CN108504595B - 一株根际促生菌水生拉恩氏菌Gro及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株根际促生菌Gro及其应用，分类命名为水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)，保藏编号CGMCC NO.15411。本发明菌株能够高产吲哚乙酸，可有效解决将难溶性的含钾硅酸盐转化为可溶性钾盐，解有机磷，同时具有固氮，产ACC脱氨酶、赤霉素、嗜铁素等促生特性，可以增加土壤养分，提高肥料利用率，促进植物对土壤养分吸收，特别能够成功定植于黄瓜和生菜根际土壤，促进黄瓜和生菜的生长和提高产量。本发明菌株Gro具有相对全面的促生功能，且产IAA能力较强，耐酸碱等极端环境，具有非常大的应用潜力。

Description

一株根际促生菌水生拉恩氏菌Gro及其应用
技术领域
本发明涉及一种微生物菌株，并涉及该菌株的应用，具体涉及水生拉恩氏菌Gro及其在根际促生中的应用。
背景技术
1904年，Lorenz Hiltner首次提出了根际(rhizosphere)的概念，对细菌与豆科植物根系的特殊关系进行了描述。1978年，植物根际促生细菌(plant growth-promotingrhizobacteria，PGPR)首次提出，主要是指自由生活在土壤或附生于植物根系的一类可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，产生代谢物质促生植物生长发育增加作物产量，并抑制有害微生物防治病害的有益菌类(Hussain S.et al.，1999；Kloepper J.W.etal.，1980；Malik K.A.et al.，1997；Schippers B.et al.，1987)。PGPR对植物的有多种促生机制，主要包括：拮抗病原菌、产生铁载体、生物固氮、溶磷解钾、产生植物生长调节物质、重寄生、竞争营养及生态位点、诱导植物系统抗性等。
中国专利CN 104560789A公开了一种花生根际促生菌HS2及其应用，菌种保藏号为CGMCC No..9888，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，该菌株分泌IAA(吲哚-3-乙酸)能力强，达16.31μg.ml-1，具有解磷解钾，固氮能力。
中国专利CN 105385634A公开了一株橡胶树根际促生菌株HBRM-86及其应用，该发明以产ACC脱氨酶为主要指标，分离筛选出一株产气肠杆菌HBRM-86产ACC脱氨酶能力最强，达为0.226U/mg，另外具有一定产IAA能力，一定的解磷能力，一定的固氮能力。
中国专利CN 104818236A公开了一种茶树根际促生细菌JW-CZ2，其分类命名为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，菌种保藏号为CCTCC M 2015095，JW-CZ2菌株能够解磷、具有一定产IAA能力、分泌ACC脱氨酶的能力，同时促进茶树苗的生长。
公开号:101012444的发明《水生拉恩氏菌HX2及其应用》公开了了一种水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)新菌株HX2(菌种保藏号：CGMCC No.1896)，分离于北京葡萄园，可以产生拮抗物质及生长素(IAA)。对部分植物病原细菌(Agrobacterrium、Xanthomonas、Clavibacter、Pseudomonas、Bacillus)、部分植物病原真菌(Fusarium、Alternaria、Botrytis)有平板抑制作用。以温室向日葵苗为指示植物检测了HX2对21株土壤杆菌引起的根癌病的防治效果，结果表明，HX2对供试的菌株引起的根癌病均有一定的防效，防效为39.8％至100％，其能够有效地降低植物根癌病的发病率，为葡萄的丰产创造了条件。
上述专利文献中公开的菌株均具有一定促生能力，但促生指标不完全，且突出的促生指标产量也不高。因此，探求一种具有相对全面促生功能，且各项促生能力较强的菌株，且耐酸碱等极端环境，是本领域技术人员的迫切需求。
发明内容
本发明的目的是提供一株能够高产吲哚乙酸，可有效解决将难溶性的含钾硅酸盐转化为可溶性钾盐，解磷，同时具有固氮，产ACC脱氨酶、赤霉素、嗜铁素等促生特性的根际促生菌及其应用方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
所述菌株Gro由黄英菊于2016年05月自河北省秦皇岛市上沟村樱桃园中分离、纯化、筛选得到。该菌株已于2018年3月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，分类命名为水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)，保藏编号CGMCCNO.15411。
菌株Gro能够解无机磷，转化量为38.24mg/L。
所述菌株Gro能够将难溶性的含钾硅酸盐转化为可溶性钾盐，转化量为3.73mg/L。
所述菌株Gro能够产IAA，产量达152.19mg/L。
所述菌株Gro能够固氮，产赤霉素、嗜铁素。
所述菌株Gro产ACC脱氨酶，酶活力为0.33U/mg。
所述菌株Gro耐受pH范围在2.5-12以上，具有较高的酸碱耐受性，生长最佳pH在8左右。
所述菌株Gro能够耐受甲霜灵及甲基立枯磷两种农药。
所述菌株Gro可应用于大棚种植，也可用于浸种；
所述菌株Gro应用于黄瓜、生菜效果尤其明显；
所述菌株Gro在大棚应用中施用方法如下：
(1)菌种活化及种子液制备
将菌株Gro进行活化并培养制得种子液；
(2)发酵培养
将培养好的Gro的种子液以8％-10％的接种量接种至10L发酵罐，发酵培养基为：酵母膏0.1％、K2HPO4 0.05％、MgSO4 0.02％、NaCl0.01％、甘露醇1％，其余为水，pH6.8-7.0。35℃，转速300rpm，通风比1:1，发酵15-18h后收集发酵液；
所述菌株Gro施用方法：将本发明菌株Gro发酵液稀释300-500倍稀释，静置30min，再搅匀，以500ml/棵用量进行灌根。
有益效果：
本发明菌株具Gro有解无机磷、解钾、产IAA、赤霉素、ACC脱氨酶等促生功能，其中产IAA能力及其高，产值达到152mg/ml。
本发明菌株Gro耐受pH范围在2.5-12以上，具有较高的酸碱耐受性，生长最佳pH在8左右。
本发明菌株Gro能够耐受甲霜灵及甲基立枯磷两种农药，其中，甲霜灵在稀释倍数为100倍时，菌株不生长，但大田应用该农药的稀释倍数一般为500-800倍稀释，因此对Gro施用无影响；甲基立枯磷大田应用一般为0.07％左右，其在5％浓度时仍然对Gro无抑制作用，因此可以判定该农药对菌株完全无抑制作用，对Gro施用无影响。
本发明菌株Gro能够成功定殖在黄瓜及生菜根部，对生菜的株高及单片面积有明显的促生效果，对茎粗及叶片数影响不大；对黄瓜的株高、茎粗、及单叶叶面积有明显的促生效果，增长分别能达到25.2％、11.9％、26.5％。
综上所述，本发明菌株Gro具有相对全面促生功能，且产IAA能力较强，耐酸碱等极端环境，具有非常大的应用潜力。
附图说明
图1为本发明水生拉恩氏菌在解无机磷定性检测培养基上培养6d解无机磷透明圈结果图；
图2为本发明水生拉恩氏菌在解有机磷定性检测培养基上培养2d解有机磷透明圈结果图；
图3为本发明水生拉恩氏菌在解钾定性检测培养基上培养6d解钾磷透明圈结果图；
图4为本发明水生拉恩氏菌产IAA定性分析图；
图5为本发明水生拉恩氏菌产赤霉素定性分析图；
图6为本发明水生拉恩氏菌产嗜铁素检测结果图；
图7为本发明水生拉恩氏菌固氮检测结果图。
具体实施方式
1.材料与方法
1.1实验材料
菌株：Gro；
NA培养基：蛋白胨：10g、牛肉粉3g，NaCl 5g，蒸馏水1L，pH 7.2左右；
根瘤菌固体培养基：酵母膏1g、K2HPO4 0.5g、MgSO4 0.2g、NaCl0.1g、甘露醇10g、蒸馏水1L、0.5％刚果红5ml、琼脂20g，pH6.8-7.0；
根瘤菌液体培养基：酵母膏1g、K2HPO4 0.5g、MgSO4 0.2g、NaCl0.1g、甘露醇10g、蒸馏水1L，pH6.8-7.0；
LB液体培养基：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂20g，pH7；
孟金娜无机磷液体培养基：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，磷酸钙5g，琼脂20g，pH7.0-7.2；
孟金娜有机磷液体培养基：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，鸡蛋卵磷脂0.2g，碳酸钙1g，酵母粉0.5g，琼脂20g，pH7.0-7.2；
解钾液体培养基：葡萄糖10g，磷酸氢二钠0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，硫酸钙0.2g，碳酸钙5g，琼脂20，钾长石粉150目2.5g，水1L，pH7.2；
血平板制备：蛋白胨18g/L，酵母粉1g/L，NaCl5g/L，琼脂15g/L，余量为蒸馏水，pH7.2-7.4。121℃灭菌30min后，待培养基冷却至50℃添加5％的羊血，混匀后倒平板；
DF培养基：KH2PO4 4.0g，Na2HPO4 6.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，葡萄糖2.0g，葡萄糖酸钠2.0g，柠檬酸2.0g，组分一、组分二溶液各0.1ml，蒸馏水1000ml，pH7.2。所述组分一组成为：MnSO4·H2O 11.19mg，CuSO4·5H2O 78.22mg，ZnSO4·7H2O 124.6mg，H3BO310.0mg，MoO310.0mg溶于100ml无菌水中；所述组分二组成为：FeSO4·7H2O 100.0mg溶于10ml无菌水中；
ADF培养基：ACC溶于纯化水(ddH2O)后抽滤灭菌，加到不含(NH4)2SO4且灭好菌的DF培养基中，ACC(1-氨基环丙烷羧酸)终浓度为3.0mM；
CAS检测培养基：
①CAS铬天青60.5mg溶于50mL水中；
②10mL 10mmol/L的FeCl3溶液(含有10mmol/L的HCl)；
③72.9mg HDTMA(十六烷基三甲基溴化铵)溶于40mL水中；
④750mL水加100mL 1×mm9盐溶液(1×mm9盐溶液：15g KH2PO4、25gNaCl、50gNH4Cl到500mL水中)，加20g琼脂、30.24gPIPES(哌嗪-1,4-二乙磺酸)，调pH到6.8；
⑤30mL 10％酸水解酪蛋白溶液；
⑥10mL 20％葡萄糖溶液。
将①和②混匀后边搅拌边加到③中，115℃灭菌20min；将④、⑤、⑥单独灭菌，115℃灭菌20min；灭菌后冷却至50℃，将⑤、⑥先加到④中，后缓缓加入③倒板。
氨苄、Salkowski比色液、L-色氨酸、磷酸二氢钾、浓H2SO4、酒石酸氧锑钾、钼酸铵、左旋抗坏血酸、、氯化钾、HCl、Tris-HCl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)、甲苯、2，4-二硝基苯肼、NaOH、α-丁酮酸、考马斯亮蓝、牛血清蛋白、赤霉素、福林试剂、乙酸乙酯等。
1.2实验方法
1.2.1菌株克隆鉴定
利用TRAN基因组DNA提取试剂盒提取所述菌株Gro的DNA。依据细菌16S rDNA中最保守的序列设计引物，引物27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTCA-3'；引物1492R：5'-GGTTAC CTT GTT ACG ACTT-3'由北京六合华大基因科技有限公司合成。PCR(聚合酶链式反应)反应条件：94℃4min，后94℃30s，60℃30s，72℃30s，进行30个循环，最后72℃终延伸10min。PCR扩增产物在25℃与质粒连接15min，后水浴热激45s转入大肠杆菌感受态，进行克隆培养，通过蓝白斑筛选获得含有目的基因的菌株，送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序。
1.2.2生理生化鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰细菌鉴定手册(第八版)》的相关内容进行生理生化鉴定。
1.2.3根际促生菌Gro安全性实验
将Gro接种到血平板上，三个重复，培养两天，观察溶血情况。
1.2.4促生功能定性检测
1.2.4.1解磷检测
1.2.4.1.1解无机磷检测
在孟金娜无机磷固体培养基上打孔接种振荡培养两天的Gro菌液60μl，对照接种根瘤菌液体培养基60μl，35℃培养6d，观察透明圈。
1.2.4.1.2解有机磷检测
在孟金娜有机磷固体培养基上打孔接种振荡培养两天的Gro菌液60μl，对照接种根瘤菌液体培养基60μl，35℃培养6d，观察透明圈。
1.2.4.2解钾检测
在解钾固体培养基上打孔接种振荡培养两天的Gro菌液60μl，对照接种根瘤菌液体培养基60μl，35℃培养6d，观察透明圈。
1.2.4.3IAA检测
加入振荡培养两天的Gro菌液50μl，阳性对照加入IAA标准液(100μg/ml)，显色剂50μl，避光放置30min，观察颜色反应。三个重复均变红色为阳性，说明能分泌IAA，颜色越深表示分泌量越多；三个重复均不变色为阴性，说明不分泌IAA。
1.2.4.4赤霉素检测
加入振荡培养两天的Gro菌液500μl，对照加入根瘤菌液体培养基500μl，福林试剂及浓盐酸各1.5ml，观察颜色反应。深绿色为阳性，颜色越深表示分泌量越多，亮黄色为阴性。
1.2.4.5产嗜铁素检测
将Gro划线接种到CAS检测培养基上，35℃培养6d，若出现黄绿色晕圈，则说明产嗜铁素。
1.2.4.6固氮检测
将Gro划线接种到固氮培养基上，35℃培养3d，菌株生长，则说明可以固氮。
1.2.5促生功能定量测定
1.2.5.1解磷定量实验
①磷标准曲线测定
磷标准贮备液：准确称取0.2195g经105℃烘干2h的磷酸二氢钾，用蒸馏水溶解后加入5ml硫酸溶液(ρ1.84)，冷却后标定至1000ml。此时磷标准贮备液磷(P)浓度为50μg/ml(500ppm)。
7.5N硫酸钼锑贮存液：A溶液：取酒石酸氧锑钾0.5g，溶解于100mL水中。B溶液：称取钼酸铵10g，溶解于450mL水中，缓慢地加入153mL浓H2SO4，边加边搅。再将上述A溶液加入到B溶液中，最后加水至1L。充分摇匀，贮于棕色瓶中。此为钼锑抗混合液。
钼锑抗混合显色剂：于100毫升硫酸钼锑贮存液中，加入1.5克左旋抗坏血酸，此试剂有效期24小时，宜用前配制。
分别吸取500ppm磷酸标准溶液0、10、20、30、40、50μl于50mL容量瓶，对应浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ppm，再加入7.5N钼锑抗混合显色剂5mL，加ddH2O定容至刻度，摇匀，静置30min，在660nm处测吸光值。绘制标准曲线。
②解无机磷定量测定
挑取Gro单菌落接种于根瘤菌液体培养基中，35℃，200rpm振荡培养2d，菌液经10000rpm离心10min，收集菌体，用生理盐水清洗菌体3次，重悬于孟金娜无机磷液体培养基，35℃、200rpm振荡培养7d。菌液经10000rpm离心10min，取上清0.1ml于100mL容量瓶，加入7.5N钼锑抗混合显色剂5mL，加ddH2O定容至刻度，摇匀，静置30min，在660nm处测吸光值。计算根际促生菌发酵液中可溶性磷的含量。
③解有机磷定量测定
挑取Gro单菌落接种于根瘤菌液体培养基中，35℃，200rpm振荡培养2d，菌液经10000rpm离心10min，收集菌体，用生理盐水清洗菌体3次，重悬于孟金娜有机磷液体培养基中，35℃、200rpm振荡培养7d。菌液经10000rpm离心10min，取上清1mL于100mL容量瓶，加入7.5N硫酸钼锑抗混合显色剂5mL，加ddH2O定容至刻度，摇匀，静置30min，在660nm处测吸光值。计算根际促生菌发酵液中可溶性磷的含量。
1.2.5.2解钾定量实验
①钾标准曲线测定
钾标准溶液：称取1.9067g经100℃烘干2h的氯化钾，用蒸馏水溶解后定容至1L。该溶液钾(K)浓度为1mg/mL。吸取10mL 1mg/mL的钾贮备溶液于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容，得钾标准溶液，此时钾(K)浓度为100μg/mL。(将氯化钾固体试剂放入称量皿置于烘箱中，在130℃-150℃下烘2h，取出后置于干燥器中冷却至室温。在分析天平上精确称取烘干的氯化钾固体477mg，置于500mL容量瓶中，以少量水洗烧杯三次，洗液倒入容量瓶中，然后用水稀释至满刻度摇匀。)
吸取钾标准溶液0、1、2.5、5、7.5、10mL分别到6个50mL容量瓶中加5mL解钾液体培养基，用蒸馏水定容，此时溶液含钾(K)浓度为0、2、5、10、15、20μg/mL的标准溶液。在火焰光度计上，以空白溶液调节仪器零点，再依次由低浓度至高浓度测量其他标准溶液，记录示值。绘制标准曲线。
②解钾定量测定
挑取Gro单菌落接种于根瘤菌液体培养基中，35℃，200rpm振荡培养2d，菌液经10000rpm离心10min，收集菌体，用生理盐水清洗菌体3次，重悬于解钾液体培养基中，32℃、180rpm培养7d，菌液经10000rpm离心10min，吸取5mL上清液于50mL容量瓶中，用蒸馏水定容。在火焰光度计上，与标准溶液条件一致，记录仪器示值。每测定5个样品后需用钾标准溶液校正仪器。
1.2.5.3产吲哚乙酸的能力测定
①IAA标准曲线的测定
配置浓度为0、10、30、40、50、60μg/mL的IAA标准溶液，并按体积比1:1与Salkowski比色液混合，室温避光放置30min，然后分别测定各浓度的OD530(以蒸馏水与Salkowski比色液的1:1混合溶液为空白对照)。最后以IAA浓度为横坐标，OD530为纵坐标作图，即得到IAA标准曲线。
②菌液中IAA浓度的测定
活化待测菌株，接种于LB液体培养基(含L-色氨酸终浓度为100mg/L)中，培养3d后取出，6000rpm离心15min，然后各取上清液4mL与等体积的Salkowski比色液混合。室温下避光放置30min，测定其OD530值(以未接菌的LB液体培养基与等体积Salkowski比色液的混合溶液为对照)。通过IAA浓度与OD530的标准关系曲线计算相应的IAA浓度。
1.2.5.4菌液中赤霉素的测定
①赤霉素标准曲线的测定
赤霉素标准液：200ppm，20mg赤霉素加入100ml量瓶，无水乙醇定容；
标准曲线：依次吸取赤霉素标准液0，0.1、0.2、0.3、0.4ml(相当于赤霉素0、20、40、60、80ug)，沸水浴加热试管5-6min，加福林试剂及浓盐酸各1.5ml，混合静置10min，加水至5ml，混匀，680nm测定。
②菌液中赤霉素浓度的测定
吸取发酵液1ml，加水9ml，塞橡皮塞震荡1min，过滤，移取2ml入分液漏斗，加4ml乙酸乙酯震荡2min萃取，静置5min分层，弃下层。吸上层乙酸乙酯萃取液0.5ml，根据标准曲线步骤测定，读数G
1.2.5.5ACC脱氨酶的测定
①α-丁酮酸标准曲线的测定
以1mL浓度为0、0.1、0.3、0.7、1和2μmol/L的α-丁酮酸标准液，加入800μl 0.56M的HCl和300μl 2，4-二硝基苯肼溶液(0.2％二硝基苯肼溶于2mol/L盐酸)，30℃保温30min，加入2mL 2M NaOH混匀，540nm处测吸光度。
②菌液中脱氨酶浓度的测定
将菌株接种到根瘤菌液体培养基32℃振荡培养1d，吸取0.5mL培养液至60mL培养基，继续培养3d，菌液经10000rpm离心10min，收集菌体。用15mL不加(NH4)2SO4的DF清洗菌体3次，重悬于24mL ADF培养基中，32℃振荡培养1d，诱导产生ACC脱氨酶。菌液经10000rpm离心10min，收集菌体，重悬于600μl 0.1M Tris-HCl(pH8.5)中，加入30μl甲苯，迅速震荡破碎细胞。取100μl粗酶液4℃储存，用于测定蛋白浓度。其余粗酶液立即测定ACC脱氨酶活性。
蛋白质测定：50μl粗酶液加入试管中，再加磷酸盐缓冲液补充至150μl，加入4mL考马斯亮蓝溶液，混合震荡，显色5min，测定595nm处吸光值。以牛血清蛋白做标曲，计算菌体蛋白含量。
计算ACC脱氢酶活力(U/mg)＝α-丁酮酸含量(μmol)/蛋白质含量(mg)/反应时间(min)。
1.2.6菌株耐酸碱检测
将Gro菌种挑取适量菌体接入100mL根瘤菌液体培养基，35℃、200r/min摇床培养24h得种子液，首先以1‰接种量接入分别调整pH值为1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5，10，10.5，11，12的根瘤菌液体培养基中，35℃、200r/min摇床培养培养3d，观察浑浊度。
1.2.7菌株耐农药检测
将Gro菌种挑取适量菌体接入100mL根瘤菌液体培养基，35℃、200r/min摇床培养24h得种子液，首先以1‰接种量接入加有农药的根瘤菌液体培养基中，三种农药分别为甲基立枯磷、精甲霜灵.恶霉灵、甲霜灵，精甲霜灵.恶霉灵和甲霜灵稀释比例为100倍、300倍、500倍、800倍、1200倍，同时设置两个不加农药的根瘤菌液体培养基，以相同接种量作为对照，35℃、200r/min摇床培养培养2d，观察浑浊度；甲基立枯磷浓度比例为5％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.09％、0.07％、0.05％、0.03％，因其为不溶成分，因此无法通过观察浑浊度来判定菌株是否生长，因此取培养好的菌悬液0.1ml涂布于根瘤菌培养基平板上，每个梯度三个重复，35℃培养1d，观察菌株是否生长。
1.2.8菌株在黄瓜及生菜根部的定殖动态
1.2.8.1菌液制备
将活化好的Gro菌种挑取适量菌体接入100mL根瘤菌液体培养基，35℃、200r/min摇床培养24h得种子液，以1‰接种量接入装有100ml根瘤菌液体培养基中，35℃、200r/min摇床培养48h后，用无菌水调节OD值(吸光度)一致后，备用。
1.2.8.2种子处理
将黄瓜、生菜种子用50℃温水浸种10min，经1％次氯酸钠消毒液消毒3min后，用无菌水冲洗3～5次，晾干。用制备好的菌悬液以1：50的比例浸种，并以根瘤菌液体培养基浸种为对照，室温风干后，将种子分为两份，一份用平板计数法测定种子初始带菌量，另一份用于播种。
1.2.8.3种子初始带菌量测定
取菌液处理过的黄瓜、生菜种子各20粒，分别放入盛有50ml无菌水的三角瓶中，置摇床上(200r/min)振荡30min，无菌水系列稀释后，取0.1ml涂布于根瘤菌培养基平板上，每处理重复3次，35℃下培养2d后，用平板计数法统计初始种子带菌量。
1.2.8.4播种及管理
将菌液处理过的种子分别种在灭菌的营养土中(成分珍珠岩、蛭石及草炭，含有机质14.85％，全氮0.4％，全钾2.62％，全磷0.16％，pH值6.24)，以培养液浸种的种子为对照。每处理6盆，每盆20粒种子。置于室温(20～25℃)中培养，定期定量浇水。出苗后观察植株生长状况，在出苗后第6天开始取样。
1.2.8.5检测方法
抖去根上大块土，保留附着土，称重后放入盛有50ml无菌生理盐水的三角瓶中，置摇床上(200r/min)振荡30min，用无菌水系列稀释后，取0.1ml不同浓度的稀释液涂布于根瘤菌培养基平板上，每处理重复3次，35℃下培养2d后，对照植株按上述方法分离，用平板计数法检测标记菌株在黄瓜、生菜根际的定殖量。
1.2.9菌株对大棚种植黄瓜、生菜的促生作用
1.2.9.1菌株对黄瓜生长的促生作用
大棚种植每个小区长4.5m，宽3.5m，面积15.75m2，随机排列。每小区设6行，每行种10棵(相当于38000株/hm2)，定植15天后灌根接种：对照组为30ml/棵的液体培养基；试验组分别灌根等体积的菌悬液(活菌数为108cfu/ml)，每10d浇灌1次，共3次，以强化细菌在根际的定殖，其他管理措施同当地冷棚。
选择除边行外的中间4行为试验样品，种植60d测定株高、茎粗、单叶叶面积。
1.2.9.2菌株对生菜生长的促生作用
大棚种植每个小区长4.5m，宽3.5m，面积15.75m2，随机排列。每小区设10行，每行进行撒种播种，后期按照每棵间距15cm进行间苗。种植20天后灌根接种：对照组为30ml/棵的液体培养基；试验组分别灌根等体积的菌悬液(活菌数为108cfu/ml)，每10d浇灌1次，共3次，以强化细菌在根际的定殖，其他管理措施同当地冷棚。
选择除边行外的中间8行为试验样品，种植60d测定株高、茎粗、单叶叶面积、叶片数。
2结果与讨论
2.1菌株鉴定结果
Gro测序结果进行双向拼接后，将得到的16S rDNA序列在EzBioCloud网站上比对，结果为水生拉恩氏菌Rahnella aquatilis，同源性为99.45％。
GCTCTCCCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTGGGATCGCCCTTGGTTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCATGAATCACAAAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATTCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACATACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGTTTGCTTCTCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCACCATTACGTGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCACGGTTCCCGAAGGCACTAAGCCATCTCTGGCGAATTCCGTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAGTCGACATCGTTTACAGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAGCTTGCCAGTTTCAAATGCAGTTCCCACGTTAAGCGCGGGGATTTCACATCTGACTTAACAAACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGAGTAACGTCAATCACCACACGTATTAAGTATGGTGCCTTCCTCCTCGCTGAAAGTGCTTTACAACCCTAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCAGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTAGGTGAGCCATTACCTCACCTACTAGCTAATCCCATCTGGGCACATCCGATGGCGTGAGGTCCGAAGATCCCCCACTTTGCTCTTTCGAGGTCATGCGGTATTAGCTACCGTTTCCAGTAGTTATCCCCCTCCATCAGGCAGTTTCCCAGACATTACTCACCCGTCCGCCGCTCGCCGGCAAAGTAGCAAGCTACTTTCCGCTGCCGCTCGACTTGCATGTGTTAGGCCTGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCCAGGATCAAACTCTAAGGGCGATCCAATCGAAT
2.2生理生化鉴定
该菌株为革兰氏阴性菌，小的杆状细胞，周生多鞭毛，0.5～0.7μm×2～3μm。
菌株生理生化特性：
Figure BDA0001613454820000111
Figure BDA0001613454820000121
菌株Gro对BIOLOG板上95种碳源底物的利用能力如下表所示，利用糊精、吐温80、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、1-磷酸葡萄糖、L-丙氨酸、D-阿拉伯糖、L-果糖、龙胆二糖、乳果糖、D-甘露醇、D-蜜二糖、阿洛酮糖、L-棉子糖、蔗糖、松二糖、甲基丙酮酸、柠檬酸、D-乳糖酸内酯、D-葡萄糖酸、吐温80、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-纤维二糖、D-果糖、D-半乳糖、α-D-葡萄糖、D-乳糖、麦芽糖、D-甘露醇、L-阿拉伯糖、D-棉子糖、D-山梨醇、D-海藻糖、D-半乳糖醛酸、L-谷氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-脯氨酸肌苷、胰嘧啶核苷、D，L-α-磷酸甘油、6-磷酸葡萄糖、D-葡糖二酸、琥珀酸、溴丁二酸、L-丝氨酸、尿苷、丙三醇、奎尼酸、D，L-乳酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天门冬氨酸、L-天冬酰胺酸为阳性。
Figure BDA0001613454820000122
Figure BDA0001613454820000131
注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应，“/”表示临界状态。
2.4根际促生菌安全性实验
Gro在血平板上培养2d，不出现溶血圈。
菌株 Gro
1d -
2d -
2.4促生功能定性测定结果
2.4.1解磷定性测定
2.4.1.1解无机磷测定
35℃培养6d，出现透明圈，如图1所示，透明圈直径为1.6cm，UP值为7.13。
2.4.1.2解有机磷测定
35℃培养2d，出现透明圈，如图2所示，透明圈直径为2.6cm，UP值为18.75。
2.4.2解钾定性测定
35℃培养6d，出现透明圈，如图3所示，透明圈直径为2.2cm，UP值为13.47。
2.4.3 IAA检测
如图4所示，红色较深，说明该菌株具有分泌IAA的能力；
2.4.4赤霉素检测
如图5所示，溶液变为深绿色，说明该菌株产赤霉素能力较强。
2.4.5产嗜铁素检测
Gro在CAS检测培养基上35℃培养6d，出现明显黄绿色晕圈，如图6所示，说明可以产嗜铁素。
2.4.6固氮检测
Gro在固氮培养基上，35℃培养3d，菌株生长明显，如图7所示，说明可以固氮。
2.5促生功能定量测定
由以下结果可知，根际促生菌具有较强的产IAA的能力，并且具有一定的解无机磷、解钾、产赤霉素、ACC脱氨酶的能力，但不能分解有机磷。
促生指标 Gro
无机磷(mg/L) 38.24
钾(mg/L) 3.73
IAA(mg/L) 152.19
赤霉素(mg/L) 28.66
ACC脱氨酶(U/mg) 0.33
2.6菌株耐酸碱检测
如下表所示，Gro耐受pH范围在2.5-12以上，具有较高的酸碱耐受性，生长最佳pH在8左右。
pH 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6
OD600 - - - - - 0.771 0.688 0.669 0.758 0.647 0.698
浑浊度 - - - 弱 + - + + + + +
pH 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 12
OD600 0.751 0.661 0.681 0.935 0.698 0.543 0.647 0.633 - - -
浑浊度 + + + + + + + - + 弱 弱
注：+号表示菌株生长；-号表示菌株未生长。
2.7菌株耐农药检测
Gro在三种农药存在下生长情况如下表所示，对精甲霜灵、恶霉灵无耐受性；对甲霜灵的耐受浓度极限为100倍稀释；对甲基立枯磷有很好的耐受性，此农药对Gro无抑制作用。
Figure BDA0001613454820000151
Figure BDA0001613454820000161
注：+号表示菌株生长；-号表示菌株未生长。
2.8菌株在黄瓜及生菜根部的定殖动态
2.8.1菌株在黄瓜根部的定殖动态
Gro在黄瓜根部的定殖量如下表所示，在第6d定殖数量达到最高峰，在第24d，定殖量呈现下降趋势，到第36d减少1个数量级。
时间(d) 根际菌活(cfu/g)
0 3.02×10<sup>8</sup>
6 1.70×10<sup>9</sup>
12 4.32×10<sup>8</sup>
18 3.73×10<sup>8</sup>
24 7.14×10<sup>7</sup>
30 5.19×10<sup>7</sup>
36 3.14×10<sup>7</sup>
2.8.2菌株在生菜根部的定殖动态
Gro在生菜根部的定殖量如下表所示，总体呈现下降趋势，36d下降了两个数量级。
时间(d) 根际菌活(cfu/g)
0 7.63×10<sup>8</sup>
6 4.88×10<sup>8</sup>
12 1.81×10<sup>8</sup>
18 2.23×107
24 8.02×10<sup>6</sup>
30 4.48×106
36 2.50×10<sup>6</sup>
2.9菌株对大棚种植黄瓜、生菜的促生作用
2.9.1菌株对黄瓜的促生作用
如下表所示，Gro对黄瓜的株高、茎粗、及单叶叶面积有明显的促生效果，增长分别能达到25.2％、11.9％、26.5％。
处理 株高 茎粗 单叶叶面积
对照组 172.4±29.17b 8.68±0.74b 260.39±35.54b
菌液 215.8±19.47a 9.71±0.91a 329.36±42.91a
注：P<0.05，同列小写字母不相同代表差异显著。
2.9.2菌株对生菜的促生作用
如下表所示，Gro对生菜的株高及单片面积有明显的促生效果，对茎粗及叶片数影响不大。
处理 株高 茎粗 单叶叶面积 叶片数
对照组 21.56±1.74b 15.91±0.655a 309.40±41.01b 14.38±0.470a
菌液 23.94±1.49a 15.54±1.282a 357.85±32.43a 14.88±0.899a
注：P<0.05，同列小写字母不相同代表差异显著。
3讨论
植物根际促生菌可促进植物生长及对矿质营养吸收和利用，产生促进植物生长代谢物，抑制有害微生物繁殖。在农业生产中引入植物根际促生菌，对创造良好的根际生态环境、降低化肥与农药的使用、抑制病虫害的发生有重要的作用，在保证现代农业可持续发展的同时又达到增产的目的。本发明菌株具有解无机磷、解钾、产IAA、赤霉素、ACC脱氨酶等促生功能，其中产IAA能力及其高，产值达到152mg/ml。
本发明菌株Gro能够耐受甲霜灵及甲基立枯磷两种农药，其中，甲霜灵在稀释倍数为100倍时，菌株不生长，但大田应用该农药的稀释倍数一般为500-800倍稀释，因此对Gro施用无影响；甲基立枯磷大田应用一般为0.07％左右，其在5％浓度时仍然对Gro无抑制作用，因此可以判定该农药对菌株完全无抑制作用，对Gro施用无影响。
近年来，包括根际促生菌在内的各种微生物肥料在国内外的商品化进程中受到很大程度的限制，主要在于其应用效果的不稳定(Cook，1993)。而造成不稳定的主要因素与不同环境条件下菌株在植物根圈的定殖能力有关，因为微生物肥料中的菌株首先要在植物根部成功定殖才能稳定发挥作用(Klopper，1992)。本发明菌株能够成功定殖在黄瓜及生菜根部，对生菜的株高及单片面积有明显的促生效果，对茎粗及叶片数影响不大；对黄瓜的株高、茎粗、及单叶叶面积有明显的促生效果，增长分别能达到25.2％、11.9％、26.5％。
综上所述，本发明菌株Gro具有相对全面促生功能，且产IAA能力较强，耐酸碱等极端环境，具有非常大的应用潜力。
序列表
<110> 陕西枫丹百丽生物科技有限公司
<120> 一株根际促生菌水生拉恩氏菌Gro及其应用
<130> 2018
<141> 2018-03-30
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1584
<212> DNA
<213> 水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilisCGMCC No.15411)
<400> 1
gctctcccat atggtcgacc tgcaggcggc cgcgaattca ctagtgattg ggatcgccct 60
tggttacctt gttacgactt caccccagtc atgaatcaca aagtggtaag cgccctcccg 120
aaggttaagc tacctacttc ttttgcaacc cactcccatg gtgtgacggg cggtgtgtac 180
aaggcccggg aacgtattca ccgtagcatt ctgatctacg attactagcg attccgactt 240
catggagtcg agttgcagac tccaatccgg actacgacat actttatgag gtccgcttgc 300
tctcgcgagt ttgcttctct ttgtatatgc cattgtagca cgtgtgtagc cctactcgta 360
agggccatga tgacttgacg tcatccccac cttcctccgg tttatcaccg gcagtctcct 420
ttgagttccc accattacgt gctggcaaca aaggataagg gttgcgctcg ttgcgggact 480
taacccaaca tttcacaaca cgagctgacg acagccatgc agcacctgtc tcacggttcc 540
cgaaggcact aagccatctc tggcgaattc cgtggatgtc aagagtaggt aaggttcttc 600
gcgttgcatc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt caattcattt 660
gagttttaac cttgcggccg tactccccag gcggtcgact taacgcgtta gctccggaag 720
ccacgcctca agggcacaac ctccaagtcg acatcgttta cagcgtggac taccagggta 780
tctaatcctg tttgctcccc acgctttcgc acctgagcgt cagtctttgt ccagggggcc 840
gccttcgcca ccggtattcc tccagatctc tacgcatttc accgctacac ctggaattct 900
acccccctct acaagactct agcttgccag tttcaaatgc agttcccacg ttaagcgcgg 960
ggatttcaca tctgacttaa caaaccgcct gcgtgcgctt tacgcccagt aattccgatt 1020
aacgcttgca ccctccgtat taccgcggct gctggcacgg agttagccgg tgcttcttct 1080
gcgagtaacg tcaatcacca cacgtattaa gtatggtgcc ttcctcctcg ctgaaagtgc 1140
tttacaaccc taaggccttc ttcacacacg cggcatggct gcatcaggct tgcgcccatt 1200
gtgcaatatt ccccactgct gcctcccgta ggagtctgga ccgtgtctca gttccagtgt 1260
ggctggtcat cctctcagac cagctaggga tcgtcgccta ggtgagccat tacctcacct 1320
actagctaat cccatctggg cacatccgat ggcgtgaggt ccgaagatcc cccactttgc 1380
tctttcgagg tcatgcggta ttagctaccg tttccagtag ttatccccct ccatcaggca 1440
gtttcccaga cattactcac ccgtccgccg ctcgccggca aagtagcaag ctactttccg 1500
ctgccgctcg acttgcatgt gttaggcctg ccgccagcgt tcaatctgag ccaggatcaa 1560
actctaaggg cgatccaatc gaat 1584

Claims (10)

1.一株根际促生菌，其特征在于，所述根际促生菌为水生拉恩氏菌Gro(Rahnella aquatilis)，保藏编号CGMCC NO.15411。
2.权利要求1所述根际促生菌的发酵方法，包括如下步骤：
菌种活化及种子液制备
将菌株Gro进行活化并培养制得种子液；
发酵培养
将培养好的Gro的种子液以8％-10％的接种量接种至10L发酵罐，发酵培养基为：酵母膏0.1％、K2HPO4 0.05％、MgSO4 0.02％、NaCl 0.01％、甘露醇1％，其余为水，pH6.8-7.0，35℃，转速300rpm，通风比1：1，发酵15-18h后收集发酵液。
3.权利要求2所述发酵方法制得的Gro发酵液。
4.权利要求1所述的根际促生菌或权利要求3所述的发酵液在大棚种植中的应用。
5.根据权利要求4所述根际促生菌的应用，其特征在于，将权利要求3所述的Gro发酵液稀释300-500倍，静置30min，再搅匀，以500ml/棵用量进行作物灌根。
6.根据权利要求5所述根际促生菌的应用，其特征在于，所述作物包括黄瓜、生菜。
7.根据权利要求6所述根际促生菌的应用，其特征在于，所述Gro发酵液稀释后活菌数为108cfu/ml，灌根用量为：每次30ml/棵；黄瓜定植15天后灌根接种，之后每10d浇灌1次，共浇灌3次；生菜种植20天后灌根接种，之后每10d浇灌1次，共浇灌3次。
8.权利要求1所述的根际促生菌在浸种中的应用。
9.权利要求8所述的应用，包括如下步骤：
菌液制备
挑取活化好的根际促生菌Gro菌种菌体接入100mL根瘤菌液体培养基，35℃、200r/min摇床培养24h得种子液，以1‰接种量接入装有100ml根瘤菌液体培养基中，35℃、200r/min摇床培养48h后，用无菌水调节OD值一致后，备用；
种子处理
将种子用50℃温水浸种10min，经1％次氯酸钠消毒液消毒3min后，用无菌水冲洗3～5次，晾干；用制备好的菌液以1：50的比例浸种；
所述根瘤菌液体培养基：酵母膏1g、K2HPO4 0.5g、MgSO4 0.2g、NaCl0.1g、甘露醇10g、蒸馏水1L，pH6.8-7.0。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述浸种包括黄瓜、生菜种子。
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