CN102876624B

CN102876624B - 一株基因改性的高效解磷工程菌及其应用

Info

Publication number: CN102876624B
Application number: CN201210382821.7A
Authority: CN
Inventors: 孙立文; 许仁杰; 李庆财; 赵学民
Original assignee: Beijing Zhongnong Ruiliyuan High-Tech Development Co Ltd; Yucheng Ruiliyuan Sci & Tech Co Ltd Shandong
Current assignee: Beijing Zhongnong Ruiliyuan High-Tech Development Co Ltd; Yucheng Ruiliyuan Sci & Tech Co Ltd Shandong
Priority date: 2012-10-10
Filing date: 2012-10-10
Publication date: 2014-02-12
Anticipated expiration: 2032-10-10
Also published as: CN102876624A

Abstract

本发明公开了一株基因改性的高效解磷工程菌及其应用。该菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1 CGMCC No.6089，从植物根围土壤中筛选获得解磷菌PS57，构建含有葡萄糖脱氢酶基因（gdh)的完整表达元件，再将该基因表达元件电转入宿主菌PS57中得到。实验证明，该菌株在无机磷培养基（主要磷元素来源为难溶性磷酸钙，含磷量为5g/L）中培养72h，可使培养基中的可溶性磷含量高达58.8mg/L，说明该菌株具有很强的解磷作用，可作为解磷细菌应用于微生物肥料生产。

Description

一株基因改性的高效解磷工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物和基因工程技术领域中的一株经基因工程技术改性（本文中改性含义与改造相同）的高效解磷细菌及其在制备生物肥料中的微生物肥料中的应用。

背景技术

磷是限制植物生长的主要营养元素之一，其在土壤中主要以难溶的矿物态存在。溶磷微生物在土壤磷循环相关的生物学系统中担任着重要的角色，它们可以将难溶性无机磷转化为可溶性磷（如磷酸一氢钙等），提高作物对磷的利用率。但植物根围的解磷微生物通常数量不足，难以发挥其效用。因此，有必要从自然环境中筛选出高效解磷菌株，制成菌剂后再施入土壤中以促进植物对磷的吸收利用。

由于芽孢杆菌具有抗逆性强，在土壤中容易定殖，适宜工业化生产等优点，目前通过注册的商品化微生物菌肥中有很多都是芽孢杆菌（Bacillus）。

微生物溶解无机磷的机理较为复杂，许多微生物的解磷过程与细胞内有机酸的合成密切相关，弱酸性环境可促进难溶磷酸钙溶解。

基因工程技术是把外源基因导入到宿主菌细胞，有目的的改造宿主菌的遗传形状的一种方法，通过此方法构建的工程菌株，可以在分子的水平上定向的改变菌株的遗传特性。目前，国内外对解磷细菌的研究大量集中在解磷细菌的菌株筛选、对比、诱变、以及机理初探方面，对基因解磷机理的研究很少，解磷细菌的基因工程育种仅限于一些零星的、基础性的研究报道。尽管分子育种是新型解磷菌选育的发展方向，但目前尚未见到利用基因工程技术对解磷微生物进行改造的报道。

与本发明相关的现有技术如下：

现有技术一：“一种解磷真菌及其在制备生物菌肥中的应用”（中国专利文献，申请号：201010590115.2）。该发明采用常规方法从云南省晋宁县磷矿厂矿土中利用解磷微生物筛选培养基，筛选获得解磷真菌Penicillium oxalicum Mo-Po菌株。其利用Mo-Po菌株堆肥发酵烟草废弃物制备的生物菌肥能作为各种蔬菜种植中的基肥，在土壤含磷量较高的农田里能够作为化学磷肥的替代品。其缺点是筛选解磷真菌时采集的样品来源范围小，使得筛选的解磷真菌的种类较少，且在传代的过程中容易蜕化，在进一步的纯化过程中容易失去解磷能力。此外，该发明所用的筛选方法为常规方法，未涉及利用基因工程技术对解磷菌进行遗传改造。

现有技术二：“一株具有解磷作用的枯草芽孢杆菌及其应用”（中国专利文献，申请号：201010532768.5）。该发明从山东省济宁市田间土壤中分离到一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis XF-8)，该菌株能产生中性植酸酶，对有机磷具有解磷作用。其缺点为所使用的枯草芽孢杆菌只对土壤有机磷具有解磷作用，对难溶性无机磷无效。此外，该发明未涉及利用基因工程技术对解磷菌株进行遗传改造。

现有技术方案三：“芽孢杆菌解磷工程菌株的构建”（中国专利文献，申请号：02145369.1）。该发明应用诱变效率高、突变幅度大的新型诱变技术—离子束注入方法构建工程菌，使芽孢杆菌分解有机磷和无机磷的能力增强。其缺点为得到的工程菌利用的是物理诱变技术，此技术一方面产生的有益突变频率低，另一方面难以有效的控制变异的方向和性质。此外，该发明也未涉及利用基因工程技术对解磷菌进行遗传改造。

发明内容

本发明的目的是提供一株对土壤中的无机磷具有较好的溶解效果的高效解磷工程菌。

本发明所提供的高效解磷芽孢杆菌，为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）PS57H1 CGMCC No.6089。

所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1 CGMCC No.6089是革兰氏阳性杆菌，顶端生芽孢；在YPD培养基上生长良好，48h形成直径2-3mm大小的圆形菌落，有运动性，好氧，菌落呈白色有光泽，表面湿润、平坦，边缘整齐；生长温度范围：25℃-37℃，最适生长温度：30℃-37℃；生长酸碱度范围：pH 2-9，最适pH值为7.0。

本发明进一步提供一种高效解磷微生物菌剂，其活性成分为前述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1CGMCC No.6089的发酵液或发酵液干燥得到的固体菌剂。

该高效解磷微生物菌剂，为所述发酵液与草炭、轻质碳酸钙经混合、粉碎得到的，三者混合比例为1:3-5:0.03-0.05，优选1:4:0.04（重量比）。

本发明还提供一种构建解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1CGMCC No.6089的方法，包括以下步骤：

1）选定一株能解磷的芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57，其16S rDNA序列如序列表中序列1所示；

2）在序列表中序列2所示的葡萄糖脱氢酶基因(gdh)的5’端添加枯草杆菌蛋白酶E基因启动子（PsubE），在3’端添加枯草杆菌蛋白酶E基因转录终止子（TsubE），得到序列表中序列3所示的葡萄糖脱氢酶基因的完整表达元件，然后将其克隆到芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pHY300PLK的BamH I和Sal I酶切位点之间，得到携带葡萄糖脱氢酶基因完整表达元件的芽孢杆菌表达载体pHYH；

3）将携带葡萄糖脱氢酶基因完整表达元件的芽孢杆菌表达载体pHYH通过电击转化方法导入芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57中，得到基因改造的高效解磷工程菌即解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1 CGMCC No.6089。

本发明进一步提供一种得到解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57CGMCC No.6089的发酵液的方法，包括以下步骤：

1）配制无机磷细菌液体培养基，配方为：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，酵母粉0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，磷酸钙5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5，将培养基在使用前用常规方法115℃灭菌30min；

2）将解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1 CGMCC No.6089按5％的比例接种于步骤1）的无机磷细菌液体培养基中，在摇瓶转速180-200r/min下培养20-24h，得到PS57H1发酵液。

本发明还提供一种制备所述高效解磷微生物菌剂的方法，将前PS57H1发酵液与高温灭菌后的草炭、轻质碳酸钙按照重量比1:4:0.04的比例在搅拌机内搅拌均匀，粉碎后得到。

本发明进一步提供一种活化磷肥，包括磷肥和按磷肥质量的1-50％添加的所述高效解磷微生物菌剂。

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1 CGMCC No.6089在溶解土壤难溶磷中的应用也属于本发明内容；所述土壤难溶磷为包括磷酸钙、磷灰石和磷铁矿中的磷酸三钙等的无机磷。

综上，本发明技术方案围绕该高效解磷工程菌解淀粉孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）PS57H1CGMCC No.6089展开。该菌株是先从植物根围土壤中筛选获得解磷菌PS57，然后构建葡萄糖脱氢酶基因（gdh)的完整表达元件，再将该基因表达元件电转入宿主菌—解磷菌PS57中得到的高效解磷菌株。实验证明，该菌株在无机磷培养基（磷元素来源为难溶性磷酸钙Ca₃（PO₄）₂，原始含量为5g/L，）中培养72h，可使培养基中的可溶性磷（磷以可溶性磷的形式存在）含量高达58.8mg/L，说明该菌株具有很强的解磷作用，可作为解磷细菌应用于微生物肥料生产。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为磷标准曲线

图2为携带葡萄糖脱氢酶基因完整表达元件的芽孢杆菌表达载体pHYH的物理图谱

具体实施方式

本发明提供的基因改性（或称改造）的高效解磷工程菌为一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），名称为PS57H1，该菌株已于2012年05月11日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6089。

该解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1 CGMCC No.6089是革兰氏阳性杆菌，顶端生芽孢；在YPD培养基上生长良好，48h形成直径2-3mm大小的圆形菌落，有运动性，好氧，菌落呈白色有光泽，表面湿润、平坦，边缘整齐；生长温度范围：25℃-37℃，最适生长温度：30℃-37℃；生长酸碱度范围：pH 2-9，最适pH值为7.0；部分生化特性如表1所示：

表1解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1

CGMCC No.6089的部分生化特性

注：“＋”表示反应阳性；“－”表示反应阴性。

本发明还提供了一种构建上述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1 CGMCC No.6089的方法。

本发明所提供的构建方法，可包括以下步骤：

2）将解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1CGMCC No.6089按5％的比例接种于步骤1）的无机磷细菌液体培养基中，在摇瓶转速180-200r/min下培养20-24h，得到PS57H1发酵液。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、构建高效解磷工程菌PS57H1

构建高效解磷工程菌即解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1CGMCC No.6089，具体方法包括以下步骤：

一、解磷细菌PS57的筛选及16S rDNA鉴定

1、初筛

筛选物品为来自北京小汤山、安徽合肥、河北廊坊、湖北宜昌、山东烟台、新疆贾登岭、河南南阳等地的农作物或园艺植物根围土壤。具体筛选方法为：每份土样称取5g，分别放入盛有100mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，在摇床上剧烈振荡30min后于80℃的水浴中保持15-20min。然后用无菌水进行梯度稀释成10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7后涂布筛选平板（无机磷细菌筛选培养基的配方为：葡萄糖10g，磷酸三钙5g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.1g，氯化钾0.2g，酵母粉0.5g，硫酸锰0.002g，0.4％溴酚蓝（pH6.7）6mL，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH自然；使用前用常规方法115℃灭菌30min），每梯度涂2-3皿，于30℃培养箱内培养72h，挑取菌落形态差异明显的单菌落，选择溶磷圈直径大（溶磷圈直径大于3）及HD/CD（溶磷圈/菌落直径，解磷指数）数值大（HD/CD数值大于2）的菌落，转接于LB斜面培养基（LB培养基配方：10g胰蛋白胨，5g/酵母粉，10g NaCl，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2，固体培养基加入2％琼脂；使用前用常规方法115℃灭菌30min）中备用。

2、细菌解磷能力的测定

2.1检测细菌对无机磷的解磷能力

用无机磷细菌液体培养基（配方为：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，酵母粉0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，磷酸钙（Ca₃（PO₄）₂）5g（水不溶物），蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5，使用常规方法115℃灭菌30min）测定菌株的解磷能力，测定方法为：先预培养：将细菌接种到盛有LB液体培养基的三角瓶中，置30℃、200rpm摇床振荡培养24h得到预培养菌液；然后进行二次培养：将细菌转接到装有无机磷细菌液体培养基的三角瓶中，每10mL培养基中加入预培养菌液100ul，置30℃、200rpm摇床振荡培养72h；培养结束后加入无磷活性碳脱色，然后12000rpm高速离心10min，将上清液倾出待测。用钼锑抗比色法测定上清液中磷含量，得到培养菌液中可溶磷的量，菌液中可溶磷量越高表明对应菌株解磷能力越强。磷含量具体测定方法如下：

2.1.1)吸取上清液0.5mL置于50mL容量瓶中，用水稀释至20mL，用1M NaOH或稀硫酸溶液调节pH至3.0，然后到预先置有5mL钼锑抗显色剂【钼锑抗显色剂：称1.5g抗坏血酸（C₆H₈O₆,左旋比旋光度+21-22度），溶于100mL钼锑抗贮存液中，此液随配随用，可溶期1天；钼锑抗储存液：浓硫酸（H₂SO₄）(分析纯)153mL缓缓地倾入约400mL蒸馏水）中，搅拌、冷却，10.0g钼酸铵（分析纯溶于约60℃的300mL水中，冷却，然后将硫酸溶液缓缓滴入钼酸铵溶液中，再加入100mL 0.5％酒石酸锑钾溶液[K(SbO)C₄H₄O₆·1/2H₂O，分析纯]，最后用水稀释至1L，盛于棕色瓶中】的50mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。在室温（20℃-25℃）下放置30min后用分光光度计在波长700nm比色。读取数值，利用磷标准曲线计算出显色液中磷的读数。颜色在8h内可保持稳定。

2.1.2）磷标准曲线的绘制：分别吸取5mg/L磷标准溶液（5mg/L磷标准液：称取在105℃烘箱中烘2h后冷却的磷酸二氢钾0.439g溶于200mL水中，加入5mL浓硫酸，转入1L容量瓶中，用蒸馏水定溶至刻度即为100mg/L磷标准液，可长期保存备用。取此溶液准确稀释20倍即为5mg/L磷标准液，此溶液不宜久放）0、1、2、3、4、5、6mL于50mL容量瓶中，加水稀释至约20mL，加入钼锑抗显色剂5mL，摇匀定容，即得0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/L磷标准系列溶液，用分光光度计上在波长700nm比色分析，得到各溶液的吸光值数值。以吸光值为纵坐标，磷浓度为横坐标，绘制成磷标准工作曲线，如图1所示。

2.2检测细菌对无机磷的解磷指数

利用平板检测：（1）分别将PS16、PS21、PS57、PS69、PS81、PS87、PS94、PS123、PS158、PS202、PS214共11株细菌转接至已灭菌的LB液体培养基，置于30℃培养箱培养24小时。（2）用移液器吸取10ul菌液滴到无机磷细菌固体培养基平板上（无机磷细菌固体培养基的配方为：葡萄糖10g，磷酸三钙5g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.1g，氯化钾0.2g，酵母粉0.5g，硫酸锰0.002g，0.4％溴酚蓝（pH6.7）6mL，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH自然；使用常规方法115℃灭菌30min）置于30℃恒温箱中培养72h，观察菌落生长情况及透明圈产生情况、测量菌落直径和透明圈直径，计算解磷指数HD/CD（溶磷圈/菌落直径）。

2.3测定结果：

不同菌株在无机磷细菌筛选平板上的解磷指数和在无机磷细菌液体培养基中的解磷能力测定结果如表1所示。不同标号的解磷菌解磷能力的测量，是将该号菌液与其经高温高压灭活的死菌液同时进行比色分析（以灭活菌液为参照）得出的。

结果确定PS57为一株高效解磷细菌，该解磷菌株发酵液中的可溶无机磷含量为55.8mg/L，较空白对照样品（可溶无机磷含量28.6mg/L，是将培养基在121℃灭菌20min，作为空白对照）提高95.1％。

表1解磷菌PS57和其他解磷菌株的解磷指数和解磷能力测定结果

*解磷指数：HD/CD=溶磷圈直径/菌落直径

*解磷能力：发酵液中磷含量以磷酸根计

3、解磷细菌PS57的16S rDNA鉴定

提取步骤2）筛选得到的高效解磷菌株PS57的总DNA，提取方法包括以下步骤：

1)将过夜培养的菌液按5％接种于50mL LB培养基中，37℃、200rpm培养5h；

2)4℃、8000rpm离心30秒收集菌体；

3)用10mL TE(pH8.0)洗涤菌体两次；

4)加入0.5mL TE悬浮菌体，再加入0.5mL 4.0mg/mL的溶菌酶（蛋白酶K）溶液[溶于10mM Tris·HCl(pH8.0)]，混匀，37℃水浴保温30min；

5)加入10mL 65℃预热的CTAB提取液（CTAB提取液：0.1M Tris·HCl(pH8.0)，2％（w/v）CTAB，0.02M EDTA，1.4M NaCl），65℃水浴保温45min，中间小心混匀几次；

6)加入等体积的Tris饱和酚抽提一次；

7)再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次；

8)加入两倍体积冰预冷的乙醇沉淀DNA，-70℃放置30min，或-20℃放置2h；

9)12,000rpm离心10min，弃上清；

10)70％乙醇洗涤两次，每次10mL；

11)12,000rpm离心5min，小心吸去上清液，将附于管壁的液滴出尽。37℃放置15min，干燥后溶于300μL TE。

以提取的总DNA为模板，在原核生物16S rRNA基因的通用引物F27:5′AGA GTTTGA TCA TGG CTC AG-3′和F27:5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′的引导下进行16S rDNA基因的PCR扩增，扩增条件为：95℃5min；再（95℃1min，56.7℃50s，72℃2min30sec）32个循环；72℃10min。扩增结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA片段快速胶回收试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）回收1431bp的目的片段，然后以该回收片段为模板进行DNA测序。测序结果表明，该细菌的16S rDNA序列如序列表中序列1所示，将测得的序列提交到GENBANK数据库中进行BLAST比对分析，根据结果大体确定解磷细菌的种类。结果序列最为一致的是源自安徽合肥土壤的菌株PS57，与Bacillus amyloliquefaciens的序列(Genbank号：JF899255.1）相应，序列一致性为100％，确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens），命名为PS57。

二、构建携带葡萄糖脱氢酶基因完整表达元件的芽孢杆菌表达载体pHYH

1、葡萄糖脱氢酶基因的PCR扩增

以提取的芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57的总DNA为模板，在引物GDH5:5′-ATGTATCCGGATTTAAAAGG-3′和GDH3:5′-ACCGCGGCCTGCCTGGAATG-3′的引导下PCR扩增葡萄糖脱氢酶基因（gdh)，200μL PCR扩增体系为：总DNA 200ng，dNTP(2.5mM each)16μL，GDH5(5μM)10μL，GDH3(5μM)10μL，10×PCR buffer(with Mg²⁺)20μL，Ex Taq polymerase 16U，用d₂H₂O补充至200μL；PCR扩增条件为：95℃预变性10min，30个循环（95℃变性1min，56℃退火45s,72℃延伸1min），72℃延伸10min，反应结束后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA片段快速胶回收试剂盒回收783bp的目的片段，然后用PCR产物克隆试剂盒（大连宝生物公司）将其克隆到pMD-T载体上，挑选重组克隆送测序公司进行测序，测序结果扩增的葡萄糖脱氢酶基因（gdh)的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

2、构建携带葡萄糖脱氢酶基因完整表达元件的芽孢杆菌表达载体pHYH

在葡萄糖脱氢酶基因的5’端添加枯草杆菌蛋白酶E基因启动子（PsubE，GenBank号为143665，总基因序列），添加方法为：根据基因序列，PCR扩增PsubE启动子片段添加到葡萄糖脱氢酶基因的5’端（根据基因序列设计含有酶切位点的引物，进行PCR扩增，反应体系（25ul）：Taq PCR MasterMIx 12.5ul，引物（PEY5’：ACGCGTCGACGTATGAAAATAGTTATTTCG）0.5ul，引物（PEY3’：GCTGCAGTCGGTCGCCATTCTTTACCCTCTCC）0.5ul，模板（为枯草芽孢杆菌基因组DNA）1ul，Taq酶0.5ul，d₂H₂O 10.5ul；PCR扩增程序：95℃预变性5min，32个循环（95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min），最后72℃延伸10min；扩增PsubE启动子基因后，与葡萄糖脱氢酶基因用SalⅠ酶和Pst Ⅰ酶进行双酶切（双酶切反应体系为PsubE 8ul，Sal Ⅰ1ul，Pst Ⅰ1ul，10×H 2ul，d₂H₂O 8ul），再进行连接（连接体系为PsubE 3ul，gdh 1ul，T4 ligase 1ul，T4 ligase buffer 2.5ul，d₂H₂O 12.5ul）。然后，在葡萄糖脱氢酶基因的3’端添加枯草杆菌蛋白酶E基因转录终止子（TsubE，GenBank号为143665，总基因序列），添加方法为：根据基因序列，PCR扩增TsubE转录终止子片段，PCR反应体系（25ul）：Taq PCR MasterMIx 12.5ul，引物（YTE5’:CGGATCCTCGAACTTCGTATAATAGTAAAAAG）0.5ul，引物（YTE3’:CCCAAGCTTTCCGGTGCTTGTGAAG）0.5ul，模板（为枯草芽孢杆菌基因组DNA）1ul，Taq酶0.5ul，d₂H₂O 10.5ul；PCR扩增程序：95℃预变性5min，32个循环（95℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min），最后72℃延伸10min。扩增TsubE转录终止子基因后，与5’端添加PsubE启动子的葡萄糖脱氢酶基因用BamHⅠ酶和Hind Ⅲ酶进行双酶切（双酶切反应体系为TsubE 8ul，BamHⅠ1ul，Hind Ⅲ 1ul，10×K 2ul，d₂H₂O 8ul），再进行连接（连接体系为TsubE 3ul，gdh_PsubE 1ul，T4 ligase1ul，T4 ligase buffer 2.5ul，d₂H₂O 12.5ul），得到葡萄糖脱氢酶基因的完整表达元件（PaprN_gdh_taprN），该表达元件的核苷酸序列如序列表中序列3所示，然后将其克隆到芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pHY300PLK（购自TaKaRa）的BamHI和Sal I酶切位点之间，得到携带葡萄糖脱氢酶基因完整表达元件的芽孢杆菌表达载体pHYH，该载体的物理图谱如图2所示。

三、高效解磷芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1 CGMCC No.6089的获得

将携带葡萄糖脱氢酶基因完整表达元件的芽孢杆菌表达载体pHYH通过电击转化方法导入解磷细菌—芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57 CGMCC No.6473中，其中，芽孢杆菌PS57感受态细胞的制备及电击转化方法包括以下步骤：

1）按1:16（6％）的比例将过夜培养的菌液加入到新鲜的生长培养基中（含0.5M山梨醇的LB培养基），于37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.7-0.95；

2）将培养好的菌液置冰浴10min；

3）4℃、5,000rpm离心5in，收集菌体；

4）用冰预冷的电击液（0.5M 山梨醇，0.5M甘露醇）洗涤，离心收集菌体，共重复洗涤4次；

5）每40mL菌液细胞加入1mL电击液悬浮细胞；

6）将细胞悬浮液用1.5mL离心管分装，每管60μL，存于-70℃备用；

7）在60μL感受态细胞中加入1-2μL质粒DNA（50ng/μL），轻轻混匀并转移至一个干净的电击杯中，冰浴5-10min；

8）将电击杯放入电击仪（Gene Pulser II）(Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA,USA)进行电击，电击条件为：25μF，20KV/cm，200Ω；

9）立即加入940μL冰预冷的复苏液，并将样品从电击杯中转移到1.5mL离心管中；

10）30℃、150rpm振荡培养3h，使菌体复苏；

11）将复苏后的菌液涂布到含有浓度为30mg/mL抗生素四环素（Tet）的LB平板上。

最终，得到一株基因工程解磷细菌—高效解磷芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens），命名为PS57H1，该菌株已于2012年05月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6089。

PS57H1的测序结果表明其16sRNA序列与PS57的序列（序列1）相同，还含有一个葡萄糖脱氢酶基因表达元件序列（序列3）。

实施例2、高效解磷芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1 CGMCCNo.6089的解磷能力（无机磷的解磷能力）检测

1）平皿定性测定

将待测菌种活化后刮下菌苔，加入适量的无菌水，制成均匀的菌悬液（菌浓度为CFU（个/ml）=1.84×10⁹），用灭菌的滴管将菌悬液滴入到装有无机磷细菌筛选培养基（配方为：葡萄糖10g，磷酸三钙5g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.1g，氯化钾0.2g，酵母粉0.5g，硫酸锰0.002g，0.4％溴酚蓝（pH6.7）6mL，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.5，将培养基在使用前用常规方法115℃灭菌30min）的固体培养皿上，均匀的滴4个点，待菌悬液干后转到培养箱，28℃培养2-3d，观察结果。结果菌落的周围有透明的溶磷光圈，表明PS57H1有较好的溶磷能力。

2）钼锑抗比色法定量测定

具体方法与实施例1相同，芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57和芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1 CGMCC No.6089在无机磷细菌筛选平板上的解磷指数和在无机磷细菌液体培养基中的解磷能力测定（参见2.1和2.2）结果如表2所示，结果芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1 CGMCC No.6089菌株发酵液中的可溶磷含量为58.8mg/L，较对照PS57菌株（55.8mg/L）提高3％。

表2解磷菌PS57和PS57H1的解磷指数和解磷能力测定结果

*解磷指数：HD/CD=溶磷圈直径/菌落直径

*解磷能力：发酵液中可溶性磷含量

实施例3、制备高效解磷微生物菌剂

解磷芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1 CGMCC No.6089的发酵培养过程：

2）将高效解磷芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1 CGMCC No.6089按5％的比例接种于步骤1）的无机磷细菌液体培养基中，在摇瓶转速180-200r/min下培养20-24h，得到高效解磷芽孢杆菌PS57H1发酵菌液，干燥后得到固态菌剂。

高效解磷微生物菌剂的活性成分为所得到的PS57H1发酵菌液或其固态菌剂，其应用上可以有多种形式：

1、直接以发酵菌液（固体含量约占5％-50％）或其干燥后的固态菌剂，作为肥料的生物活化剂施用于作物土壤中，起到解磷作用。

2、在发酵菌液（固体含量约占5％-50％）中添加吸附剂如草炭、草木灰、蛭石等载体，形成含水量为10％-30％的固体，可作为肥料的生物活化剂施用于作物土壤中，起到解磷作用。

3、在发酵菌液（固体含量约占5％-50％）中添加吸附剂如草炭、草木灰、蛭石等载体，形成含水量为10％-30％的固体后，作为生物活化剂添加到磷肥（磷矿粉制成）中，生物活化剂添加比例可为磷肥的1-50％（按质量)，以此形成活化磷肥共同施用于作物土壤中。这里，活化磷肥中发挥菌剂的解磷能力，使难溶的磷酸三钙转化成磷酸一钙和磷酸二钙等。

一个具体的2-3的应用实例为：将上述发酵培养好的发酵液与高温灭菌后的草炭（购自北京清河花卉市场）、轻质碳酸钙（购自北京市金顶碳酸钙厂）按照1:4:0.04的比例（重量比）在搅拌机内搅拌均匀，形成潮湿的固体（含水量约为10％-30％），粉碎后得到PS57H1生物活化剂。

Claims

1.一株基因改造的高效解磷工程菌，为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）PS57H1，其保藏号为CGMCC No.6089。

2.根据权利要求1所述的高效解磷工程菌，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1是革兰氏阳性杆菌，顶端生芽孢；在YPD培养基上生长良好，48h形成直径2-3mm大小的圆形菌落，有运动性，好氧，菌落呈白色有光泽，表面湿润、平坦，边缘整齐；生长温度范围：25℃-37℃；生长酸碱度范围：pH2-9。

3.根据权利要求2所述的高效解磷工程菌，其特征在于：其生长温度范围：30℃-37℃。

4.根据权利要求2所述的高效解磷工程菌，其特征在于：其生长酸碱度：pH7.0。

5.一种高效解磷微生物菌剂，其活性成分为权利要求1或2或3或4所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1的发酵液或发酵液干燥得到的固体菌剂。

6.根据权利要求5所述高效解磷微生物菌剂，其特征在于，为所述发酵液与草炭、轻质碳酸钙经混合、粉碎得到的，三者混合重量比为1:3-5:0.03-0.05。

7.根据权利要求6所述高效解磷微生物菌剂，其特征在于，发酵液与草炭、轻质碳酸钙经混合重量比为1:4:0.04。

8.一种得到权利要求5或6或7所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）PS57H1的发酵液的方法，包括以下步骤：

1）配制无机磷细菌液体培养基，配方为：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，酵母粉0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，磷酸钙5g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.5，将培养基在使用前用常规方法115℃灭菌30min；

2）将权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1按5％的比例接种于步骤1）的无机磷细菌液体培养基中，在摇瓶转速180-200r/min下培养20-24h，得到PS57H1发酵液。

9.一种制备权利要求7所述高效解磷微生物菌剂的方法，将权利要求8所述PS57H1发酵液与高温灭菌后的草炭、轻质碳酸钙按照重量比1:4:0.04的比例在搅拌机内搅拌均匀，粉碎后得到。

10.一种活化磷肥，其特征在于，包括磷肥和按磷肥质量的1-50%添加的权利要求5或6或7所述高效解磷微生物菌剂。

11.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1在溶解土壤难溶磷中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述土壤难溶磷为包括磷酸钙、磷灰石和磷铁矿中的磷酸三钙的无机磷。