CN114736817B - 一种防治植物真菌病害的链霉菌、菌剂及其应用和防治植物真菌病害的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及一种防治植物真菌病害的链霉菌、菌剂及其应用和防治植物真菌病害的方法。本发明提供了一种包括链霉菌(Streptomyces sp.)SF2和/或链霉菌(Streptomyces sp.)SF5的防治植物真菌病害链霉菌组合物，其中链霉菌SF2的保藏编号为CGMCC No.23418，链霉菌SF5的保藏编号为CGMCC No.23420。本发明所述链霉菌组合物能够有效防治植物病害，不会使引发真菌病害的病原菌产生耐药性，还具有无污染和促生的优势。

Description

一种防治植物真菌病害的链霉菌、菌剂及其应用和防治植物 真菌病害的方法

技术领域

本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及一种防治植物真菌病害的链霉菌、菌剂及其应用和防治植物真菌病害的方法。

背景技术

黄芪(Astragalus membranaceus)属豆科(Leguminosae sp.)黄芪属(AstragalusLinn.)，为多年生草本植物，以根入药，是药用价值很高的中药材。近些年，因栽培规模不断扩大、轮作周期缩短，连作面积增加，导致黄芪病害逐年加重，其中以黄芪根腐病为主的病害问题也日趋严重，制约着黄芪的产量和品质。目前能引起黄芪根腐病的病原菌主要有2种，分别为茄腐镰刀菌Fusarium solaniun 和尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum。

枸杞(Lycium barbarum)是一种药食同源的重要经济作物，枸杞炭疽病又称黑果病，主要危害青果，是枸杞生产上的一种常见病害，其病原菌有2种：胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides和尖孢炭疽菌Colletotrichum acutatum。枸杞炭疽病在国内各枸杞种植区均有发生，每年造成的产量损失超 30％以上，重者达70％以上。

长期以来，化学农药在黄芪根腐病和枸杞炭疽病等多种植物病原真菌的防治方面发挥了重要作用，但过度使用化学农药，容易使病原菌产生耐药性，还会造成农药残留和环境污染。

发明内容

本发明的目的在于提供一种防治植物真菌病害的链霉菌、菌剂及其应用和防治植物真菌病害的方法。利用本发明所述链霉菌组合物能够有效防治植物真菌病害，而且因其是生物界存在的微生物，其对环境没有任何污染，不会使引发真菌病害的病原菌产生耐药性。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种防治植物真菌病害的链霉菌，所述链霉菌包括链霉菌(Streptomyces bungoensis)SF2和/或链霉菌(Streptomyces fimbriatus)SF5；所述的链霉菌SF2的保藏编号为CGMCC No.23418；所述的链霉菌SF5的保藏编号为CGMCC No.23420。

本发明提供了一种防治植物真菌病害的菌剂，所述菌剂的有效成分包括上述技术方案所述链霉菌。

优选的，当所述菌剂的有效活性成分包括链霉菌SF2时，所述菌剂中链霉菌SF2的活菌数为1×10⁸cfu/mL～4×10⁸cfu/mL；当所述菌剂的有效活性成分包括链霉菌SF5时，所述菌剂中链霉菌SF5的活菌数为1×10⁸cfu/mL～4×10⁸cfu/mL；当菌剂的有效活性成分包括链霉菌SF2和链霉菌SF5时，所述菌剂中链霉菌SF2 的活菌数为2.5×10⁶cfu/mL～5×10⁷cfu/mL，链霉菌SF5的活菌数为 2.5×10⁶cfu/mL～5×10⁷cfu/mL。

本发明提供了上述技术方案所述的链霉菌组合物或上述技术方案所述的菌剂在防治植物真菌病害中的应用。

优选的，所述真菌病害包括根腐病、炭疽病和叶斑病中的一种或几种。

优选的，所述植物包括药用植物。

优选的，所述药用植物包括豆科药用植物、桔梗科药用植物和茄科药用植物一种或几种。

本发明提供了一种防治植物真菌病害的方法，包括以下步骤：

采用稀释后的上述技术方案所述的菌剂进行植物真菌病害的防治。

优选的，所述的稀释的倍数为2～3倍；稀释后菌剂的用量体积为2L/亩。

有益效果：

本发明提供了一种包括链霉菌(Streptomyces bungoensis)SF2和/或链霉菌(Streptomyces fimbriatus)SF5的防治植物真菌病害链霉菌，其中链霉菌SF2的保藏编号为CGMCC No.23418，链霉菌SF5的保藏编号为CGMCC No.23420。本发明所述链霉菌组合物能够相互促进，进而达到协同增效的作用，能够有效抑制真菌菌丝的生长，达到防治植物病害的效果，不会使引发真菌病害的病原菌产生耐药性，还具有无污染和促生的优势。本发明实施例结果表明：利用本发明所述链霉菌组合物对枸杞炭疽病的预防效果能够达到91.67～98.15％，治疗效果能够达到76.85～90.74％，对枸杞炭疽病菌的抑菌率能够达到 42.86％～58.82％；利用本发明所述链霉菌组合物对黄芪根腐病的预防效果能够达到89.22％，治疗效果能够达到85.29％，对黄芪根腐病菌的抑菌率能够达到 55.29％。

生物保藏信息

链霉菌(Streptomyces sp.)SF2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年9月15日，保藏编号为CGMCC No.23418。

链霉菌(Streptomyces sp.)SF5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年9月15日，保藏编号为CGMCC No.23420。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为链霉菌SF2和链霉菌SF5形态特征图，其中A为链霉菌SF2的菌落形态图，B为链霉菌SF2在光学显微镜下的孢子形态图，C为链霉菌SF5的菌落形态图，D为链霉菌SF5在光学显微镜下的孢子形态图；

图2为接种链霉菌SF2和链霉菌SF5的促生效应结果图；其中A为链霉菌 SF2的促生效应结果，a为链霉菌SF2产生IAA的图片，第一个试管为未接种菌株，第二个试管为接种链霉菌SF2，b为链霉菌SF2产生NH₃的图片，第一个试管为未接种菌株，第二个试管为接种链霉菌SF2，c为链霉菌SF2溶无机磷图片，d为链霉菌SF2溶有机磷图片，e为链霉菌SF2产生铁载体的图片，f为链霉菌SF2解钾图片，g为链霉菌SF2产生蛋白酶图片，h为链霉菌SF2产生纤维素酶图片，i为链霉菌SF2固氮图片，j为链霉菌SF2产生ACC脱氨酶图片；B 为链霉菌SF5的促生效应结果图，a为链霉菌SF5产生IAA的图片，第一个试管为未接种菌株，第二个试管为接种链霉菌SF5，b为链霉菌SF5产生NH₃的图片，第一个试管为未接种菌株，第二个试管为接种链霉菌SF5，c为链霉菌SF5 溶无机磷图片，d为链霉菌SF5产生铁载体图片，e为链霉菌SF5解钾图片，f 为链霉菌SF5产生蛋白酶图片，g为链霉菌SF5产生纤维素酶图片，h为链霉菌 SF5固氮图；

图3为链霉菌SF2和链霉菌SF5对供试病原菌的抑制效果图，其中CK为未接种链霉菌SF2和链霉菌SF5的处理，SF2为接种菌株链霉菌SF2的处理， SF5为接种菌株链霉菌SF5的处理，a为黄芪根腐病菌，b为黄芪叶斑病菌，c～f 为枸杞炭疽病菌复合种，依次为枸杞炭疽病菌复合种TJA、枸杞炭疽病菌复合种TJCE、枸杞炭疽病菌复合种WHN7和枸杞炭疽病菌复合种TJD，g为党参根腐病菌；

图4为链霉菌SF2和链霉菌SF5间亲和性测试结果，图中的②为用链霉菌 SF2制成的含菌平板，⑤为圆形滤纸上滴加链霉菌SF5发酵液的位置；

图5为链霉菌SF2和链霉菌SF5发酵液对黄芪根腐病的防治效果图，其中 A为链霉菌SF2发酵液和链霉菌SF5发酵液对黄芪根腐病的预防效果，B为链霉菌SF2发酵液和链霉菌SF5发酵液对黄芪根腐病的治疗效果，C为只接种病原菌、只接种链霉菌SF2发酵液和只接种链霉菌SF5发酵液的效果，SF2为接种链霉菌SF2，SF5为接种链霉菌SF5；

图6为链霉菌SF2和链霉菌SF5对枸杞炭疽病的抑制效果，其中，A为接种无菌水，B为接种枸杞炭疽病菌复合种，依次为枸杞炭疽病菌复合种WHN7、枸杞炭疽病菌复合种TJA、枸杞炭疽病菌复合种TJCE和枸杞炭疽病菌复合种 TJD，C为接种链霉菌SF2，D为接种链霉菌SF5；

图7为复配发酵液对枸杞炭疽病的防治效果图，其中A为复配发酵液对枸杞炭疽病的预防效果，B为复配发酵液对枸杞炭疽病的治疗效果。

具体实施方式

本发明提供了一种防治植物真菌病害的链霉菌，所述链霉菌包括链霉菌(Streptomyces bungoensis)SF2和/或链霉菌(Streptomyces fimbriatus)SF5；所述的链霉菌SF2的保藏编号为CGMCC No.23418；所述的链霉菌SF5的保藏编号为CGMCC No.23420。

在本发明中，所述链霉菌SF2的菌落形态如图1中的A和B所示：在高氏一号培养基上生长繁茂，呈白色，无可溶性色素，表面隆起且干燥不透明，边缘不规则向四周扩散，有土腥味；基内菌丝与气生菌丝都很丰富，基内菌丝呈乳白色，气生菌丝为灰褐色，孢子弯曲、表面光滑。在本发明中，所述链霉菌 SF2的16SrDNA的序列优选如SEQ ID NO.1所示： tagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacgatgaaccacttcggtggggattagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggcaatctgcccttcactctgggacaagccctggaaacggggtctaataccg gatatcacttccactcgcatgggtgggggtcgaaagctccggcggtgaaggatgagcccgcggcctatcagcttgttggt gaggtaatggctcaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacgg cccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagg gatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcgaaagtgacggtacctgcagaagaagcgccggct aactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcg gcttgtcacgtcgggtgtgaaagcccggggcttaaccccgggtctgcattcgatacgggctagctagagtgtggtagggg agatcggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggatctctgggcca ttactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtggga actaggtgttggcgacattccacgtcgtcggtgccgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgcaag gctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcagcggagcatgtggcttaattcgacgcaacgcgaagaacc ttaccaaggcttgacatacaccggaaacgtctggagacaggcgcccccttgtggtcggtgtacaggtggtgcatggctgtc gtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcctgtgttgccagcatgcccttcgggg tgatggggactcacaggagaccgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgt cttgggctgcacacgtgctacaatggccggtacaatgagctgcgataccgtgaggtggagcgaatctcaaaaagccggtc tcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagttgctagtaatcgcagatcagcattgctgcggtgaata cgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcacgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcccaaccccttgtgggagggagct。

在本发明中，所述链霉菌SF5的菌落形态如图1中的C和D所示：链霉菌 SF5在高氏一号培养基上生长繁茂，呈灰黑色，菌落扁平状，培养3天后产咖啡色可溶性色素，菌落背面呈棕黑色，孢子为短圆柱形，表面光滑。在本发明中，所述链霉菌SF5的16SrDNA的序列优选如SEQ ID NO.2所示： ttgatcatggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacgatgaaccacttcggtggggattagt ggcgaacgggtgagtaacacgtgggcaatctgcccttcactctgggacaagccctggaaacggggtctaataccggatat caccttcacgggcatctgtgagggtcgaaagctccggcggtgaaggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtgaggt aatggctcaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccag actcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgac ggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcgaaagtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaactac gtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtc acgtcgggtgtgaaagcccggggcttaaccccgggtctgcattcgatacgggctagctagagtgtggtaggggagatcg gaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggatctctgggccattactga cgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtgggaactaggt gttggcgacattccacgtcgtcggtgccgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaa ctcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcagcggagcatgtggcttaattcgacgcaacgcgaagaaccttaccaa ggcttgacatacaccggaaagcatcagagatggtgccccccttgtggtcggtgtacaggtggtgcatggctgtcgtcagct cgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgttctgtgttgccagcatgcccttcggggtgatggg gactcacaggagaccgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtcttgggc tgcacacgtgctacaatggccggtacaatgagctgcgataccgtgaggtggagcgaatctcaaaaagccggtctcagttc ggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagttgctagtaatcgcagatcagcattgctgcggtgaatacgttccc gggccttgtacacaccgcccgtcacgtcacgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcccaa。

本发明所述链霉链霉菌SF2和链霉菌SF5都具有产IAA、NH₃、铁载体等促生效应，且对包括黄芪根腐病菌和枸杞炭疽病菌在内的多种植物病原真菌具有良好的广谱拮抗活性。

本发明提供了上述技术方案所述链霉菌在制备防治植物真菌病害菌剂中的应用。在本发明中，所述真菌病害优选包括根腐病、炭疽病和叶斑病中的一种或几种；所述根腐病优选由黄芪根腐病菌(Fusarium oxysporum)和党参根腐病菌(Sclerotiniasclerotiorum)引起；所述炭疽病优选由枸杞炭疽病菌 (Colletotrichum acutatum)引起；所述叶斑病优选由黄芪叶斑病菌(Alternaria solani)引起。在本发明中，所述植物优选包括药用植物，更优选包括豆科药用植物、桔梗科药用植物和茄科药用植物一种或几种；所述豆科药用植物包括黄芪；所述桔梗科药用植物包括党参；所述茄科药用植物包括枸杞；本发明包括但不限于上述药用植物种类。利用本发明所述链霉菌组合物能够有效防治植物真菌性病害。

本发明提供了一种防治植物真菌病害的菌剂，所述菌剂的有效成分包括上述技术方案所述链霉菌。在本发明中，当所述菌剂的有效活性成分包括链霉菌 SF2，不含有链霉菌SF5时，所述菌剂中链霉菌SF2的活菌数优选为 1×10⁸cfu/mL～4×10⁸cfu/mL，进一步优选为1×10⁸cfu/mL～2.5×10⁸cfu/mL，更优选为1×10⁸cfu/mL～2×10⁸cfu/mL。当所述菌剂的有效活性成分包括链霉菌SF5，不含有链霉菌SF2时，所述菌剂中链霉菌SF5的活菌数优选为1×10⁸cfu/mL～4×10⁸cfu/mL，进一步优选为1×10⁸cfu/mL～2.5×10⁸cfu/mL，更优选为1×10⁸cfu/mL～2×10⁸cfu/mL。当所述菌剂中包括链霉菌SF2和链霉菌SF5时，所述菌剂中链霉菌SF2的活菌数为2.5×10⁶cfu/mL～5×10⁷cfu/mL，进一步优选为 5×10⁶cfu/mL～1×10⁷cfu/mL，还优选为7×10⁶cfu/mL～9×10⁶cfu/mL；所述菌剂中链霉菌SF5的活菌数优选为2.5×10⁶cfu/mL～5×10⁷cfu/mL，进一步优选为 3×10⁶cfu/mL～3×10⁷cfu/mL，还优选为8×10⁶cfu/mL～2×10⁷cfu/mL。

当所述菌剂中包括链霉菌SF2和链霉菌SF5时，本发明所述菌剂的制备方法，优选包括以下步骤：

将链霉菌SF2发酵液与链霉菌SF5发酵液混合后，得菌剂。

在本发明中，所述菌剂中链霉菌SF2和链霉菌SF5混合时的体积比优选为1:1。在本发明中，所述链霉菌SF2发酵液的活菌数优选为 5×10⁶cfu/mL～1×10⁸cfu/mL，进一步优选为8×10⁶cfu/mL～2×10⁷cfu/mL，更优选为优选为1×10⁷cfu/mL～2×10⁷cfu/mL；所述链霉菌SF5发酵液的活菌数优选为 5×10⁶cfu/mL～1×10⁸cfu/mL，进一步优选为8×10⁶cfu/mL～2×10⁷cfu/mL，更优选为优选为1×10⁷cfu/mL～2×10⁷cfu/mL。

在本发明中，所述链霉菌SF2发酵液的制备方法优选包括以下步骤：挑取链霉菌SF2的单菌落至高氏一号液体培养基进行发酵培养，得链霉菌SF2发酵液。在本发明中，所述高氏一号培养基优选以下浓度的组分：可溶性淀粉20g/L、 KNO₃1g/L、K₂HPO₄0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、NaCl 0.5g/L、FeSO₄·7H₂O 0.01g/L和琼脂20g/L；所述高氏一号培养基的pH优选为7.4～7.6。在本发明中，所述发酵培养的方式优选为恒温摇床发酵；所述发酵培养的温度优选为28℃，转速优选为180r/min，时间优选为5d。本发明所述链霉菌SF5发酵液的制备方法同链霉菌SF2，在此不作赘述。在本发明中，若链霉菌SF2发酵液和链霉菌 SF5发酵液不立即使用，优选在4℃保存备用。

本发明所述链霉菌组合物或含有链霉菌组合物的菌剂能够有效防治植物病害，不会使引发真菌病害的病原菌产生耐药性，还具有无污染和促生的优势。因此，该链霉菌组合物或菌剂能够用于防治植物真菌病害。

本发明提供了上述技术方案所述的链霉菌组合物或上述技术方案所述的菌剂在防治植物真菌病害中的应用。在本发明中，所述真菌病害优选包括根腐病和/或炭疽病；所述根腐病优选由黄芪根腐病菌(Fusarium oxysporum)引起；所述炭疽病优选由枸杞炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)引起。在本发明中，所述植物优选包括药用植物，更优选包括豆科药用植物或茄科药用植物；所述豆科药用植物包括黄芪；所述茄科药用植物包括枸杞；但不限于上述药用植物种类。利用本发明所述链霉菌组合物对枸杞炭疽病的预防效果能够达到 91.67～98.15％，治疗效果能够达到76.85～90.74％，对枸杞炭疽病菌复合种的抑菌率能够达到42.86％～58.82％；利用本发明所述链霉菌组合物对黄芪根腐病的预防效果能够达到89.22％，治疗效果能够达到85.29％，对黄芪根腐病菌的抑菌率能够达到55.29％。

本发明提供了一种防治植物真菌病害的方法，包括以下步骤：

采用稀释后的上述技术方案所述的菌剂进行植物真菌病害的防治。在本发明中，所述稀释的倍数优选为2～3倍，稀释后菌剂的用量优选为2L/亩。在本发明中，所述稀释后所得稀释菌剂的活菌数优选为1×10⁸cfu/mL～2×10⁸cfu/mL，更优选为1×10⁸cfu/mL～1.5×10⁸cfu/mL。在本发明中，所述施入的方式优选包括喷施或灌根；所述喷施优选喷施于植物叶片。在本发明中，当防治植物真菌病害中的根腐病时，优选采用灌根的方式；当防治植物真菌病害中的炭疽病时，优选采用喷施的方式。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种防治植物真菌病害的链霉菌组合物、菌剂及其应用和防治植物真菌病害的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中所用的培养基如下：

高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，KNO₃ 1g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，琼脂20g，ddH₂O 1L，pH 7.4～7.6。

PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，ddH₂O 1L，pH自然。

蛋白胨水培养基：蛋白胨10g，NaCl 5g，ddH₂O 1L，pH 7.6。

Pikovasky's溶磷培养基：NaCl 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，MnSO₄ 0.03g，KCl 0.3g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，Ca₃(PO₄)₂ 5g，葡萄糖10g，琼脂20g， ddH₂O 1L。

孟金娜有机磷培养基：(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，葡萄糖10g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄ 0.03g，CaCO₃ 5g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，卵磷脂0.2g，琼脂20g，ddH₂O 1L。

解钾固体培养基：蔗糖5g，Na₂HPO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeCl₃ 0.005g， CaCO₃0.1g，钾长石粉1g，琼脂20g，ddH₂O 1L。

蛋白酶产生筛选培养基：脱脂奶粉15g，琼脂20g，ddH₂O 1L。

CMC培养基：CMC-Na 10g，KNO₃ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g， NaCl0.5g，K₂HPO₄ 1g，琼脂20g，ddH₂O 1L。

Ashby无氮固体培养基：甘露醇10g，NaCl 0.2g，CaCO₃ 5g，KH₂PO₄ 0.2g， FeSO₄·7H₂O 0.1g，CaSO₄·2H₂O 0.1g，琼脂20g，ddH₂O 1L。

ADF固体培养基：KH₂P0₄ 4g，Na₂HPO₄ 6g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.1g，H₃BO₃ 10μg，MnSO₄ 10μg，ZnSO₄ 70μg，CuSO₄ 50μg，MoO₃ 10μg，葡萄糖2g，葡萄糖酸2g，柠檬酸2g，琼脂20g，ddH₂O 1L。

CAS培养基：

先配制好1mmol/L的CaCl₂溶液、1mmol/L的MgSO4·7H₂O溶液、10％的酸水解酪蛋白溶液(121℃，30min单独灭菌)；

再取0.2mL的CaCl₂溶液、0.2mL的MgSO₄·7H₂O溶液、6mL的10％的酸水解酪蛋白溶液，加入生物缓冲液Pipes(sigma)，调pH 6.8～7.0。去离子水定容到100mL。加入2g琼脂粉，121℃灭菌30min，得固体培养基。

CAS蓝色检测液的制备

溶液A：将0.0605g的CAS溶于50mL去离子水中，再加入10mL 1mmol/L 的FeCl₃溶液(含有10mmol/L的HCl)；

溶液B：将0.072g的十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)溶于40mL的去离子水中；

溶液C：将A溶液沿着烧杯的壁缓缓加入到B溶液中，轻轻晃动，使溶液 AB混匀，得到溶液C，即CAS蓝色检测液。121℃灭菌30min；

当上述固体培养基灭完菌后，温度降低到60℃时，以5mL CAS蓝色检测液体/每100mL固体培养基的量沿着三角瓶壁加入，混合均匀，得CAS。

营养琼脂培养基：蛋白胨10g，NaCl 5g，牛肉膏3g，琼脂20g，ddH₂O 1L。

ISP2培养基：酵母膏4.0g，麦芽汁10.0g，葡萄糖4.0g，琼脂20.0g，ddH₂O 1L，pH7.0。

ISP3培养基：燕麦粉20.0g，微量元素溶液1mL，ddH₂O 1L，pH 7.2；微量元素溶液为FeSO₄·7H2O 0.1g，MnCl₂·4H₂O 0.1g，ZnSO₄·7H₂O 0.1g，ddH₂O 1L。

ISP4培养基：可溶性淀粉10g，K₂HPO₄ 1.0g，MgSO₄·7H2O 1.0g，NaCl 1.0g， (NH₄)₂SO₄ 2.0g，CaCO₃2.0 g，FeSO₄·7H₂O 0.001g，琼脂粉20g，ddH₂O 1L。

察氏培养基：NaNO₃ 3g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KCl 0.5g， FeSO₄·7H₂O0.5g，蔗糖0.01g，琼脂20g，ddH₂O 1L。

实施例1

菌株的分离精选籽粒饱满、健康的甘草种子，用85％(v/v)浓硫酸浸润甘草种子，期间一直搅拌，45min后，蒸馏水冲洗10次，接着用0.1％(v/v)的 H₂O₂消毒10min，最后用蒸馏水冲洗数次后置于烧杯中，用蒸馏水浸泡3h，然后转入超净工作台中对种子进行表面消毒。在无菌条件下，用75％(v/v)乙醇溶液浸泡5min，1％(v/v)过氧化氢溶液浸泡30s，5％(v/v)次氯酸钠溶液浸泡10s，无菌水冲洗10次，最后，用无菌滤纸吸取种子表面的多余的水分，晾干备用。取表面消毒过程中最后一次冲洗液200μL，均匀涂布在高氏一号培养基中，28℃人工气候箱中培养7d天后，观察是否会长出菌落，若无菌落生成，则证明表面消毒彻底。结果是无菌落生成，证明种子表面消毒彻底。

在无菌操作台中，将上述表面灭菌彻底的种子放入研钵中，加入10mL无菌水研磨。取悬浮液200μL均匀涂布在含有50μg/mL K₂Cr₂O₇的高氏一号培养基上，28℃人工气候箱中暗培养7d后挑取具有典型放线菌菌落形态与质地的单菌落转接到另一高氏一号培养基上，得到两株纯培养的菌株，并命名为菌株Ⅰ和菌株Ⅱ。

形态特征观察

分别在高氏一号培养基上划线接种菌株Ⅰ和菌株Ⅱ，28℃恒温培养7d，采用平皿插片法初步观察菌株气生菌丝、基内菌丝和孢子的形态特征。结果如图1 所示：菌株Ⅰ在高氏一号培养基上生长繁茂，呈白色，无可溶性色素，表面隆起且干燥不透明，边缘不规则向四周扩散，有土腥味；基内菌丝与气生菌丝都很丰富，基内菌丝呈乳白色，气生菌丝为灰褐色，孢子弯曲、表面光滑(图1 中的A和B)；菌株Ⅱ在高氏一号培养基上生长繁茂，呈灰黑色，菌落扁平状，培养3天后产咖啡色可溶性色素，菌落背面呈棕黑色，孢子为短圆柱形，表面光滑(图1中的C和D)。

培养特征观察

选用高氏一号培养基、察氏培养基、营养琼脂培养基、PDA培养基、ISP2 培养基、ISP3培养基、ISP4培养基6种培养基，分别将菌株Ⅰ和菌株Ⅱ的单菌落划线接种到上述培养基中，插入灭菌的盖玻片，28℃分别培养7d后观察插片上的气生菌丝、基内菌丝和孢子的形态特征，结果见表1和表2。

表1菌株Ⅰ在不同鉴别培养基上的生长及培养特征

培养基	气生菌丝	基内菌丝	可溶性色素	生长状况
					高氏一号培养基	乳白色	灰褐色	无	+++
察氏培养基	白色	白色	无	++
					营养琼脂培养基	乳白色	黄色	无	+++
PDA培养基	乳黄色	土黄色	无	+++
					ISP2培养基	乳黄色	黄色	无	+++
ISP3培养基	白色	白色	无	++
					ISP4培养基	黄白色	米黄色	无	++

注：+表示可以生长，++表示生长良好，+++表示生长很好。

表2菌株Ⅱ在不同鉴别培养基上的生长及培养特征

由表1和表2记载的可知，所述菌株Ⅰ在高氏一号培养基上气生菌丝为乳白色，基内菌丝为灰褐色，无可溶性色素，生长状况很好，在察氏培养基上的气生菌丝为白色，基内菌丝为白色，无可溶性色素，生长状况良好，在营养琼脂培养基上气生菌丝为乳白色，基内菌丝为黄色，无可溶性色素，生长状况很好，在PDA培养基上气生菌丝为乳黄色，基内菌丝为土黄色，无可溶性色素，生长状况很好，在ISP2培养基上气生菌丝为乳黄色，基内菌丝为黄色，无可溶性色素，生长状况很好，ISP3培养基上气生菌丝为白色，基内菌丝为白色，无可溶性色素，生长状况良好，在ISP4培养基上气生菌丝为黄白色，基内菌丝为米黄色，无可溶性色素，生长状况良好；所述菌株Ⅱ在高氏一号培养基上气生菌丝为灰黑色，基内菌丝为灰褐色，可溶性色素为咖啡色，生长状况很好，在察氏培养基上的气生菌丝为黄色，基内菌丝为灰褐色，可溶性色素为灰黄色，生长状况很好，在营养琼脂培养基上气生菌丝为黄色，基内菌丝为灰色，无可溶性色素，生长状况很好，在PDA培养基上气生菌丝为浅黄色，基内菌丝为褐色色，无可溶性色素，生长状况良好，在ISP2培养基上气生菌丝为白色，基内菌丝为浅黄色，无可溶性色素，生长状况很好，ISP3培养基上气生菌丝为白色，基内菌丝为灰色，无可溶性色素，生长状况良好，在ISP4培养基上气生菌丝为浅褐色，基内菌丝为褐色，无可溶性色素，生长状况很好。

生理生化测定

菌株Ⅰ和菌株Ⅱ的的生理生化特性以及生长pH范围、温度耐受范围和能够生存的培养基中NaCl的含量等测定参考《放线菌系统学原理、方法及实践》和《链霉菌鉴定手册》，结果见表3和表4。

表3菌株Ⅰ的生理生化特征

特征	结果	特征	结果	特征	结果
						生化试验		碳源利用		氮源利用
MR试验	+	D-甘露醇	+	尿素	+
						V-P试验	－	D-半乳糖	+	谷氨酰胺	－
柠檬酸盐试验	+	D-木糖	+	甘氨酸	－
						吲哚产生试验	+	蔗糖	+	硫酸铵	+
氧化酶	+	D-葡萄糖	+	组氨酸	+
						脂酶	－	D-山梨醇	+	(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>	+
尿素酶	－	D-果糖	+	KNO<sub>3</sub>	+
						过氧化氢酶	+	D-麦芽糖	－

注：“+”表示阳性，“－”表示阴性。

表4菌株Ⅱ的生理生化特征

由表3和表4记载的可知，菌株Ⅰ不能使硝酸盐还原，可以使淀粉水解，不能产生H₂S，不能使明胶液化、牛奶胨化与凝固；生长pH范围为5.0～9.0，最适生长pH为7.0；温度耐受范围为15～37℃，最适生长温度为28℃；能生长在 NaCl含量小于7％的培养基上；菌株Ⅱ不能使硝酸盐还原，可以使淀粉水解，能产生H₂S，能使明胶液化、牛奶胨化与凝固；生长pH范围为5.0～9.0，最适生长pH为7.0；温度耐受范围为15～37℃，最适生长温度为28℃；能生长在NaCl 含量小于7％的培养基上。

分子生物学鉴定

采用DNA提取试剂盒(购买厂家为生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为SK8255)提取菌株Ⅰ和菌株Ⅱ的基因组DNA，采用16S rDNA细菌通用引物对7F-1540(CAGAGTTTGATCCTGGCTAGGAGGTGATCCAGCCGCA， SEQ ID No.3)和27F-1492(AGTTTGATCMTGGCTCAGGGTTACCT TGTTACGACTT，SEQ ID No.4)进行PCR扩增，PCR反应体系为：模板DNA 2μL，10×buffer(with Mg²⁺)5μL，dNTP(10m M)2μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL，每个引物(10μM)各2μL；反应参数：96℃ 1min，95℃ 10s，50℃ 5s，60℃ 4min，共25个循环；

回收PCR扩增产物，送至生工(上海)有限公司测序，其中菌株1的16S rDNA 的序列如SEQ ID NO.1所示，菌株Ⅱ的16S rDNA的序列如SEQ ID NO.2所示，并经过NCBI数据库进行BLAST序列比对，对比结果如表5所示。

表5菌株Ⅰ和菌株Ⅱ的16S rDNA序列比对结果

由表5记载的可知，通过形态观察，生理生化鉴定，16SrDNA分析等分子生物学分析鉴定方法，确定菌株Ⅰ为链霉菌属中的Streptomyces bungoensis，命名为链霉菌SF2，菌株Ⅱ为链霉菌属中的Streptomyces fimbriatus，命名为链霉菌 SF5。

实施例2

链霉菌SF2和链霉菌SF5的促生特性的测定

产IAA(吲哚乙酸)的能力

挑取链霉菌SF2和链霉菌SF5的单菌落分别接种于含色氨酸0.5g/L的高氏一号液体培养基中，以未接种链霉菌SF2和链霉菌SF5的培养液为空白对照， 28℃、160r/min振荡培养5d，然后8000r/min离心10min，取2mL上清液与4mL Salkowski试剂(0.5mM FeCl₃和50mL H₂SO₄混合)混合，28℃避光静置30min 后颜色变红(图2中A中的a和图2中B中的a)，说明链霉菌SF2和链霉菌 SF5都可以产IAA。

取纯IAA制备IAA标准曲线，IAA标准曲线数据如表6所示，得到IAA标准曲线y＝0.0271x+0.0156，测定链霉菌SF2和链霉菌SF5在OD₅₃₀的测定值，测定值分别为1.007和1.137，将测定OD₅₃₀的数值并代入IAA标准曲线，其中 x表示吲哚乙酸量，y表示在波长530nm处的吸光度值，计算出IAA含量可达到36.58mg/L和41.38mg/L。

表6 IAA标准曲线数据

浓度(mg/L)	0	5	10	15	20	25
							OD<sub>530</sub>	0	0.157	0.308	0.42	0.553	0.689

产NH₃活性

挑取链霉菌SF2和链霉菌SF5份单菌落接种于含10mL蛋白胨水的试管中， 28℃培养2d，每管加入0.5mLNessler's试剂，若出现黄褐色沉淀则说明具有产 NH₃活性，若无则不产NH₃。结果如图2中A中的b和图2中B中的b所示，链霉菌SF2和链霉菌SF5培养后显色反应均呈阳性，说明链霉菌SF2和链霉菌 SF5具有产NH₃的活性。

溶无机磷能力

挑取链霉菌SF2和链霉菌SF5的单菌落点接于Pikovasky's溶磷培养基上， 28℃培养5d，菌落周围出现透明圈为阳性。结果如图2中的c所示，链霉菌SF2 和链霉菌SF5周围具有明显的溶磷圈，则说明链霉菌SF2和链霉菌SF5具有溶无机磷的能力。

溶有机磷能力

挑取链霉菌SF2和链霉菌SF5的单菌落点接于孟金娜有机磷培养基上，28℃培养5d，菌落周围出现透明圈为阳性。结果如图2中A中的d所示，链霉菌SF2 周围有溶磷圈，则说明链霉菌SF2具有溶有机磷的能力；链霉菌SF5周围没有溶磷圈，则说明链霉菌SF5没有溶有机磷的能力。

产铁载体能力

挑取链霉菌SF2和链霉菌SF5的单菌落接种于检测铁载体的通用CAS培养基平板上，28℃培养5d，菌落周围出现透明圈为阳性。结果如图2中A中的e 和图2中B中的d所示，链霉菌SF2和链霉菌SF5周围具有明显的黄色透明圈，则说明链霉菌SF2和链霉菌SF5具有产铁载体的能力。

解钾能力

挑取链霉菌SF2和链霉菌SF5的单菌落点接于解钾固体培养基上，28℃培养5d，菌落周围出现透明圈为阳性。结果如图2中A中的f和图2中B中的e 所示，链霉菌SF2和链霉菌SF5周围具有明显的透明水解圈，则说明链霉菌SF2 和链霉菌SF5具有解钾的能力。

产蛋白酶能力

挑取链霉菌SF2和链霉菌SF5的单菌落点接于蛋白酶产生筛选培养基上， 28℃培养5d，菌落周围出现透明圈为阳性。如图2中A中的g和图2中B中的 f所示，链霉菌SF2和链霉菌SF5周围具有明显的透明水解圈，则说明链霉菌 SF2和链霉菌SF5具有产蛋白酶的能力。

产纤维素酶能力

挑取链霉菌SF2和链霉菌SF5的单菌落点接于CMC培养基上，28℃培养 5d后滴加0.5％(w/v)刚果红溶液染色1h，然后用1mol/L NaCl溶液盖过平板脱色10min，菌落周围出现透明圈为阳性。结果如图2中A中的h和图2中B 中的g所示，链霉菌SF2和链霉菌SF5周围具有明显的透明水解圈，则说明链霉菌SF2和链霉菌SF5具有产纤维素酶的能力。

固氮作用

挑取链霉菌SF2和链霉菌SF5的单菌落划线接种于Ashby无氮固体培养基平板上，28℃培养2d观察菌株长势。结果如图2中A中的i和图2中B中的h 所示，所示结果发现链霉菌SF2和链霉菌SF5在无氮条件下长势良好，具有固氮活性。

产ACC脱氨酶活性

挑取链霉菌SF2和链霉菌SF5的单菌落划线接种于ADF固体培养基上， 28℃培养2d后观察菌株长势。结果如图2中A中的j所示，结果发现链霉菌SF2 转接3次(在ADF固体培养基上连续接种3次)后还能在以ACC为唯一氮源的培养基上生长，具有产ACC脱氨酶活性；链霉菌SF5转接3次后不能在以 ACC为唯一氮源的培养基上生长，没有产ACC脱氨酶活性。

实施例3

菌株抑菌活性的测定

实验方法

链霉菌SF2菌液和链霉菌SF5菌液的制备：将链霉菌SF2和链霉菌SF5分别在高氏一号培养基上28℃活化5d，然后分别挑取单菌落至高氏一号液体培养基中，在恒温振荡摇床中以28℃，180r/min的培养条件下培养5d，得链霉菌 SF2菌液和链霉菌SF5菌液。

采用对峙平板法，先分别将表7中的靶标菌接种在PDA培养基上进行活化。用打孔器制得直径6mm的圆形滤纸，将其进行高温灭菌。

在无菌操作台上，用1.3cm打孔器取病原菌菌饼放置在PDA平板中央，将滤纸片平贴于距中心2.5cm处的相对称的两侧，用无菌移液枪吸取50μL待测链霉菌SF2菌液(1×10⁸cfu/mL)和链霉菌SF5菌液(1×10⁸cfu/mL)加到滤纸片上，对照则不添加生防菌菌液(链霉菌SF2菌液和链霉菌SF5菌液)。每个处理重复3次，置28℃恒温培养箱中培养5d后，观察并采用十字交叉法测量抑菌直径并计算抑制率，其中抑菌率(％)＝(对照组菌落半径-处理组菌落半径)/ 对照组菌落半径×100。结果如表7和图3所示。

表7链霉菌SF2和SF5对供试病原菌的抑菌率

注：表中数据为平均数±标准误；黄芪根腐病菌公开于《敦煌盐碱土中抗黄芪根腐病放线菌的筛选、鉴定及发酵条件优化》；黄芪叶斑病菌公开于《茄科植物链格孢菌大孢子种分类研究及菌株YZU 161111全基因组测序》；党参根腐病菌公开于《Evaluation of theinhibitory effects of Wuyiencin，a secondary metabolite of Streptomycesalbulus CK-15,against Sclerotinia sclerotiorum in vitro》；枸杞炭疽病菌复合种公开于《甘肃省枸杞炭疽病菌对4种甾醇脱甲基抑制剂的敏感性》。

由表7和图3记载的可知，链霉菌SF2和链霉菌SF5对7种供试病原菌均有一定的拮抗作用，表明链霉菌SF2和链霉菌SF5均具有广谱的抑菌作用，而且链霉菌SF2和链霉菌SF5对黄芪根腐病菌的抑菌率均为42.86％。

实施例4

病原菌孢子悬浮液的制备

将黄芪根腐病菌在PDA培养基上活化，28℃恒温培养箱培养5d，用无菌 ddH₂O洗下孢子并制成1×10⁶cfu/mL的孢子悬浮液，得黄芪根腐病菌孢子悬浮液，备用。

将枸杞炭疽病菌复合种TJD、枸杞炭疽病菌复合种TJA、枸杞炭疽病菌复合种TJCE和枸杞炭疽病菌复合种WHN7分别在PDA培养基上活化，28℃恒温箱中培养5d，用10mL无菌水冲洗平板，并用2层纱布过滤后得到孢子悬浮液，将所得孢子悬浮液用无菌水稀释制成浓度为1×10⁷cfu/mL的孢子悬浮液，得枸杞炭疽病菌孢子悬浮液，备用。

拮抗菌发酵液的制备

将链霉菌SF2和链霉菌SF5分别在高氏一号培养基上28℃活化5d，然后分别挑取单菌落至高氏一号液体培养基中，在恒温振荡摇床中以28℃，180r/min 的培养条件下培养5d后收集发酵液，得活菌数为1×10⁸cfu/mL的链霉菌SF2发酵液和活菌数为1×10⁸cfu/mL的链霉菌SF5发酵液，4℃保存备用。

拮抗菌株间亲和性测试

将链霉菌SF2发酵液与已灭菌并冷却至45℃的高氏一号培养基按1∶9的体积比(即链霉菌SF2发酵液的用量为10mL，高氏一号培养基的用量为90ml混匀后制成含菌平皿；待平皿凝固后，等间距放置3份已灭菌的圆形滤纸片，滴加链霉菌SF5发酵液50μL，28℃恒温培养5d后观察滤纸片周围是否出现抑菌圈。每组处理重复3次。结果如图4所示：链霉菌SF2和链霉菌SF5之间没有拮抗作用，可以将菌液进行复配。

实施例5

防治黄芪根腐病试验

拮抗菌株发酵液防治黄芪根腐病试验

将健康的黄芪根用流水冲洗30min，75％(v/v)乙醇溶液浸泡30s，3％(v/v) 次氯酸钠溶液浸泡5min，用无菌ddH₂O冲洗5次。用无菌手术刀片将表面消毒的根切成5mm厚的薄片，置于含有无菌滤纸的培养皿中，培养皿中添加1mL 无菌水保湿。

采用菌液点接的方式分别接种链霉菌SF2发酵液(拮抗链霉菌SF2发酵液) 和链霉菌SF5发酵液(拮抗链霉菌SF5发酵液)原液(1×10⁸cfu/mL)、5倍 (2×10⁷cfu/mL)、10倍(1×10⁷cfu/mL)、20倍(5×10⁶cfu/mL)的稀释液及黄芪根腐病菌孢子悬浮液，接种量分别为40μL，接种后将培养皿置于28℃恒温培养箱培养3d，观察发病情况并计算防治效果，结果见表8和图5。

其中，拮抗菌株的预防效果试验：先接种链霉菌SF2发酵液和链霉菌SF5 发酵液的原液以及不同倍数的稀释液，28℃保湿培养24h后接种实施例4制备得到的黄芪根腐病菌孢子悬浮液。

拮抗菌株的治疗效果试验：先接种实施例4制备得到的黄芪根腐病菌孢子悬浮液，28℃保湿培养24h后分别接种链霉菌SF2发酵液、链霉菌SF5发酵液的原液或者不同倍数的稀释液。

试验设置CK(接无菌水，阴性对照)、只接拮抗菌链霉菌SF2、只接拮抗菌SF5、接拮抗菌链霉菌SF2+病原菌、接拮抗菌链霉菌SF5+病原菌、只接病原菌(阳性对照)6个处理，每个处理设3个重复。

黄芪根腐病分级标准为0级：无症状；1级：离体块茎轻微腐烂，0＜腐烂程度＜1/5整个离体块茎；2级：离体块茎部分腐烂，1/5＜腐烂程度＜2/5整个离体块茎；3级：离体块茎轻微腐烂，2/5＜腐烂程度＜3/5整个离体块茎；4级：离体块茎轻微腐烂3/5＜腐烂程度＜4/5整个离体块茎；5级：离体块茎完全腐烂 (《半夏软腐病内生拮抗真菌的筛选及鉴定》)。病情指数＝∑(各级病片数×病情级别值)/(调查总片数×最高级别值)×100；防治效果＝(对照病情指数- 处理病情指数)/对照病情指数×100％，其中对照病情指数为只接病原菌的处理，处理病情指数为接拮抗菌链霉菌SF2+病原菌或接拮抗菌链霉菌SF5+病原菌的处理。

表8链霉菌SF2和SF5发酵液对黄芪根腐病的防治效果

注：表中数据为平均数±标准误。

结果如表8和图5记载的可知，表明黄芪根腐病菌处理的块根表面及四周均出现明显的腐烂症状，而接拮抗菌SF2+病原菌和接拮抗菌SF5+病原菌显著抑制块根腐烂，其中链霉菌SF2发酵液10倍稀释液对黄芪根腐病的预防效果较好 (84.31％)，5倍稀释液对黄芪根腐病的治疗效果较好(73.53％)；链霉菌SF5 发酵液5倍稀释液对黄芪根腐病的预防效果较好(91.18％)，10倍稀释液对黄芪根腐病的治疗效果较好(83.33％)。由此可见，链霉菌SF2发酵液和链霉菌 SF5发酵液对黄芪根腐病的预防作用都优于治疗作用，空白对照组和拮抗菌的块根保持完好。

实施例6

复配发酵液防治黄芪根腐病试验

选择对黄芪根腐病预防效果和治疗效果均比较强的菌株发酵液稀释液按照 1：1的体积比进行混合即得复配发酵液，复配发酵液的接种及防治效果的计算同实施例5。

由实施例5的结果可知，链霉菌SF5发酵液5倍稀释液对黄芪根腐病的预防效果最强(91.18％)，链霉菌SF5发酵液10倍稀释液对黄芪根腐病的治疗效果最强(83.33％)，所以更优选这2种浓度的发酵液按照1：1的体积比混合，复配发酵液对黄芪根腐病的防治效果见表9。

表9复配发酵液对黄芪根腐病的防治效果

处理	预防效果	治疗效果
			链霉菌SF5发酵液5倍稀释液+10倍稀释液	89.22±0.017	85.29±0.051

注：表中数据为平均数±标准误。

由表9记载的可知，复配发酵液对黄芪根腐病的预防效果为89.22％，低于链霉菌SF5发酵液5倍稀释液对黄芪根腐病的预防效果，复配发酵液对黄芪根腐病的治疗效果为85.29％，高于链霉菌SF5发酵液10倍稀释液对黄芪根腐病的治疗效果，说明复配发酵液在黄芪根腐病的治疗效果方面产生了协同作用。

实施例7

复配发酵液对黄芪根腐病病原菌的抑制作用

为了进一步验证实施例6筛选出的复配发酵液对黄芪根腐病的防治效果，按照实施例3的方法观察并记录复配发酵液对黄芪根腐病菌的抑制作用，结果见表10。

表10复配发酵液对黄芪根腐病菌的抑制作用

	处理	抑菌率(％)
			黄芪根腐病菌F.oxysporum	链霉菌SF5发酵液5倍稀释液+10倍稀释液	55.29±0.015

注：表中数据为平均数±标准误。

由表10记载的可知，复配发酵液对黄芪根腐病菌的抑制作用(55.29％)高于链霉菌SF2和链霉菌SF5对黄芪根腐病菌的抑制作用(42.86％)。

实施例8

防治枸杞炭疽病试验

拮抗菌株发酵液防治枸杞炭疽病试验

选取植株上的健康叶片，75％(v/v)乙醇溶液表面消毒30s，用无菌水冲洗 3次后晾干。采用针刺接种法，在叶片上分别喷施链霉菌SF2发酵液和链霉菌 SF5发酵液的原液(1×10⁸cfu/mL)、5倍(2×10⁷cfu/mL)、10倍(1×10⁷cfu/mL)、 20倍(5×10⁶cfu/mL)的稀释液及病原菌孢子悬浮液(采用实施例4的制备方法得到，具体病原菌详见表10)，喷雾量以刚好均匀、不产生滴液为宜。将处理后的叶片置于底部铺有无菌湿滤纸的培养皿中，28℃保湿黑暗交替培养，4d后观察叶片发病情况并计算防治效果。

拮抗菌株的预防效果试验：先在叶片上分别喷施链霉菌SF2发酵液和链霉菌SF5发酵液的原液、5倍、10倍、20倍稀释液，24h后喷施病原菌孢子悬浮液。

拮抗菌株的治疗效果试验：先在叶片上喷施病原菌孢子悬浮液，24h后分别喷施链霉菌SF2发酵液和链霉菌SF5发酵液的原液、5倍、10倍、20倍稀释液。

试验以喷无菌水为空白对照CK，接种量以喷雾均匀不产生滴液为宜。每处理3个叶片，试验重复3次。

枸杞炭疽病分级标准：0级，无病斑；1级，0＜病斑面积占叶总面积≤25％； 2级，25％＜病斑面积占叶总面积≤50％；3级，50％＜病斑面积占叶总面积≤75％；4级，病斑面积占叶总面积＞75％(枸杞炭疽病生防菌株筛选、生物功能测定及防治效果)。病情指数＝(∑各级病株数×相应级数值)/(调查总株数×最高级数值)×100；防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％。结果见表11和图6。

表11链霉菌SF2发酵液和链霉菌SF5发酵液对枸杞炭疽病的防治效果

注：表中数据为平均数±标准误。

结果如表11和图6记载的可知，枸杞炭疽病病原菌处理的叶片出现病斑，而拮抗菌处理显著抑制病斑生长，对枸杞炭疽病的防治效果均较好，空白对照和拮抗菌处理的叶片保持完好。

实施例9

复配发酵液防治枸杞炭疽病试验

选择实施例8中对枸杞炭疽病菌复合种TJD、TJA、TJCE、WHN7预防效果和治疗效果均比较强的菌株发酵液稀释液(链霉菌SF2发酵液原液和链霉菌 SF5发酵液10倍稀释液)按照1：1的体积比进行混合即得复配发酵液，复合发酵液的接种及防治效果的计算同实施例8。

由实施例8中各个发酵液对枸杞炭疽病菌复合种的整体防效的结果可知，链霉菌SF2发酵液原液对枸杞炭疽病的治疗作用最强(95.84％)，链霉菌SF5 发酵液10倍稀释液对枸杞炭疽病的预防作用最强(85.42％)，所以更优选这2 种浓度的发酵液按照1：1的体积比混合，复配发酵液对对枸杞炭疽病的防治效果见表12和图7。

表12复配发酵液对枸杞炭疽病的防治效果

注：表中数据为平均数±标准误。

由表12和图7记载的可知，复配发酵液对枸杞炭疽病的预防效果都大于 90％，高于链霉菌SF2发酵液原液对枸杞炭疽病的预防效果，复配发酵液对枸杞炭疽病的治疗效果都大于70％。由此可见，提前接种拮抗菌的效果更好，为以后的使用提高参考，说明复配发酵液在枸杞炭疽病的预防效果方面产生了协同作用。

实施例10

复配发酵液对枸杞炭疽病病原菌的抑制作用

为了进一步验证实施例9筛选出的复配发酵液(链霉菌SF2发酵液原液和链霉菌SF5发酵液10倍稀释液按体积比为1:1混合获得的复配发酵液)对枸杞炭疽病的防治效果，按照实施例3的方法观察并记录复配发酵液对枸杞炭疽病菌的抑制作用，结果见表13。

表13复配发酵液对枸杞炭疽病菌的抑制作用

注：表中数据为平均数±标准误。

由表13记载的可知，复配发酵液对枸杞炭疽病菌TJCE的抑制作用(58.82％) 高于链霉菌SF2对枸杞炭疽病菌的抑制作用(42.86％)，复配发酵液对枸杞炭疽病菌TJA的抑制作用(56.82％)高于链霉菌SF2对枸杞炭疽病菌的抑制作用 (55.56％)，复配发酵液对枸杞炭疽病菌TJD的抑制作用(49.07％)高于链霉菌SF5对枸杞炭疽病菌的抑制作用(46.30％)。

由上述实施例记载的可知，将链霉菌SF2和链霉菌SF5联合使用能够有效防治植物病害，不会使引发真菌病害的病原菌产生耐药性，还具有无污染和促生的优势。本发明实施例结果表明：利用本发明所述链霉菌组合物对枸杞炭疽病的预防效果能够达到91.67～98.15％，治疗效果能够达到76.85～90.74％，对枸杞炭疽病菌复合种的抑菌率能够达到42.86％～58.82％；利用本发明所述链霉菌组合物对黄芪根腐病的预防效果能够达到89.22％，治疗效果能够达到85.29％，对黄芪根腐病菌的抑菌率能够达到55.29％。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 宁夏医科大学

<120> 一种防治植物真菌病害的链霉菌、菌剂及其应用和防治植物真菌病害的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1439

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgct taacacatgc aagtcgaacg 60

atgaaccact tcggtgggga ttagtggcga acgggtgagt aacacgtggg caatctgccc 120

ttcactctgg gacaagccct ggaaacgggg tctaataccg gatatcactt ccactcgcat 180

gggtgggggt cgaaagctcc ggcggtgaag gatgagcccg cggcctatca gcttgttggt 240

gaggtaatgg ctcaccaagg cgacgacggg tagccggcct gagagggcga ccggccacac 300

tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg 360

ggcgaaagcc tgatgcagcg acgccgcgtg agggatgacg gccttcgggt tgtaaacctc 420

tttcagcagg gaagaagcga aagtgacggt acctgcagaa gaagcgccgg ctaactacgt 480

gccagcagcc gcggtaatac gtagggcgca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaaga 540

gctcgtaggc ggcttgtcac gtcgggtgtg aaagcccggg gcttaacccc gggtctgcat 600

tcgatacggg ctagctagag tgtggtaggg gagatcggaa ttcctggtgt agcggtgaaa 660

tgcgcagata tcaggaggaa caccggtggc gaaggcggat ctctgggcca ttactgacgc 720

tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 780

cggtgggaac taggtgttgg cgacattcca cgtcgtcggt gccgcagcta acgcattaag 840

ttccccgcct ggggagtacg gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 900

acaagcagcg gagcatgtgg cttaattcga cgcaacgcga agaaccttac caaggcttga 960

catacaccgg aaacgtctgg agacaggcgc ccccttgtgg tcggtgtaca ggtggtgcat 1020

ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1080

gtcctgtgtt gccagcatgc ccttcggggt gatggggact cacaggagac cgccggggtc 1140

aactcggagg aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatgcc ccttatgtct tgggctgcac 1200

acgtgctaca atggccggta caatgagctg cgataccgtg aggtggagcg aatctcaaaa 1260

agccggtctc agttcggatt ggggtctgca actcgacccc atgaagtcgg agttgctagt 1320

aatcgcagat cagcattgct gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380

acgtcacgaa agtcggtaac acccgaagcc ggtggcccaa ccccttgtgg gagggagct 1439

<210> 2

<211> 1416

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgatcatgg ctcaggacga acgctggcgg cgtgcttaac acatgcaagt cgaacgatga 60

accacttcgg tggggattag tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgggcaat ctgcccttca 120

ctctgggaca agccctggaa acggggtcta ataccggata tcaccttcac gggcatctgt 180

gagggtcgaa agctccggcg gtgaaggatg agcccgcggc ctatcagctt gttggtgagg 240

taatggctca ccaaggcgac gacgggtagc cggcctgaga gggcgaccgg ccacactggg 300

actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg 360

aaagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg atgacggcct tcgggttgta aacctctttc 420

agcagggaag aagcgaaagt gacggtacct gcagaagaag cgccggctaa ctacgtgcca 480

gcagccgcgg taatacgtag ggcgcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagagctc 540

gtaggcggct tgtcacgtcg ggtgtgaaag cccggggctt aaccccgggt ctgcattcga 600

tacgggctag ctagagtgtg gtaggggaga tcggaattcc tggtgtagcg gtgaaatgcg 660

cagatatcag gaggaacacc ggtggcgaag gcggatctct gggccattac tgacgctgag 720

gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacggt 780

gggaactagg tgttggcgac attccacgtc gtcggtgccg cagctaacgc attaagttcc 840

ccgcctgggg agtacggccg caaggctaaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa 900

gcagcggagc atgtggctta attcgacgca acgcgaagaa ccttaccaag gcttgacata 960

caccggaaag catcagagat ggtgcccccc ttgtggtcgg tgtacaggtg gtgcatggct 1020

gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgttc 1080

tgtgttgcca gcatgccctt cggggtgatg gggactcaca ggagaccgcc ggggtcaact 1140

cggaggaagg tggggacgac gtcaagtcat catgcccctt atgtcttggg ctgcacacgt 1200

gctacaatgg ccggtacaat gagctgcgat accgtgaggt ggagcgaatc tcaaaaagcc 1260

ggtctcagtt cggattgggg tctgcaactc gaccccatga agtcggagtt gctagtaatc 1320

gcagatcagc attgctgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacgt 1380

cacgaaagtc ggtaacaccc gaagccggtg gcccaa 1416

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagagtttga tcctggctag gaggtgatcc agccgca 37

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtttgatcm tggctcaggg ttaccttgtt acgactt 37

Claims (8)

1.一种防治植物真菌病害的链霉菌，其特征在于，所述链霉菌包括链霉菌（Streptomyces sp.）SF2和/或链霉菌（Streptomyces sp.）SF5；所述的链霉菌SF2的保藏编号为CGMCC No.23418；所述的链霉菌SF5的保藏编号为CGMCC No.23420。

2.一种防治植物真菌病害的菌剂，其特征在于，所述菌剂的有效成分包括权利要求1所述链霉菌。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，当所述菌剂的有效活性成分包括链霉菌SF2时，所述菌剂中链霉菌SF2的活菌数为1×10⁸cfu/mL~4×10⁸cfu/mL；当所述菌剂的有效活性成分包括链霉菌SF5时，所述菌剂中链霉菌SF5的活菌数为1×10⁸cfu/mL~4×10⁸cfu/mL；当菌剂的有效活性成分包括链霉菌SF2和链霉菌SF5时，所述菌剂中链霉菌SF2的活菌数为2.5×10⁶cfu/mL~5×10⁷cfu/mL，链霉菌SF5的活菌数为2.5×10⁶cfu/mL~5×10⁷cfu/mL。

4.权利要求1所述的链霉菌或权利要求2或3所述的菌剂在防治植物真菌病害中的应用；所述真菌病害包括根腐病、炭疽病和叶斑病中的一种或几种。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物包括药用植物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药用植物包括豆科药用植物、桔梗科药用植物和茄科药用植物一种或几种。

7.一种防治植物真菌病害的方法，其特征在于，包括：

采用稀释后的权利要求2或3所述菌剂进行植物真菌病害的防治。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述稀释的倍数为2~3倍；稀释后菌剂的用量为2L/亩。

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