CN105255782A

CN105255782A - 对六价铬具有还原能力的纤维菌及用途

Info

Publication number: CN105255782A
Application number: CN201510777941.0A
Authority: CN
Inventors: 王强锋; 侯勇; 夏中梅; 曾显斌; 朱彭玲; 胡甦; 曾芸
Original assignee: SAAS BIOTECHNOLOGY AND NUCLEAR TECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE; Sichuan Lanyue Science & Technology Co ltd
Current assignee: SAAS BIOTECHNOLOGY AND NUCLEAR TECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE; Sichuan Lanyue Science & Technology Co ltd
Priority date: 2015-11-16
Filing date: 2015-11-16
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2035-11-16
Also published as: CN105255782B

Abstract

本发明为对六价铬具有还原能力的纤维菌及用途，解决土壤中铬污染问题。纤维菌株拉丁名为Cellulosimicrobium？sp.，保藏号为CGMCC？NO？11511。采集铬渣污染土壤，经过筛选、分离纯化得到一株具有六价铬还原能力的菌株。本发明菌株能将毒性强的六价铬还原成毒性较低的三价铬，降低铬离子游离性，减缓铬对植物的胁迫作用，减少植物对铬的吸收量；此外菌株能固氮，易于定殖于植物根际并促进作物生长。本发明菌株可用于铬污染土壤修复，减少铬污染进入食物链，特别适合在已污染土壤上边修复边种植的我国实际种植国情；并且在治理废水中铬污染治理方面也具有较好的应用前景。

Description

对六价铬具有还原能力的纤维菌及用途

技术领域：

本发明涉及六价铬污染的微生物修复领域，具体涉及一株对六价铬具有高效还原能力的菌株及应用方法。

背景技术：

由于人类对金属矿的开采、冶炼、加工及工业生产等活动日益增多，使得大量重金属如铬、铅、镉、汞等进入土壤中，造成严重的环境污染，引起了研究人员的广泛关注。重金属在土壤中不易随水淋溶，不能被微生物降解，并能通过食物链在生物体内富集，甚至转化为毒性更强的化合物。

铬及其化合物是重要的工业原料，广泛应用于电镀、制革、印染等行业，大量含铬废水、废气和废渣的排放对环境造成了严重污染。铬作为常见的重金属污染物之一，在环境中以多种价态存在，其中主要以三价铬和六价铬为主，两者在环境中表现出截然不同的行为特征。六价铬毒性强，溶于水，易被植物吸收，在环境中主要以CrO₄ ^2—、Cr₂O₇ ^2—存在，不易被土壤颗粒吸附，迁移性强，容易造成地下水污染，对生物体产生致突变和致癌的作用。三价铬毒性小，在环境中主要以难溶的氢氧化铬存在，活性较差，对植物的毒害作用较轻，有研究表明六价铬的毒性是三价铬的100倍左右。环境中的三价铬和六价铬可以通过氧化还原反应相互转化。目前针对铬污染土壤的传统修复治理方法有固定化/稳定化、化学还原、化学淋洗、电动修复和植物修复等，但大多对场地要求较高，限制较多；对于含铬工业废水的处理，则有硫酸亚铁法、离子交换法和微生物还原法。而微生物处理技术与传统处理技术相比，具有快速、安全、费用低等优点，被称为新兴的环境友好替代技术。

因此，从铬污染土壤中分离微生物，并充分利用土壤本身的特点，有针对性地将其应用于污染土壤及水体修复，是一种较为理想的修复方法，避免了对在污染修复的同时产生二次污染，经济效益和生态效益显著，对于生态环境保护和可持续发展具有重要意义。

自20世纪70年代起，研究人员发现一些微生物能够还原含铬废水中的六价铬，之后人们在微生物还原六价铬的领域里做了大量相关研究，并分离出多种具有六价铬还原能力的微生物。能够对六价铬进行还原的微生物可以从铬污染严重的地点进行采集分离，如铬渣堆放场、制革污水排放点、矿场以及电镀废水等，并表现出不同的六价铬耐受和还原能力，主要有无色杆菌、大肠杆菌、硫杆菌、芽胞杆菌、脱硫弧菌、微球菌以及假单胞菌等。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种高效抗六价铬毒性的对六价铬具有还原能力的纤维菌。

本发明的另一目的在于提供上述纤维菌在修复六价铬污染土壤和含六价铬的废水处理中的应用。

发明是这样实现的：

对六价铬具有还原能力的纤维菌，其拉丁文名Cellulosimicrobiumsp.，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏日期：2015年10月16日，保藏编号：CGMCCNO.11511。

所述的纤维菌在修复六价铬污染农田土壤的应用。

所述的纤维菌在修复六价铬污染土壤的应用，所述农作物为水稻、小麦、玉米、油菜、蔬菜、水果，在农作物种植过程中施用以纤维菌为主要成分的微生物菌剂，可有效减少土壤中六价铬的含量，减少铬进入植株体内，进而阻止铬通过植株可食器官污染食物。

所述的纤维菌在六价铬污染废水处理中的应用。

所述的纤维菌在六价铬污染废水处理中的应用，该菌株还原六价铬过程中pH值为5—9；初始六价铬浓度不超过300mg/kg；铬污染废水中添加蔗糖、葡萄糖、果糖或淀粉中的一种或其中任意几种的组合，添加量为按废水质量的0.1—1%；铬污染废水中添加硫酸铵、硝酸钾、氯化铵或酵母膏中的一种或其中任意几种的组合，添加量为按废水质量的0.1—1%；铬污染废水中添加碳酸钙，添加量为按废水质量的0.1—0.5%。

本发明纤维菌Cellulosimicrobiumsp.，自编号LY22，详细分离筛选步骤如下：

（1）样品采集：2012年10月采取铬渣污染土壤0—20cm土层样品。

（2）富集培养：称取10g土样于灭菌的液体培养基（液体培养基成分为：蔗糖10g·L^—1，K₂HPO₄2g·L^—1，(NH₄)SO₄1g·L^—1，MgSO₄·7H₂O0.5g·L^—1，CaCO₃0.5g·L^—1，酵母膏0.5g·L^—1，NaCl0.1g·L^—1，铬酸钾0.4g·L^—1，pH7.0）中，28℃培养箱振荡培养48h后吸取10ml培养液进行传代培养，传代5次。

（3）六价铬抗性菌株分离：吸取10ml富集培养液至装有90ml无菌生理盐水的三角瓶中，于28℃摇床振荡30min，再一次吸取1ml到9ml无菌生理盐水中逐步稀释至不同梯度，分别取不同稀释梯度菌悬液0.1ml涂布在含200mg·L^—1六价铬的有氮改良固体培养基（蔗糖10g·L^—1，K₂HPO₄2g·L^—1，(NH₄)SO₄1g·L^—1，MgSO₄·7H₂O0.5g·L^—1，CaCO₃0.5g·L^—1，酵母膏0.5g·L^—1，NaCl0.1g·L^—1，铬酸钾0.8g·L^—1，琼脂18g·L^—1，pH7.0）平板上，于28℃培养箱培养3天，长出的菌株为六价铬抗性菌株。

（4）六价铬抗性菌株划线分离：将步骤（3）中得到的六价铬抗性菌株挑取不同的菌落进行平板划线培养，并进行复筛验证直到分离到纯菌落，将菌株接种到斜面培养基（蔗糖10g·L^—1，K₂HPO₄2g·L^—1，(NH₄)SO₄1g·L^—1，MgSO₄·7H₂O0.5g·L^—1，CaCO₃0.5g·L^—1，酵母膏0.5g·L^—1，NaCl0.1g·L^—1，琼脂18g·L^—1，pH7.0）上，菌长出后放4℃冰箱中备用，并用甘油冷冻管保存一份于—80℃。

（5）纤维菌筛选：六价铬抗性菌株培养至对数期，按1%接种量接种至六价铬浓度为100mg·L^—1的液体培养基（蔗糖10g·L^—1，K₂HPO₄2g·L^—1，(NH₄)SO₄1g·L^—1，MgSO₄·7H₂O0.5g·L^—1，CaCO₃0.5g·L^—1，酵母膏0.5g·L^—1，NaCl0.1g·L^—1，铬酸钾0.4g·L^—1，pH7.0），置28℃培养箱振荡培养48h后离心，用二苯碳酰二肼比色法测定上清液中Cr⁶⁺含量，以不接种菌株的培养液为对照。测定结果表明：与对照相比，接种菌株后，92%的六价铬被还原成三价铬，六价铬还原率高。

（6）菌株固氮能力测定：将菌株点接到Ashby无氮培养基平板（甘露醇10g·L^—1、KH₂PO₄0.2g·L^—1、MgSO₄·7H₂O0.2g·L^—1、NaCl0.2g·L^—1、CaSO₄·2H₂O0.2g·L^—1、CaCO₃5g·L^—1、琼脂18g·L^—1、pH7.2）上，28℃倒置培养5d，菌株能正常生长，转接5次以后仍能正常生长。

对六价铬具有高效还原能力的纤维菌，具有如下特征：

1）菌落形态特征：在高氏一号培养基上菌落不规则、不透明、白色。

2）菌体形态特征：利用电镜形态鉴定和革兰氏染色分析。特征如下：革兰氏阳性，长杆状。

3）生理生化特征：甲基红（+）、V.P反应（+）、过氧化氢酶（+）、氧化酶（+）、明胶水解（+）、吲哚（—）、柠檬酸盐（+）、淀粉（+）。

4）对六价铬还原能力：

本发明在实验室条件下验证结果表明该纤维菌对六价铬有高效还原作用，可用于重金属铬污染土壤及水体的生物修复。

5）分子生物学鉴定：利用16SrDNA鉴定，采用通用引物27F和1492R扩增其16SrDNA并测序，再与NCBIGenBank核酸数据库比对，同源性为99%，鉴定为纤维菌Cellulosimicrobiumsp.。

6）将上述分离得到的菌株命名为LY22，经形态学特征观察和分子生物学鉴定，确认该菌为纤维菌（Cellulosimicrobiumsp.）。该菌株于2015年10月16日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。其保藏号为CGMCCNO.11511。分类命名为：纤维菌（Cellulosimicrobiumsp.）。

本发明通过大棚条件下用六价铬污染的土壤接种该菌株进行盆栽放大种植试验，结果表明该菌对六价铬具有高效还原作用，能减少土壤中六价铬的含量，高效阻止铬进入植物体内，减缓六价铬对植株胁迫作用，促进作物生长。在实验室条件下，六价铬污染废水接种该菌株进行处理，结果表明该菌能有效还原水体中六价铬，水体由“黄”变清，六价铬还原率达92%以上。该菌株对六价铬污染的土壤、水体生物修复方面有着良好的应用前景。

以下节具体实施方式来进一步说明本发明提供的纤维菌的用途。

具体实施方式：

实施例1：

纤维菌（Cellulosimicrobiumsp.）LY22的制备方法，具体操作如下：

（2）富集培养：称取10g土样于灭菌的液体培养基中，28℃培养箱振荡培养48h后吸取10ml培养液进行传代培养，传代5次。液体培养基成分为：蔗糖10g·L^—1，K₂HPO₄2g·L^—1，(NH₄)SO₄1g·L^—1，MgSO₄·7H₂O0.5g·L^—1，CaCO₃0.5g·L^—1，酵母膏0.5g·L^—1，NaCl0.1g·L^—1，铬酸钾0.4g·L^—1，pH7.0。

（3）六价铬抗性菌株分离：吸取10ml富集培养液至装有90ml无菌生理盐水的三角瓶中，于28℃摇床振荡30min，再一次吸取1ml到9ml无菌生理盐水中逐步稀释至不同梯度，分别取不同稀释梯度菌悬液0.1ml涂布在含200mg·L^—1六价铬的（蔗糖10g·L^—1，K₂HPO₄2g·L^—1，(NH₄)SO₄1g·L^—1，MgSO₄·7H₂O0.5g·L^—1，CaCO₃0.5g·L^—1，酵母膏0.5g·L^—1，NaCl0.1g·L^—1，铬酸钾0.8g·L^—1，琼脂18g·L^—1，pH7.0）上，于28℃培养箱培养3天，长出的菌株为六价铬抗性菌株。

（4）六价铬抗性菌株划线分离：将步骤（3）中得到的六价铬抗性菌株挑取不同的菌落进行平板划线培养，并进行复筛验证直到分离到纯菌落为止，将菌株接种到斜面培养基（蔗糖10g·L^—1，K₂HPO₄2g·L^—1，(NH₄)SO₄1g·L^—1，MgSO₄·7H₂O0.5g·L^—1，CaCO₃0.5g·L^—1，酵母膏0.5g·L^—1，NaCl0.1g·L^—1，琼脂18g·L^—1，pH7.0）上，菌长出后放4℃冰箱为最终产品，并用甘油冷冻管保存一份于—80℃保藏备用。

（5）纤维菌筛选：六价铬抗性菌株培养至对数期，按1%接种量接种至六价铬浓度为100mg·L^—1的液体培养基（蔗糖10g·L^—1，K₂HPO₄2g·L^—1，(NH₄)SO₄1g·L^—1，MgSO₄·7H₂O0.5g·L^—1，CaCO₃0.5g·L^—1，酵母膏0.5g·L^—1，NaCl0.1g·L^—1，铬酸钾0.4g·L^—1，pH7.0），置28℃培养箱振荡培养48h后离心，用二苯碳酰二肼比色法测定上清液中Cr⁶⁺含量，以不接种菌株的培养液为对照。测定结果表明：与对照相比，接种菌株后,92%的六价铬被还原成三价铬。

（6）菌株固氮能力测定：将菌株点接到Ashby无氮培养基平板上，28℃倒置培养5d，菌株能正常生长，转接5次以后仍能正常生长。Ashby无氮培养基成分为：甘露醇10g·L^—1、KH₂PO₄0.2g·L^—1、MgSO₄·7H₂O0.2g·L^—1、NaCl0.2g·L^—1、CaSO₄·2H₂O0.2g·L^—1、CaCO₃5g·L^—1、琼脂18g·L^—1、pH7.2。

对六价铬具有高效还原能力的纤维菌，该菌株具有如下特征：

3）生理生化特征：甲基红（+）、V.P反应（+）、过氧化氢酶（+）、氧化酶（+）、明胶水解（+）、吲哚（—）、柠檬酸盐（+）、淀粉（—）。

4）对六价铬还原能力：

实施例2：

纤维菌在还原土壤中六价铬，阻隔铬进入植株体内，并促进植物生长的应用，具体操作如下：

1、材料

菌株：纤维菌（Cellulosimicrobiumsp.）LY22，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏号为CGMCCNO.11511。

种植介质：六价铬污染土壤，六价铬污染浓度30mg·kg^—1

种植容器：容积为2升的栽培盆

蔬菜幼苗：小白菜幼苗

2、操作方法及步骤：

（1）菌液制备：将纤维菌（Cellulosimicrobiumsp.）LY22斜面菌株接种到装有有氮改良液体培养基的三角瓶中，35℃、150r/min振荡培养，待菌液在600nm波长下吸光度达0.6~0.8时，按1%~5%接种量（V/V）接种到装有有氮改良培养基的发酵罐中，35℃，搅拌速度180r/min，通无菌空气进行发酵，发酵36h，菌液中有效纤维菌活菌数不低于5×10⁹个/毫升。有氮改良培养基成分为：蔗糖10g·L^—1，K₂HPO₄2g·L^—1，(NH₄)SO₄1g·L^—1，MgSO₄·7H₂O0.5g·L^—1，CaCO₃0.5g·L^—1，酵母膏0.5g·L^—1，NaCl0.1g·L^—1，琼脂18g·L^—1，pH7.0。

（2）固体菌剂制备：调节菌液pH至7.2—7.4，将稻糠、白炭黑、轻质碳酸钙按一定比例与菌液混合制备成固体菌剂，菌剂中稻糠、白炭黑、轻质碳酸钙和菌液的质量比例为2:2:2:1，固体菌剂含水量低于15%，纤维菌的有效活菌数不低于2×10⁸个/g。

（3）种植介质准备：以每盆2公斤六价铬污染土壤；

（4）土壤修复处理及秧苗移栽：将按每公斤土壤施用50g固体菌剂的使用量，将土壤与固体菌剂均匀混合，浇水使土壤保持湿润，平衡2周以后，移栽小白菜幼苗至处理后的土壤中，并取土样测定六价铬含量；同时设置不使用菌剂的土壤作对照；

（4）小白菜种植日常管理，至收获期测定小白菜的生物量，并取叶片测定铬含量。结果如下表：

	土壤中六价铬含量（mg/kg）	叶片中铬含量（mg/kg）	单株生物量（g）
				对照	29.21±2.11	0.62±0.10	46.52+3.47
处理	8.31±1.52	0.21±0.06	72.23+5.36
				效果	六价铬还原率=72.41%	铬阻隔率=66.13%	增产率=55.27%

注：六价铬还原率==(对照土壤中六价铬的含量—处理土壤中六价铬的含量)÷对照土壤中六价铬的含量×100%

铬阻隔率=(对照的植物生长器官中铬的含量—处理的植物生长器官中铬的含量)÷对照的植物生长器官中隔的含量×100%

增产率=(处理的植物单株生物量—对照的植物单株生物量)÷对照的植物单株生物量×100%

实施例3：

纤维菌在还原废水中六价铬的应用，具体操作如下：

1、材料

介质：六价铬污染废水，六价铬污染浓度200mg·kg^—1

容器：容积为100升的塑料桶

2、操作方法及步骤

（1）菌液制备：同实施例2。

（2）介质准备：每个塑料桶里面装50L含六价铬的废水。

（3）处理：调节废水pH为5—9，铬污染废水中添加蔗糖、葡萄糖、果糖或淀粉中的一种或其中任意几种的组合（葡萄糖、蔗糖和淀粉所占质量比例为2:2:1），添加量为按废水质量的0.1—1%；铬污染废水中添加硫酸铵、硝酸钾、氯化铵或酵母膏中的一种或其中任意几种的组合（硫酸铵和酵母膏所占质量比例为1:1），添加量为按废水质量的0.1—1%；铬污染废水中添加碳酸钙，添加量为按废水质量的0.1—0.5%；按废水质量的5%—10%添加菌液（制备方法同（1）菌液制备：将纤维菌（Cellulosimicrobiumsp.）LY22斜面菌株接种到装有有氮改良液体培养基的三角瓶中，35℃、150r/min振荡培养，待菌液在600nm波长下吸光度达0.6~0.8时，按1%~5%接种量（V/V）接种到装有有氮改良培养基(培养基成分为：蔗糖10g·L^—1，K₂HPO₄2g·L^—1，(NH₄)SO₄1g·L^—1，MgSO₄·7H₂O0.5g·L^—1，CaCO₃0.5g·L^—1，酵母膏0.5g·L^—1，NaCl0.1g·L^—1，琼脂18g·L^—1，pH7.0)的发酵罐中，35℃，搅拌速度180r/min，通无菌空气进行发酵，发酵36h，菌液中有效纤维菌活菌数不低于5×10⁹个/毫升）。上述材料添加完毕以后混合均匀，曝气96h后测定废水中六价铬含量。同时设置不做任何处理的废水为对照。结果如下表：

	废水中六价铬含量（mg/kg）
		对照	198.35±2.76
处理	15.32±1.03
		六价铬还原率（%）	92.28

根据上述试验效果表明，本发明提供的纤维菌（Cellulosimicrobiumsp.）LY22对重金属六价铬具有很强的还原能力，降低土壤中六价铬含量，对铬进入植株体内具有显著的阻隔效应，有效地减少了农作物中有害物质累积，并能促进作物生长，特别适合在已污染土壤上边种植边修复的我国实际种植国情。此外，在含六价铬的废水处理方面具有很好的效果。因此，在六价铬污染土壤和水体的微生物修复方面具有良好的应用前景。

上述实施例是对本发明的上述内容作进一步的说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于上述实施例。凡基于上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

Claims

1.对六价铬具有还原能力的纤维菌，其特征在于其拉丁文名Cellulosimicrobiumsp.，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2015年10月16日，保藏编号：CGMCCNO.11511。

2.如权利要求1所述的纤维菌在修复六价铬污染农田土壤的应用。

3.根据权利要求2所述的纤维菌在修复六价铬污染土壤的应用，其特征在于所述农作物为水稻、小麦、玉米、油菜、蔬菜、水果，在农作物种植过程中施用以纤维菌为主要成分的微生物菌剂，可有效减少土壤中六价铬的含量，减少铬进入植株体内，进而阻止铬通过植株可食器官污染食物。

4.根据权利要求1所述的纤维菌在六价铬污染废水处理中的应用。

5.根据权利要求4所述的纤维菌在六价铬污染废水处理中的应用，其特征在于：该菌株还原六价铬过程中pH值为5—9；初始六价铬浓度不超过300mg/kg；铬污染废水中添加蔗糖、葡萄糖、果糖或淀粉中的一种或其中任意几种的组合，添加量为按废水质量的0.1—1%；铬污染废水中添加硫酸铵、硝酸钾、氯化铵或酵母膏中的一种或其中任意几种的组合，添加量为按废水质量的0.1—1%；铬污染废水中添加碳酸钙，添加量为按废水质量的0.1—0.5%。