CN111254082A - 一种耐盐居白蚁菌及其在生产海藻液肥中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明于提供一种能降解海带的菌种，为耐盐居白蚁菌(Isoptericola salitolerans)ISO‑49菌株，其保藏编号为CGMCC No.18975。本发明所提供的耐盐居白蚁菌ISO‑49可用于发酵海带来生产海藻液肥。本发明所用菌种ISO‑49具有很强的产褐藻胶裂解酶的能力，能快速破坏海带细胞壁的结构，释放海带的营养物质。产生的褐藻胶裂解酶能分解海带中的褐藻胶多糖，使其降解为容易吸收利用的小分子物质。发酵后的海藻多糖的得率远高于一般酶法提取海藻多糖的得率。

Description

一种耐盐居白蚁菌及其在生产海藻液肥中的应用
技术领域
本发明属于功能发酵菌株筛选技术领域，具体涉及一种耐盐居白蚁菌及其在生产海藻液肥中的应用。
背景技术
海藻肥主要是以大型经济海藻(巨藻、海带、马尾藻、昆布和泡叶藻等)作为主要的原料，经过科学加工制成的生物肥料。海藻肥作为一种纯天然的海藻提取物，极大程度保留了有利于植物生长发育的生物活性物质和富集在海藻体内的矿物质营养元素，包括海藻多糖、酚类物质、甘露醇、甜菜碱、促植物生长物质(生长素、细胞分裂素、赤霉素和脱落酸等)，以及氮、磷、钾、铁和碘等微量元素。其中海藻多糖是海带藻体的主要成分，具有多种生物活性，能增加土壤透气能力，促进土壤团粒结构形成，具有提高植物的抗性和改良土壤作用。
海带是一种大型的褐藻，不仅含各类矿质元素、有机酸和多糖类物质，而且还含有多种天然植物生长调节剂。2017年我国海带养殖产量为148万吨，占世界养殖海带总产量的近9成。其中山东荣成海带养殖面积11.5万亩，约占全国海带产量的一半，是全国最大的海带制品生产基地。
以海带为原料生产海藻肥的生产工艺主要是将海带藻体消解，包括如下两个步骤：首先将海带细胞壁破碎，使海带中的营养物质释放出来；其次是将海带中的大分子物质转化为易被植物吸收利用的小分子物质。目前生物法生产海藻肥，主要包括有酶解法和微生物发酵法。其中酶解法主要是利用酶破坏海藻细胞壁的结构，但酶解法对生产设备要求较高，并且酶制剂的成本也较高。
微生物发酵法主要通过微生物在生长代谢过程中自身产生的多种酶系来破坏海带的细胞壁结构，降解海带中的大分子多糖物质。这些物质能被植物很好地吸收，而且微生物代谢过程中释放的代谢产物，也可以促进植物生长。微生物发酵法生产海藻液肥发酵过程可控，环境友好，适于工业化规模生产。
但目前利用海带生产海藻肥所使用过的菌株，有2个问题：(1)菌种耐盐性方面，有的需要添加氯化钠或海水素才能生长；而有的菌种耐盐性差，不能直接发酵腌制干海带。本发明的菌种，生长盐度范围为0％-11％(w/v)，无需添加氯化钠或海水素，对鲜海带或腌制干海带均能直接发酵，生产的海藻液肥也适用于盐碱地的土壤改良。(2)海藻多糖是天然土壤调理剂，目前使用的菌种主要是芽孢菌、乳酸菌和酵母菌等，对于海带中大分子多糖物质的降解效果不理想，不能将海带中的活性成分尽可能释放出来，海带发酵液中海藻多糖的含量不高。本发明的菌种，发酵后海藻多糖的得率较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能降解海带的菌种，用于发酵海带，生产海藻液肥；使用本发明的菌株制备海藻肥的工艺简单，发酵过程稳定可控，环境友好，适于工业化规模生产，具有良好的应用前景。
本发明首先提供的一种具有降解海带功能的耐盐居白蚁菌(Isoptericolasalitolerans)ISO-49菌株，其保藏编号为CGMCC No.18975，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年11月19日。
本发明所提供的耐盐居白蚁菌ISO-49可用于发酵海带来生产海藻液肥；
本发明另一个方面还提供一种发酵海带生产海藻液肥的方法，是使用上述的耐盐居白蚁菌ISO-49来发酵海带；
所述的方法，其一种具体的步骤如下：
1)制备种子液：将所述的耐盐居白蚁菌ISO-49接种至液体培养基，温度为30℃，培养24小时；
2)制备发酵液：将1)中制备的种子液，按3％接种量，接种至液体培养基，温度为30℃，培养48-72小时；
3)制备产品A：将干海带粉碎至60目筛网过筛，添加褐藻酸钠和无机盐等辅料，装入发酵罐，再按照料水质量比1:10加入水，并调整pH为6.0，100-120℃灭菌20min，得到产品A；
4)制备产品B：将2)的发酵液加入到产品A中得到产品B，其中发酵液与产品A的质量比为20-30:100；
5)制备产品C：温度为30℃，对产品B进行发酵，时间为5-6天，过滤收集海带发酵液为海藻液肥，过滤后的海带滤渣烘干，另作海带渣肥料；
所述的褐藻酸钠和无机盐等辅料，以添加的辅料占料水总质量的百分比计，分别为：褐藻酸钠1％，磷酸二氢钾0.5-1％，硫酸镁0.5-1％。
所述的液体培养基为褐藻酸钠1％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，用NaOH溶液调pH6.0，121℃灭菌20min。
本发明具有以下几个优点：
1)本发明所用菌种ISO-49具有很强的产褐藻胶裂解酶的能力，能快速破坏海带细胞壁的结构，释放海带的营养物质。产生的褐藻胶裂解酶能分解海带中的褐藻胶多糖，使其降解为容易吸收利用的小分子物质。发酵后的海藻多糖的得率远高于一般酶法提取海藻多糖的得率。
2)目前用于发酵海藻制备海藻液肥的菌种，还没有能作为解磷菌肥使用的相关报道。本发明所用菌种ISO-49具有解磷的功能，菌株ISO-49可以直接作为一种微生物菌肥，将土壤中被固定的磷酸盐通过溶解释放，有利于植物的吸收利用，促进植物生长。
3)由于菌种ISO-49具有耐盐性和耐碱性，可以直接发酵新鲜海带或腌制海带，生产的海藻液肥，含有的各种天然活性物质和矿质元素，可以作为常规施肥的补充，对植物生长有明显促进作用，也适用于盐碱地的土壤改良。
附图说明
图1：ISO-49菌株产褐藻胶裂解酶平板图；
图2：ISO-49菌株降解海带块效果图；
图3：ISO-49细胞照片图；
图4：基于16S rRNA基因序列的系统发育树图；
图5：不同初始褐藻酸钠浓度下ISO-49菌株产褐藻胶裂解酶的变化图；
图6：不同发酵温度下ISO-49菌株产褐藻胶裂解酶的变化图；
图7：不同发酵pH值下ISO-49菌株产褐藻胶裂解酶的变化图；
图8：ISO-49菌株在解磷平板生长图；
图9：海带液肥对浙江红美人生长的影响叶片照片图；
图10：海带液肥对浙江红美人生长的影响的全株照片图。
具体实施方式
本发明中所用的培养基的配比如下：
产褐藻胶裂解酶筛选培养基：褐藻酸钠，20g；蛋白胨，5g；酵母膏，1g；磷酸高铁，0.1g；海盐，10.0g；琼脂，15g，蒸馏水1000mL；用NaOH溶液调pH7.0-7.2左右，121℃灭菌20min。
复筛液体种子培养基：褐藻酸钠，10g；蛋白胨，5g；酵母提取物，1g；K2HPO4，2g；1000mL蒸馏水配制。用NaOH溶液调pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min。
海带块降解液体培养基：海带块，20g；酵母粉，0.2g；蒸馏水200mL，121℃灭菌20min。
液体发酵培养基：褐藻酸钠，10g；酵母提取物，1g；(NH4)2SO4，5g；K2HPO4，2g；MgSO4.7H2O，1g；pH值7.0，1000mL蒸馏水配制。121℃灭菌20min。
解磷平板培养基：葡萄糖，10g；磷酸三钙，5g；硫酸铵，0.5g；酵母粉，0.5g；氯化钠，0.3g；氯化钾，0.3g；硫酸镁，0.3g；硫酸亚铁，0.03g；硫酸锰，0.03g；琼脂，15g，蒸馏水1000mL；用NaOH溶液调pH 7.0-7.2左右，121℃灭菌20min。
解磷液体培养基：葡萄糖，10g；磷酸三钙，5g；硫酸铵，0.5g；酵母粉，0.5g；氯化钠，0.3g；氯化钾，0.3g；硫酸镁，0.3g；硫酸亚铁，0.03g；硫酸锰，0.03g；蒸馏水1000mL；用NaOH溶液调pH 7.0-7.2左右，121℃灭菌20min。
为了更好了解本发明，以下通过实施例和附图做进一步说明。
实施例1：耐盐居白蚁菌ISO-49的筛选和鉴定
步骤1：采集样品
采集荣成9个不同地点海带养殖区的海水、底泥和海带样品。其中海水样品直接采用稀释涂布法分离。海泥和海带样品需要稀释振荡后再采用稀释涂布法分离。
具体操作如下：
分别取10克海泥和10克海带样品(提前用无菌剪刀剪成小块)，加到90mL无菌生理盐水中，室温150r/min转速下，振荡2个小时制成样品液。
分别取0.1mL样品液直接涂布到2216E培养基(Difco，货号：212185)上，倒置于30℃培养5天后，挑取平板上长出的单菌落，在2216E培养基平板上进行划线纯化。一共分离到93株单克隆菌落。
步骤2：产褐藻胶裂解酶菌株的初筛
将分离的海洋细菌接种到产褐藻胶裂解酶筛选培养基平板上，培养置于30℃培养箱中培养4-5天，直接观察是否有透明圈产生，如果没有肉眼直接可见透明圈，则加入10％氯化钙，静置30分钟后，再观察是否有透明圈。
共筛选到22株在能产褐藻胶裂解酶筛选培养基上出现透明圈的细菌，其中ISO-49菌株分离自海带养殖区底泥，该菌株在产褐藻胶裂解酶筛选培养基平板上培养3天，不加10％氯化钙，即可观察到明显的透明圈(如图1所示)。
步骤3：降解海带块实验复筛
将初筛产褐藻胶裂解酶的菌株，接种于复筛液体种子培养基，培养温度为30℃，置摇床上以150r/min的转速培养20-24h至对数生长中期，按5％接种量接入海带块降解液体培养基，培养温度为30℃，150r/min，培养3-4天，观察海带块降解情况，做进一步复筛具有海带降解功能的菌株。
筛选结果表明ISO-49菌株降解海带块效果最好，经过3天，将海带块基本全部降解，结果如图2所示。ISO-49菌株最终作为筛选菌株。
步骤4：对ISO-49菌株进行分类鉴定
1)形态学特征：在2216E培养基上，30℃培养24h后，菌落直径大小为1-2mm，淡黄色，圆形，边缘整齐。革兰氏阳性菌，严格好氧，镜检结果显示，细胞形态多样化，呈球状或杆状(0.7-1.2×0.8-5.5μm)(如图3所示)，不运动。
2)表型特征鉴定：参照《常见细菌系统鉴定手册》。ISO-49菌株生长盐度范围为0％-11％(w/v)(最适2-5％)，生长pH范围为5.5-9.0(最适6.5-7.0)，生长温度范围为4℃-45℃(最适25-30℃)。能产褐藻胶裂解酶、几丁质酶、明胶、淀粉酶和纤维素酶，能降解磷酸钙，β-半乳糖苷酶和触酶呈阳性，具有硝酸盐还原能力，氧化酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、柠檬酸盐利用实验、产硫化氢实验、脲酶、吲哚试验和VP实验结果均为阴性，不能利用葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁甙和阿拉伯糖发酵产酸。
3)16S rRNA基因分子鉴定
16S rRNA基因模板的制备：使用天根细菌DNA提取试剂盒(DP302-02)，按照说明书步骤操作，得到ISO-49菌体的DNA样品。
PCR扩增：PCR扩增所用引物为27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1541R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。PCR反应体系60μL：2×Taq Mix30μL，引物：27F，1541R各3μL，模板3μL，无菌水补足至60μL。PCR反应条件：95℃，5min；94℃，45s；57℃，1min30 s；72℃，1min 30s，30个循环；72℃，10min。
将PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司进行双向测序，确定其序列为SEQ IDNO:1。
将测序好的序列通过NCBI的BLAST与Genbank序列数据库进行同源性序列对比分析，发现菌株ISO-49属于白蚁菌属，与其16S rRNA基因序列相似性最高的是Isoptericolasalitolerans。利用MEGA 7.0软件，选取白蚁菌属已正式发表的种，以邻接法(neighbour-joining)构建系统发育树(如图4所示)，发现菌株ISO-49与Isoptericola salitolerans聚类在一个分支上，表明菌株ISO-49与Isoptericola salitolerans系统发育关系最近。
细菌细胞形态鉴定方面，一般来说，单个菌株细胞形态呈现多样化，非常少见，菌株ISO-49球状或杆状细胞形态特征，与该白蚁菌属细胞形态多样化(球状或杆状)相一致，进一步说明菌株ISO-49属于白蚁菌属。
因此该菌最终被命名为耐盐居白蚁菌ISO-49。该菌已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.18975，保藏日期为2019年11月19日。
菌种的保藏：长期保存可以将菌液加入到含甘油终浓度为20％的甘油管里，放入-80℃冰箱保存备用；短期保存：划线到LB斜面上，在4℃保存。
实施例2：耐盐居白蚁菌ISO-49产褐藻胶裂解酶能力
褐藻胶裂解酶酶活测定方法如下：
采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法检测褐藻胶裂解酶的活性。以反应液中还原糖的增加量作为酶活力的检测指标，还原糖的增加量利用DNS试剂测定。以葡萄糖为标准物做标准曲线，根据反应组和对照组吸光度的差值计算还原糖的生成量。1个酶活力单位定义为反应液在上述条件下，每分钟产生1μg还原糖所需要的酶量。
取0.1mL离心后的发酵上清液(粗酶液)，与0.9mL 0.3％褐藻酸钠溶液(溶于0.01mol/L PBS缓冲溶液中)混匀，于37℃水浴中反应40分钟，对照组中的粗酶液需煮沸10分钟灭活。在1mL反应体系中加入1mL DNS试剂终止反应，沸水浴反应5分钟，冷却定容到10mL。以蒸馏水为空白，在520nm下测定吸光度。以葡萄糖为标准物做标准曲线，根据反应组和对照组吸光度的差值计算还原糖的生成量。
从斜面接种ISO-49菌体到30mL复筛液体种子培养基(100mL三角瓶)中，30℃，150r/min培养24h，取培养至对数生长期的种子液2mL接入100mL液体发酵培养基(250mL三角瓶)中发酵培养。在150r/min转速下，经过不同的褐藻酸钠初始浓度、反应液pH值、不同温度进行发酵培养后，8000rpm,4℃离心10min，取上清用DNS法测褐藻胶裂解酶酶活。
对ISO-49产褐藻胶裂解酶的条件进行了优化：
1)ISO-49产褐藻胶裂解酶的最适褐藻酸钠初始浓度
从图5可看出，ISO-49产褐藻胶裂解酶是诱导酶，不添加褐藻酸钠时，不能产酶，随着初始褐藻酸钠浓度的升高，相对酶活逐渐增强，初始褐藻酸钠浓度超过1％，酶活下降，故初始褐藻酸钠浓度为1％时，酶活最高。
2)ISO-49产褐藻胶裂解酶的最适反应温度
从图6可看出，20℃-30℃范围内，随温度的升高，酶活逐渐增强，温度为30℃时，酶活最高，超过30℃酶活下降，故发酵产褐藻胶裂解酶的最适温度为30℃。
3)ISO-49产褐藻胶裂解酶的最适反应pH值
从图7可看出，当pH<6时，pH越大，酶活越大，pH＝6时酶活最高，当pH>6后酶活下降，因此ISO-49菌株发酵产褐藻胶裂解酶的最适pH为6。
实施例3：耐盐居白蚁菌ISO-49发酵海带中褐藻多糖的能力检测
步骤1：将干海带粉碎至60目筛网过筛，4℃保存。
步骤2：将菌株ISO-49接种于复筛液体种子培养基，培养温度为30℃，置摇床上以150r/min的转速培养24h后，制备菌株ISO-49发酵液。
步骤3：称取海带粉100g，褐藻酸钠10g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁5g，再加入800mL水，搅拌均匀，并调整pH6.0，121℃灭菌20min。
步骤4：加入100mL的ISO-49发酵液，温度为30℃，进行发酵，时间为6天制成海带液肥。
对照组不加菌液，用100毫升无菌液体种子培养基替代。
步骤5：测定发酵后海带溶液中的褐藻多糖含量。测定方法参照SNT 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的测定苯酚-硫酸法》中的相关步骤。
葡萄糖标准曲线的绘制：
称取105℃下干燥至恒重的分析纯葡萄糖0.06g，加水定容至100mL，配置成浓度为600μg/mL的葡萄糖。分别吸取置于10mL具塞试管中，加蒸馏水补至1mL，再加6％的苯酚溶液1mL，摇匀，马上加入浓硫酸5mL，摇匀，100℃加热40min，在490nm下测定吸光度，绘制葡萄糖标准曲线。
样品多糖提取液的制备：
吸取发酵上清液样品200μL于50mL离心管，用5mL水浸润样品，缓慢加入20mL无水乙醇，使用涡旋振荡器振摇，混合均匀，置于超声波提取器中超声提取30min。提取结束后，4000r/min离心10min后，弃去上清液。用水将洗涤、离心后得到的不溶物转移入圆底烧瓶，置于超声波提取器中超声提取30min，重复2次。冷却至室温，过滤，将上清液转移至200mL容量瓶中，残渣洗涤2次～3次，洗涤液转至容量瓶，加水定容。此溶液为样品测定液。
吸取1mL样品测定液，加6％的苯酚溶液1mL，摇匀，马上加入浓硫酸5mL，摇匀，100℃加热40min，在490nm波长下测定吸光度，根据标准曲线计算多糖含量。
海带多糖的得率％＝多糖提取液中多糖的质量/原始海带粉的质量×100％，
测定结果表明发酵后海带的溶液中多糖的得率为40％，而目前文献报道的采用复合酶(褐藻胶裂解酶，纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶等)法提取海带多糖的得率一般在10％-20％之间。
实施例4：耐盐居白蚁菌ISO-49的解磷性能测定
步骤1：将ISO-49接种解磷平板培养基，30℃培养3-4天后，进行观察。如图8所示，该平板出现明显的透明圈，表明ISO-49菌株具有解磷的功能。
步骤2：磷标准曲线绘制：分别取5μg/L的磷标准液0-5mL，在50mL的容量瓶中，移液器准确加10mL浓度为0.5mol/L的NaHCO3溶液，用双蒸水定容至50mL，摇匀。使标准液中磷含量分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5μg/mL，室温静置20分钟，在700nm波长下测定吸光度，绘制磷标准曲线。
步骤3：将菌株ISO-49接种于20mL的LB液体培养基，培养温度为30℃，置摇床上以150r/min的转速培养24h后，按1％接种量，接入200mL的解磷液体培养基，30℃，150r/min条件下培养5天，1000r/min离心15min后，取上清液，作为测定可溶性磷含量的样品。
采用钼锑抗比色法测定有效磷含量。取500μL上清液到50mL容量器内，加入40μL的二硝基苯酚，混合，加入20μL稀硫酸，等到反应液为无色透明时，再加入5mL钼锑抗显色剂。定容到标线。室温静置30分钟，在700nm下测定吸光度。以未接菌培养基为空白对照，计算菌株的溶磷量。钼锑抗显色剂购自组织总磷含量检测试剂盒(Solarbio，BC2850)。
结果：以不溶性的磷酸三钙为唯一磷源，菌株ISO-49发酵5天后，发酵液中可溶性磷的含量为467mg/L。
实施例5：海藻液肥对绿豆种子萌发的影响
步骤1：将干海带粉碎至60目筛网过筛，4℃保存。
步骤2：将菌株ISO-49从斜面接种于复筛液体种子培养基，培养温度为30℃，置摇床上以150r/min的转速培养24h后，制备菌株ISO-49种子液。
步骤3：将制备的种子液，按3％接种量，接种至液体发酵培养基，温度为30℃，培养48-72小时；
步骤4：过筛的海带粉，按照以下配比添加辅料：褐藻酸钠1％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸镁0.5％，装入发酵罐，按照最终料水质量比1:10加入水，并调整pH为6.0，100-120℃灭菌20min；
步骤5：温度为30℃，进行发酵，时间为6天，过滤收集海带发酵液为海藻液肥；
步骤6：将海藻液肥分别稀释100、300、500、800和1000倍，蒸馏水作为对照组。
步骤7：从农贸市场购绿豆种子。每次处理种子100粒，将绿豆种子用水冲洗，用75％乙醇浸泡5-10分钟消毒，再用蒸馏水洗涤，浸泡在对照组和不同稀释倍数的海藻液肥溶液中，25℃浸泡12小时，在13cm×19cm×12cm大发芽盒中，铺上2层棉纱布，将浸泡好的绿豆种子以适当的距离平铺在纱布上，用水保持湿润，25℃培养箱避光培养，每12小时喷洒一次蒸馏水，绿豆种子在4天后，计算发芽率，测定发芽种子的根长和上下胚轴长度。
由表1可以看出，海藻液肥能明显促进绿豆种子的萌发，绿豆种子的出芽率、根长和上下胚轴的长度高于其它实验组。稀释300倍和500倍的海藻液肥处理效果较好，绿豆的发芽率比对照组分别提高了7.6％和7.4％，根长比对照组分别提高了44％和35％，上胚轴的长度分别提高了59.3％和53.1％，下胚轴的长度分别提高了23.3％和19.4％。稀释300倍的海藻液肥效果最好。
表1：海藻液肥对绿豆种子发芽的影响表
海藻肥浓度 发芽率(％) 根长/cm 上胚轴/cm 下胚轴/cm
对照 90.2c 4.5a 3.2c 7.7b
稀释100倍 94.3b 5.5b 4.0b 8.1a
稀释300倍 97.1b 6.5b 5.1b 9.5a
稀释500倍 96.8a 6.1c 4.9a 9.2b
稀释800倍 91.5b 5.1a 4.2a 7.5b
稀释1000倍 91.8a 4.3b 3.1b 7.9c
(注：同列数据后小写字母表示P<0.05水平差异有统计学意义)
实施例6：海藻液肥对黑叶葵扇白菜生长的影响
供试作物：黑叶葵扇白菜。
供试肥料：所用基肥为氮肥(尿素，用量为300mg/kg)+钾肥(氯化钾，用量为260mg/kg)+磷肥(磷酸三钙，用量1500mg/kg)，共计约1.2g。海藻液肥(制备过程同实施例5，稀释300倍)作为追肥。
盆栽试验采用基肥加追肥的种植方式，每盆装土约0.6kg，将土壤风干砸碎至合适大小，称0.4kg土装盆，后加入基肥1.2g，再加入0.15kg土覆盖在上，完成土壤装盆及施基肥。
播撒白菜种子，追肥4次，每次追肥之间间隔5天。施肥方案见表2。对照组用清水替代海藻液肥。为避免其它因素的影响，放在植物光照培养箱进行培养。
表2：黑叶葵扇白菜海藻液肥施肥方案表
施肥处理 对照组 海藻液肥组
基肥(g) 1.2 1.2
追肥(ml) - 20
清水(ml) 20 -
黑叶葵扇白菜生长周期为30天，生长成熟后，先采收小白菜地上部分，测定株高和鲜重，再放入烘箱105℃杀青半小时，然后75℃烘干至恒重。使用组织总磷含量检测试剂盒(Solarbio，BC2850)测定叶片磷含量。
表3：不同处理条件下白菜的生长情况表
施肥处理组 株高/cm 鲜重/g 叶片全磷含量/％
对照组 26.5a 28.5c 0.61c
海藻液肥组 29.7a 47.8b 0.86a
(注：同列数据后小写字母表示P<0.05水平差异有统计学意义)
表3盆栽实验结果表明，海藻液肥明显促进了小白菜的生长，株高和鲜重分别比对照组提高了12.1％和67.7％。在磷转化方面，叶片总磷的含量比对照组提高了40.9％，说明海藻液肥中含有的ISO-49菌液起到解磷的作用，分解了磷酸三钙，进一步促进了小白菜的生长。
实施例7：海藻液肥对浙江红美人柑橘生长的影响
供试作物：柑橘，品种为“红美人”。
试验时间和地点：试验于2019年4月10日开始，11月16日采果验收。试验安排在浙江省台州市玉环市漩门湾国家湿地公园果蔬基地，红美人种植面积22亩左右。
供试肥料：普通有机肥，康朴诺泰克稳定性复合肥(N:P2O5:K2O＝12:12:17)，海藻液肥(制备过程同实施例5，稀释300倍)。
试验设计方案：试验设2个处理，每个小区6株树，面积100平方米，小区随机区组排列，重复3次。处理1为对照组，常规施肥(亩施普通有机肥100kg+亩施康朴诺泰克稳定性复合肥50kg)+喷施清水，处理2为海藻液肥组，常规施肥(亩施普通有机肥100kg+亩施康朴诺泰克稳定性复合肥50kg)+喷施海藻液肥。除按试验方案要求施肥外，其他管理措施如浇水、病虫害防治等相同。
从图9和图10可以看出，喷施海藻液肥后，红美人柑橘长势好，叶片碧绿发亮，手感油光；而对照组叶片发黄、干燥，手感粗糙。说明海藻液肥对红美人柑橘的生长有显著的影响。
表4：海藻液肥对浙江红美人柑橘产量的影响
Figure BDA0002405098860000121
表4可以看出，常规施肥和喷施海藻液肥管理模式，能增加红美人柑橘单株产量，折合亩产能增产23.2％，因此海藻液肥对红美人柑橘的产量有显著的影响，具有较好的经济效益。
序列表
<110> 荣成市泓派海洋生物科技有限公司
<120> 一种耐盐居白蚁菌及其在生产海藻液肥中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgctgggtg gatcagtggc gaacgggtga gtaacacgtg agcaacctgc cctccacttc 60
gggataagcc ttggaaacgg ggtctaatac cggatatgag cactcatcgc atggtgggtg 120
ttggaaagtt tttccatggg ggatgggctc gcggcctatc agcttgttgg tggggtgatg 180
gcctaccaag gcgtcgacgg gatgccggcc tgagagggcg accggccaca ctgggactga 240
gacacggccc agacgcctac gggaggctgc agtgggaaat attggacatt gggcgaaagc 300
ctgatgcagc gacgccgcgt gagggaagac ggccttcggg ttgtaaacct ctttcagcag 360
ggaagaaggc cttcgggtgg acggttcctg cagaagaagc gccggctaac tacgtgcacg 420
cagccgcggt aatacgtagg gcgcaagcgt tgtccggaat tatcgggcgt aaagagctcg 480
taggcggtct gtcgcgtctg gtgtgaaatc ccatggctca actgtgggcg tgcatcgggt 540
acgggcagac tagagtgcgg taggggagac tggaattcct ggtgtagcgg tggaatgcgc 600
agatatcagg aggaacaccg atggcgaagg caagtctcta ggccgctact gacgctgagg 660
agcgaaagca tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgttg 720
ggcactaggt gtggggctaa ttccacgagt gccgtgccgc agctaacgca ttaagtgccc 780
cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 840
cggcggagca tgcggattaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttaccaagg cttgacatac 900
accggaaaca tccagagatg ggtgccccgt aaggtcggtg tacaggtggt gcatggttgt 960
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgtccca 1020
tgttgccagc gggttatgcc ggggactcat gggagactgc cggggtcaac tcggaggaag 1080
gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgtcttgg gcttcacgca tgctacaatg 1140
gccggtacag agggctgcga taccgtaagg tggagcgaat cccaaaaagc cggtctcagt 1200
tcggattggg gtctgcaact cgaccccatg aagtcggagt cgctagtaat cgcagatcag 1260
caacgctgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaag tcacgaaagt 1320
tggtaacacc 1330

Claims (9)

1.一种耐盐居白蚁菌，其特征在于，所述的耐盐居白蚁菌的保藏编号为CGMCCNo.18975。
2.权利要求1所述的耐盐居白蚁菌在发酵海带制备海藻液肥中的应用。
3.一种发酵海带生产海藻液肥的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的耐盐居白蚁菌来发酵海带制备海藻液肥。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法的步骤如下
1)制备种子液：将权利要求1所述的耐盐居白蚁菌接种至液体培养基，温度为30℃，培养24小时；
2)制备发酵液：将1)中制备的种子液，按3％接种量，接种至液体培养基，温度为30℃，培养48-72小时；
3)制备产品A：将干海带粉碎至60目筛网过筛，添加褐藻酸钠和无机盐等辅料，装入发酵罐，再按照料水质量比1:10加入水，并调整pH为6.0，100-120℃灭菌20min，得到产品A；
4)制备产品B：将2)的发酵液加入到产品A中得到产品B，其中发酵液与产品A的质量比为20-30:100；
5)制备产品C：温度为30℃，对产品B进行发酵，时间为5-6天，过滤收集海带发酵液为海藻液肥。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的褐藻酸钠和无机盐等辅料，以添加的辅料占料水总质量的百分比计，分别为：褐藻酸钠1％，磷酸二氢钾0.5-1％，硫酸镁0.5-1％。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的液体培养基为褐藻酸钠1％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，用NaOH溶液调pH 6.0，121℃灭菌20min。
7.一种海藻液肥，其特征在于，所述的海藻液肥是使用权利要求1所述的耐盐居白蚁菌发酵海带制备的。
8.如权利要求7所述的海藻液肥，其特征在于，所述的海藻液肥是使用权利要求3-5任一项所述的方法制备的。
9.权利要求7或权利要求8所述的海藻液肥作为农作物肥料的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114958688A (zh) * 2022-06-29 2022-08-30 北京大学 一种产酶菌
US20220304333A1 (en) * 2020-08-28 2022-09-29 Hyeon Gyu NAM Method of extracting protein from sea lettuce

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102433274A (zh) * 2011-11-08 2012-05-02 江南大学 一株高产褐藻酸裂解酶的嗜盐白蚁菌及其应用方法
CN110218667A (zh) * 2019-05-16 2019-09-10 华南农业大学 一株产海藻酸裂解酶的菌株sh-1及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102433274A (zh) * 2011-11-08 2012-05-02 江南大学 一株高产褐藻酸裂解酶的嗜盐白蚁菌及其应用方法
CN110218667A (zh) * 2019-05-16 2019-09-10 华南农业大学 一株产海藻酸裂解酶的菌株sh-1及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TONG-WEI GUAN等: "Isoptericola salitolerans sp. nov., a halotolerant filamentous actinobacterium isolated from a salt lake, China", 《EXTREMOPHILES》 *
魏丹: "高效降解褐藻胶新菌种的筛选、鉴定及产酶条件优化", 《食品与发酵工业》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220304333A1 (en) * 2020-08-28 2022-09-29 Hyeon Gyu NAM Method of extracting protein from sea lettuce
CN114958688A (zh) * 2022-06-29 2022-08-30 北京大学 一种产酶菌
CN114958688B (zh) * 2022-06-29 2023-06-09 北京大学 一种产酶菌

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