CN105925502A - 来源于蚕沙的菌株Bacillus megaterium OP6及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一株来源于蚕沙的菌株Bacillus megaterium OP6及其应用。本发明的菌株已于2015年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.11837。该菌株可用于制备土壤微生物菌剂或生物有机肥。具有显著的解磷解钾效果，提高土壤肥力；并可以有效抑制禾谷镰刀菌等土壤中作物有害病原微生物的生长，起到防治作物病害和提高作物抗病虫害能力的作用，从而提高作物的产量和品质，具有良好的应用前景。

Description

来源于蚕沙的菌株Bacillus megaterium OP6及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株来源于蚕沙的菌株Bacillusmegaterium OP6及其应用。
背景技术
我国大部分土壤磷含量在0.043-0.046％之间，磷含量比较匮乏，且土壤中的磷主要以固态的矿物质形式存在，约占全磷含量的70％左右，而作物吸收磷素主要是通过磷酸根形式吸收，因此土壤中水溶性无机磷酸根离子含量的高低对于作物吸收磷素起着重要的作用。目前我国现有的种植模式大多采用直接使用无机磷肥来满足作物对磷素的营养需求，但是由于无机磷肥的有效作用形式为磷酸根，在土壤中极易与碱性土壤中的钙盐及酸性土壤中的铁等离子发生反应，从而转化为不能被作物吸收的难溶性的磷酸盐，因此无机磷肥的利用率非常低，一般不高于20％。同样，土壤中钾含量一般在0.04-3.0％之间，其中90％存在于云母和长石等含钾矿物的晶体结构中，只有经过漫长的风化过程，从晶格结构中释放出来才能被作物吸收和利用。随着我国农业生产水平的快速增长，作物对土壤钾的消耗逐年增加，土壤缺钾现象严重。
如何有效利用土壤中的磷、钾元素，减少化学磷肥和钾肥的投入，逐渐成为人们关注的重点。众所周知，只有在理化因素和微生物的作用下，土壤中的难溶性磷及含钾矿物晶格结构中的钾才能释放出来，供作物生长需要。因此，有效利用解磷解钾微生物对土壤磷钾的分解，成为提高土壤磷钾有效化利用的重要途径之一。
蚕沙是养蚕生产中的主要有机废弃物，不但含有丰富的营养物质，还含有丰富的微生物菌群，经高通量测序分析，蚕沙中的微生物种类超过3000种，显示出明显的微生物多样性，其中富含具有固氮、解磷和解钾的微生物菌群。因此如何分离筛选并有效利用其中的微生物资源，成为本研究的关注重点。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一株来源于蚕沙的菌株Bacillus megateriumOP6。
本发明的另一目的在于提供上述菌株Bacillus megaterium OP6在制备土壤微生物菌剂或生物有机肥中的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一株来源于蚕沙的菌株Bacillus megaterium(巨大芽孢杆菌)OP6，已于2015年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.11837。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101。
上述的巨大芽孢杆菌是从蚕沙中分离纯化后得到，其性状如下：
菌落形态：本发明的巨大芽孢杆菌悬液经涂板与NA培养基后，30℃生化培养箱中培养2天，观察其菌落形态特征，结果如图1所示。由图1可见，本发明的巨大芽孢杆菌菌落乳白色，圆形，表面光滑稍突，不透明，边缘整齐。
将本发明的巨大芽孢杆菌按1％比例接种于NB培养基，30℃摇床中培养18h后，取悬液，点样到载玻片、烤片，经革兰氏染色，油镜观察菌株的形态特征，结果如图2所示。由图2可见，本发明的巨大芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，芽饱椭圆形，菌体为长杆状。
本发明巨大芽孢杆菌的16srDNA鉴定：菌株悬液为模板，16srDNA通用引物27F/1492R，PCR反应体系为50μL，反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，56℃30s，72℃2min，循环30次；72℃延伸10min。PCR产物纯化后送样测序。
本发明巨大芽孢杆菌的16srDNA的部分可变区序列测序结果通过NCBI/blast比对后发现与49-Y1412同源性最高，达99.8％以上，为巨大芽孢杆菌。
上述菌株Bacillus megaterium OP6在制备土壤微生物菌剂或生物有机肥中的应用。
上述菌株Bacillus megaterium OP6用于制备巨大芽孢杆菌原粉，包括如下制备步骤：
(1)活化菌种
活化Bacillus megaterium OP6菌株，从斜面中挑取菌落并在NA固体培养基划线培养，培养条件32℃，待OP6在NA固体培养基上生长18-24h后，挑取单菌落，用于一级种子液的制备；
(2)一级种子液的制备
选取NA固体培养基上的单菌落，接种于一级种子摇瓶中，将一级种子摇瓶在32℃、200r/min下培养12h，得到一级种子液；
(3)二级种子液的制备
种子罐中的培养基为NB液体培养基，121℃下，灭菌20min，将一级种子液接入种子罐中，接种量体积比为0.5～1％；培养条件为：通气比1:1，搅拌转速为250～400r/min，培养温度32℃，罐压0.05MPa，培养时间为12小时，培养结束时得到二级种子液，其活菌含量为1～3×108cfu/mL，OD值在0.7～0.8左右，此时菌种活力强；
(4)巨大芽孢杆菌OP6的菌液发酵
发酵培养基配方按重量百分比：玉米淀粉1.5～3.0％；豆粕粉1.0～2.5％；蚕蛹粉0.1～1.0％，酵母膏0.5～1％，氯化钠0.1～0.5％；碳酸钙0.1～0.5％；硫酸镁0.05～0.15％；磷酸二氢钾0.01～0.05％，硫酸锰0.01～0.05％，碳酸氢钠0.05～0.15％；pH7.0～7.4，121℃灭菌30min；
将巨大芽孢杆菌OP6的二级种子液，按照接种量体积比为0.5～1％接入发酵罐中，培养条件为：通气比为1:0.7，搅拌转速为180r/min、罐压0.05MPa、培养温度32℃、培养时间为48h，发酵过程中根据泡沫情况流加消泡剂；下罐时间以取样镜检芽孢90％以上释放为准，成熟发酵液中巨大芽孢杆菌OP6活芽孢含量为30～40×108cfu/mL，得到发酵成熟菌剂；
(5)巨大芽孢杆菌原粉的制备
步骤(4)所得的发酵成熟菌剂经碟片离心机或微滤设备浓缩后，加入轻质碳酸钙，浓缩成熟发酵菌剂与轻质碳酸钙的重量比为100:3，得到液固混合物，将该液固混合物搅拌30min后，利用输料泵将液固混合物送入离心式喷雾塔中干燥，得到巨大芽孢杆菌OP6原粉。
所得巨大芽孢杆菌OP6原粉中活菌浓度为3～4亿/克干粉。
本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)OP6具有如下优点及有益效果：
(1)本发明的巨大芽孢杆菌菌株来源于蚕沙，为蚕沙堆肥过程中的自生菌，与蚕沙有机肥的配合性好；
(2)本发明的巨大芽孢杆菌OP6菌株耐高温性好，在60度高温下培养和运输均可以存活，在土壤微生物菌剂制备方面具有相当的优势；
(3)本发明的巨大芽孢杆菌OP6菌株可以高效分解土壤中无机磷和矿物质钾，制备成土壤微生物菌剂或添加到蚕沙有机肥后，具有显著的解磷解钾效果，提高土壤肥力，该菌株可用于制备单一微生物菌剂、复合微生物菌剂、生物有机肥等；
(4)本发明的巨大芽孢杆菌OP6菌株可以有效抑制禾谷镰刀菌(Fusariumsambucinum)等土壤中作物有害病原微生物的生长，起到防治作物病害和提高作物抗病虫害能力的作用，从而提高作物的产量和品质。
附图说明
图1为本发明巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)OP6的菌落形态特征图；
图2为本发明巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)OP6的菌株形态特征图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)OP6的分离及鉴定
(1)样品稀释：从发酵腐熟的蚕沙堆肥中取样，称取5g溶解到装有45ml无菌水的三角瓶中，150rp振荡器振荡成均匀的10-1稀释液，然后用1ml移液枪吸取该稀释液1ml至装有9ml无菌水的试管中，充分摇匀，即制成10-2的样品稀释液，并依次稀释至10-6；
(2)培养基准备：
无机磷筛选培养基：葡萄糖10.0g、Ca3(PO4)2 5.0g、(NH4)2SO4 0.5g、NaCl 0.2g、KCl 0.2g、MgSO4·7H2O 0.1g、FeSO4·7H2O 0.03g、MnSO4·4H2O0.03g、酵母粉0.5g、琼脂粉20g、蒸馏水1000mL、pH 6.8～7.2。
有机磷筛选培养基：葡萄糖10.0g、(NH4)2SO4 0.5g、KCl 0.3g、NaCl 0.3g、FeSO4·7H2O 0.03g、MgSO4·4H2O 0.03g、CaCO35.0g、卵磷脂0.2g、琼脂粉20g、蒸馏水1000mL、pH7.0～7.5。
解钾培养基：葡萄糖10.0g，NH4NO33.0g，NaH2PO41.0g，FeSO4·7H2O 1.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，钾长石1.5g，蒸馏水1000ml，琼脂20.0g，pH 7.0～7.4，灭菌20min。
NA培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCL5g，琼脂粉20g，蒸馏水1000ml，PH7.0；121℃灭菌20min，于45℃-55℃倾倒至无菌的培养皿；
(3)菌种分离、筛选：分别吸取不同稀释倍数的稀释液0.1ml，均匀涂布于冷却好的有机磷、无机磷和解钾培养基，放置30℃培养箱中倒置培养5天，观察并挑选长势良好、解磷、解钾圈显著的菌落于NA培养基培养；
(4)菌种纯化：将所挑选出菌于NA培养基培养后，再分别涂板与有机磷、无机磷和解钾培养基培养，选取在三种培养基上长势良好、且溶磷、解钾圈都显著的1个菌与NA培养基上培养纯化，并命名菌株OP6；
(5)菌株的鉴定
A、形态鉴定：巨大芽孢杆菌OP6的菌落形态为乳白色，圆形，表面光滑稍突，不透明，边缘整齐。革兰氏染色结果表明巨大芽孢杆菌OP6为革兰氏阳性菌，芽饱椭圆形，菌体为长杆状。
B、分子生物学鉴定：OP6的16S rDNA系列分析，结果通过NCBI/blast比对后发现与49-Y1412同源性最高，达99.8％以上，为巨大芽孢杆菌。具体序列见序列表。
(6)菌株OP6鉴定结论
根据菌株ZFH-3的形态学及16rDNA基因系列分析，鉴定OP6为巨大芽孢杆菌((Bacillus megaterium)，于2015年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.11837。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101。
本实施例所得巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)OP6解磷解钾效果测定：
采用全氮比色法在硫酸铜或硫酸钾存在下，浓硫酸中加入菌液，并加热使试样中的氮元素全部转化为氨态氮，与奈氏试剂反应，于420nm波长处进行比色测定，根据标准曲线计算固氮量。
采用钼锑抗比色法测定发酵上清液中的有效磷含量。可溶性磷酸盐在酸性条件下可与钼酸铵结合生产磷钼酸酰胺，这种化合物经对苯二酚还原成蓝色化合物，用可见光分光光度计在波长720nm处测定钼锑抗的吸光值，以定量分析可溶性磷的含量。
与对照菌相比，本发明的巨大芽孢杆菌OP6的解磷效果与溶磷菌相当，而解钾效果显著高于解钾对照菌。
本实施例所得巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)OP6拮抗镰刀菌效果测定：
采用平板对峙法，在平板中央接种镰刀菌病原菌，在距其约1-1.5cm处放置滤纸片(去除表面活性剂，肥皂水浸泡，冲洗干净，烘干，灭菌)，点5-6ul巨大芽孢杆菌OP6的发酵液，待完全吸收后，倒置培养2-3天，观察结果。发现巨大芽孢杆菌OP6对禾谷镰刀菌(Fusarium sambucinum)，双孢镰刀菌(Fusariumcatenulatum)，接骨木镰刀菌(Fusarium graminearum)有较好的拮抗效果。
实施例2
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)OP6菌剂原粉的制备
(1)活化菌种
活化巨大芽孢杆菌OP6菌株,从斜面中挑取菌落并在NA固体培养基划线培养，培养条件32℃，待OP6在NA固体培养基上生长18-24h后，挑取单菌落，用于一级种子液的制备；
(2)一级种子液的制备
选取NA固体培养基上的单菌落，接种于一级种子摇瓶中，摇瓶体积为250mL，一级种子NB液态培养基(121℃下，灭菌20min)的装液量100ml，将一级种子摇瓶在32℃、200r/min下培养12h，得到一级种子液；
(3)二级种子液的制备
种子罐中的培养基仍为NB液体培养基，121℃下，灭菌20min，将一级种子液接入种子罐中，接种量为0.5-1％(V/V)；培养条件为：通气比1：1，搅拌转速为250-400r/min，培养温度32℃，罐压0.05MPa，培养时间为12小时，培养结束时得到二级种子液，其活菌含量为1-3×108cfu/mL，OD值在0.7-0.8左右，此时菌种活力强；
(4)巨大芽孢杆菌OP6的菌液发酵
发酵培养基配方(重量百分比)：玉米淀粉1.5-3.0％；豆粕粉1.0-2.5％；酵母膏0.5-1％，氯化钠0.1-0.5％；碳酸钙0.1-0.5％；硫酸镁0.05-0.15％；磷酸二氢钾0.01-0.05％，硫酸锰0.01-0.05％，碳酸氢钠0.05-0.15％。pH7.0-7.4，121℃灭菌30min；
将巨大芽孢杆菌OP6的二级种子液，按照接种量为0.5-1％(V/V)接入发酵罐中，培养条件为：通气比为1：0.7，搅拌转速为180r/min、罐压0.05MPa、培养温度32℃、培养时间为48h左右，发酵过程中根据泡沫情况流加消泡剂；下罐时间以取样镜检芽孢90％以上释放为准，成熟发酵液中巨大芽孢杆菌OP6活芽孢含量为30～40×108cfu/mL，得到发酵成熟菌剂；
(5)巨大芽孢杆菌原粉的制备
步骤(4)所得的发酵成熟菌剂(活芽孢含量为30～40×108cfu/mL)经碟片离心机或微滤设备浓缩后，加入轻质碳酸钙，浓缩成熟发酵菌剂与轻质碳酸钙的重量比为100:3，得到液固混合物，将该液固混合物搅拌30min后，利用输料泵将液固混合物送入离心式喷雾塔中干燥，得到巨大芽孢杆菌OP6原粉。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一株来源于蚕沙的菌株Bacillus megaterium OP6，于2015年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.11837。
2.权利要求1所述的菌株Bacillus megaterium OP6在制备土壤微生物菌剂或生物有机肥中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述菌株Bacillus megateriumOP6用于制备巨大芽孢杆菌原粉，包括如下制备步骤：
(1)活化菌种
活化Bacillus megaterium OP6菌株，从斜面中挑取菌落并在NA固体培养基划线培养，培养条件32℃，待OP6在NA固体培养基上生长18-24h后，挑取单菌落，用于一级种子液的制备；
(2)一级种子液的制备
选取NA固体培养基上的单菌落，接种于一级种子摇瓶中，将一级种子摇瓶在32℃、200r/min下培养12h，得到一级种子液；
(3)二级种子液的制备
种子罐中的培养基为NB液体培养基，121℃下，灭菌20min，将一级种子液接入种子罐中，接种量体积比为0.5～1％；培养条件为：通气比1:1，搅拌转速为250～400r/min，培养温度32℃，罐压0.05MPa，培养时间为12小时，培养结束时得到二级种子液，其活菌含量为1～3×108cfu/mL，OD值在0.7～0.8左右，此时菌种活力强；
(4)巨大芽孢杆菌OP6的菌液发酵
发酵培养基配方按重量百分比：玉米淀粉1.5～3.0％；豆粕粉1.0～2.5％；蚕蛹粉0.1～1.0％，酵母膏0.5～1％，氯化钠0.1～0.5％；碳酸钙0.1～0.5％；硫酸镁0.05～0.15％；磷酸二氢钾0.01～0.05％，硫酸锰0.01～0.05％，碳酸氢钠0.05～0.15％；pH7.0～7.4，121℃灭菌30min；
将巨大芽孢杆菌OP6的二级种子液，按照接种量体积比为0.5～1％接入发酵罐中，培养条件为：通气比为1:0.7，搅拌转速为180r/min、罐压0.05MPa、培养温度32℃、培养时间为48h，发酵过程中根据泡沫情况流加消泡剂；下罐时间以取样镜检芽孢90％以上释放为准，成熟发酵液中巨大芽孢杆菌OP6活芽孢含量为30～40×108cfu/mL，得到发酵成熟菌剂；
(5)巨大芽孢杆菌原粉的制备
步骤(4)所得的发酵成熟菌剂经碟片离心机或微滤设备浓缩后，加入轻质碳酸钙，浓缩成熟发酵菌剂与轻质碳酸钙的重量比为100:3，得到液固混合物，将该液固混合物搅拌30min后，利用输料泵将液固混合物送入离心式喷雾塔中干燥，得到巨大芽孢杆菌OP6原粉。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所得巨大芽孢杆菌OP6原粉中活菌浓度为3～4亿/克干粉。
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