发率。当对照处理孢子萌发率达到80％以上后，统计各处理的孢子萌发率，计算孢子萌发抑制率：抑制率＝(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率×100％。毒力测定：将制备好的拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株发酵液过滤液与病原菌孢子配制成0，50ml/L，100ml/L，200ml/L，500ml/L系列浓度的孢子悬浮液，方法同上测定拮抗菌发酵液过滤液对孢子萌发的毒力。结果表明：拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株发酵液过滤液对孢子萌发有明显的抑制作用，孢子萌发抑制率为97.10％，EC50为6.76mL/L。正常的链格孢孢子萌发情况(如图4a)；受LKYLW-5菌株发酵液过滤液抑制的链格孢孢子(如图4b)。

从实施例3和实施例4的分析中可以得出以下结论：拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株对枸杞叶枯病病原菌链格孢菌丝及链格孢孢子具有拮抗作用，同时也可显而易见地预测到以拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株为活性成分的生物菌剂、含拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株的培养物、发酵液过滤液均可用于防治由病原菌链格孢作用的枸杞叶枯病。

实施例5

将培养1d的拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株点接在纤维素培养基、酪蛋白培养基和淀粉培养基上，每皿接3株菌，30℃培养2～7d，以空白作对照，设3个重复；观察菌落周围有无透明圈产生，其中淀粉培养基在观察之前应滴加数滴碘液，纤维素酶活性的测定用1g/L的刚果红染10～15min，然后，倒掉染液，再用1mol/L的NaCl浸泡15min，检查透明圈的有无，培养过程中发现：拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株在蛋白酶培养基、淀粉酶培养基和纤维素酶培养基上都能正常生长而且菌落周围有明显的水解圈产生，从图6、图7和图8中明显观察到，表明拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株在生长代谢过程中分泌产生了蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶从而水解了培养基中的蛋白质、淀粉及纤维素，导致菌落周围出现透明降解圈，这表明拮抗芽孢杆菌LKYLW-5在抑制枸杞叶枯病病原菌生长、防治植物病害时产生了一系列酶类。

本实施例中，所述产蛋白酶培养基为酪蛋白培养基(1000mL)：脱脂奶粉20g，酵母浸膏5g，葡萄糖5g，琼脂16g，水1000mL，pH7.0。

本实施例中，所述产淀粉酶培养基为淀粉培养基(1000mL)：可溶性淀粉20g，蛋白胨10g，葡糖糖5g，NaCl5g，牛肉膏5g，琼脂16g，水1000mL，pH7.0。

本实施例中，所述产纤维素酶培养基为羧甲基纤维素培养基(1000mL)：CMC-Na5.0g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，K₂HPO₄ 0.25g，琼脂16g，水l000mL。

实施例6

田间防治试验在甘肃省武威市林业科学研究院枸杞栽培园进行。将筛选到的拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株进行田间药效测试，准备拮抗芽孢杆菌发酵液其中有效成分含量(1×10⁶～1×10⁸cfu/mL)备用，其中发酵液制备方法为：将本发明的拮抗芽孢杆菌菌株LKYLW-5先经过LB固体培养基活化，于28℃下培养36h，将经活化后的拮抗芽孢杆菌菌株接种于发酵培养基中于28℃下150r/min振荡培养24h，制成种子液，种子液按5％的接种量接入装有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，150r/min振荡培养28℃下，进行恒温发酵培养，培养3d后发酵液可用于拮抗枸杞叶枯病菌，所述的萎缩芽孢杆菌LKYLW-5菌剂稀释至有效成分含量1.0×10⁶～1.0×10⁸cfu/mL后使用。以80％代森锰锌WP800倍液、清水为对照。具体设计如下：

1)预防防治效果先喷药后接种枸杞叶枯病病原菌。选择20cm左右的枝条，对上面的青果(20个左右)进行针刺处理，先喷施10mL左右各处理药剂，24h后，再喷施10mL左右孢子悬浮液(10倍镜下每视野200个左右)，套上保鲜袋保湿12h，以清水为对照，随机选择枸杞植株，每个处理10个枝条，每次3个重复。10d后分别调查发病情况，并计算病情指数及防效。病情指数＝∑(各级病果数×该病级值)/(调查总果数×最高级值)×100％，防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数/对照病情指数)]×100％。枸杞叶枯病分级标准，0级：果实表面伤口愈合，不扩展；1级：果实表面(0～1/8)变黑；2级：果实表面(1/8～1/4)变黑；3级：果实表面(1/4～1/2)变黑；4级：果实表面1/2以上变黑。由表2中的结果表明，拮抗芽孢杆菌LKYLW-5发酵液在枸杞植株先喷药后接种枸杞叶枯病后病情指数为36.23，防治效果为62.96％；而对照药剂80％代森锰锌可湿性粉剂800倍液处理的病情指数为29.46，防治效果为69.88％。

表2拮抗芽孢杆菌LKYLW-5对枸杞叶枯病的田间预防防治效果

处理	病情指数	防治效果(％)
			LKYLW-5	36.23±0.23B	62.96±0.55B
80％代森锰锌可湿性粉剂800倍液	29.46±0.56C	69.88±0.59A
			清水对照CK	97.82±0.72A	—

注：表中数据为平均值±标准差。同列数据后不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.01水平差异显著。

2)治疗防治效果先接种枸杞叶枯病病原菌后喷药，选择20cm左右的枝条，对上面的青果(20个左右)进行针刺处理，先喷施10mL左右病原菌孢子悬浮液(10倍镜下每视野200个左右)，套上保鲜袋保湿12h，以清水为对照，再喷10mL左右各处理药剂，随机选择枸杞植株，每个处理10个枝条，每次3个重复。10d后分别调查发病情况，并计算病情指数及防效。病情指数＝∑(各级病果数×该病级值)/(调查总果数×最高级值)×100％，防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数/对照病情指数)]×100％。枸杞叶枯病分级标准同上。结果(表3)表明，拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株发酵液在枸杞植株先接种枸杞叶枯病病菌后喷药病情指数为38.56，防治效果为60.15％；而对照药剂80％代森锰锌可湿性粉剂800倍液处理的病情指数为28.79，防治效果为70.25％。

表3拮抗芽孢杆菌LKYLW-5对枸杞叶枯病的田间治疗防治效果

处理	病情指数	防治效果(％)
			LKYLW-5	38.56±0.48B	60.15±0.89B
80％代森锰锌可湿性粉剂800倍液	28.79±0.46C	70.25±0.87A
			清水对照CK	96.78±0.49A	—

注：表中数据为平均值±标准差。同列数据后不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.01水平差异显著。

通过田间试验，进一步证明拮抗芽孢杆菌LKYLW-5菌株对由链格孢菌引起的枸杞叶枯病无论是预防防治还是治疗防治都有较好的防治效果，作为微生物农药具有一定的开发应用前景。

以上所述，仅是本发明的个别实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 武威市林业科学研究院

<120> 一株对枸杞叶枯病有防效的萎缩芽孢杆菌、生物菌剂及其应用

<141> 2019-01-26

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1491

<212> DNA

<213> 萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)

<400> 1

tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcgg acagatggga 60

gcttgctccc tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag 120

actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggatac ttgtttgaac cgcatggttc 180

aaacataaaa ggtggcttcg gctaccactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt 240

ggtgaggtaa tggctcacca aggcaacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca 300

cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca 360

atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag 420

ctctgttgtt agggaagaac aagtgccgtt caaatagggc ggcacctgac ggtacctaac 480

cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg 540

tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc 600

ccggctcaac cggggagggt cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg 660

gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg 720

actctctggt ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat 780

accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta 840

gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc 900

aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc 960

gaagaacctt accaggtctt gacatcctct gacaccccta gagatagggc ttccccttcg 1020

ggggcagagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080

agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag 1140

gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta 1200

tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cagaacaaag ggcagcgaga ccgcgaggtt 1260

aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa 1320

gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt 1380

acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agtcggtgag gtaaccttta 1440

tggagccagc cgccgaaggt gggacagatg attggggtga agtcgtaaca a 1491

Claims (9)

1.一株对枸杞叶枯病有防效的萎缩芽孢杆菌，其特征在于：该菌株为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)LKYLW-5，其16S rDNA核苷酸序列长度为1492bp，于2018年11月29日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCC No.16837。

2.如权利要求1所述的一株对枸杞叶枯病有防效的萎缩芽孢杆菌，其特征在于：所述萎缩芽孢杆菌LKYLW-5的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种对枸杞叶枯病有防效的生物菌剂，其特征在于，以权利要求1所述的萎缩芽孢杆菌LKYLW-5为活性成分的生物菌剂。

4.一种如权利要求1所述萎缩芽孢杆菌在拮抗枸杞叶枯病菌中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述萎缩芽孢杆菌LKYLW-5用于防治由链格孢菌(Alternaria alternata)引起的枸杞叶枯病。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述萎缩芽孢杆菌LKYLW-5抑制枸杞叶枯病菌的生长、致畸枸杞叶枯病菌的菌丝、抑制枸杞叶枯病菌的孢子萌发。

7.一种如权利要求1所述萎缩芽孢杆菌LKYLW-5通过培养基培养得到的培养物、发酵液或发酵液的过滤液在拮抗枸杞叶枯病菌中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述萎缩芽孢杆菌LKYLW-5的发酵液过滤液通过以下步骤制备所得：将萎缩芽孢杆菌LKYLW-5先经过LB固体培养基活化，于28℃下培养36h，将经活化后的萎缩芽孢杆菌LKYLW-5接种于发酵培养基中于28℃下150r/min振荡培养24h，制成种子液，种子液按5％的接种量接入装有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，150r/min振荡培养28℃下，进行恒温发酵培养，培养3d后，得到发酵液，发酵液用无菌水稀释至有效成分含量为1.0×10⁸cfu/mL后经10000r/min离心过滤，0.22μm 滤膜过滤除菌得到萎缩芽孢杆菌LKYLW-5的发酵液过滤液。

9.一种如权利要求3所述生物菌剂在拮抗枸杞叶枯病菌中的应用。

Images