CN104909846B - 一种含有解淀粉芽孢杆菌hfj‑7的复合鸡粪腐熟发酵剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含有解淀粉芽孢杆菌HFJ‑7的复合鸡粪腐熟发酵剂及其应用，所述发酵剂包括以下组分：解淀粉芽孢杆菌HFJ‑7、中性纤维素酶、中性木聚糖酶、耐高温脂肪酶，并以稻壳粉为复配载体。解淀粉芽孢杆菌HFJ‑7其保藏号是CGMCC No.10011。所述含解淀粉芽孢杆菌复合鸡粪腐熟发酵剂，接种于含水量50%‑55%的鸡粪为主料、蘑菇棒为辅料的复合有机物料中，主料：辅料质量比=6:4。本发明能极其显著杀灭鸡粪中超过99.99%的粪大肠菌群，并可显著去除鸡粪中的氨氮。所述发酵剂接种于鸡粪发酵后，还可提高发芽指数与幼苗定植成功率，很好地实现了鸡粪等养殖废弃物的无公害化处理。

Description

一种含有解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的复合鸡粪腐熟发酵剂及其 应用

技术领域

本发明属于生物发酵领域，涉及鸡粪发酵剂配方，具体涉及一种含有解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的复合鸡粪腐熟发酵剂及其应用。

背景技术

有机废弃物种类繁多，包括多农作物秸秆、畜禽粪便、生活垃圾及城市污泥等。畜禽粪便是比较重要的有机废弃物，近年来，已经日益引起社会各界关照。去年11月，国务院签发《畜禽规模养殖污染防治条例》，自2014年1月1日起施行。条例规定，畜禽养殖废弃物未经处理，不得直接向环境排放，条例中明确鼓励对畜禽养殖废弃物进行综合利用。

在对养殖废弃物进行综合利用前，必须按照国家与农业部的标准，对其进行无公害化处理，相对于焚烧、填埋等传统处理方式，生物腐熟处理是比较新型、有效、绿色、环保的处理方式。用于生物腐熟处理的发酵剂一般由微生物与酶制剂复合而成，微生物包括多种能分解各种有机物料的细菌、真菌、放线菌，酶制剂则多根据需处理物料的组分而做出相应的配合。鸡粪中的粗蛋白一般为25％-30％，尿酸、氨、尿素等非蛋白氮一般为30％-50％，粗纤维一般为12％-17％，如何有效利用利用这些营养物质，变废为宝，是鸡粪类有机废弃物无公害化处理研发的方向。本发明选用筛选自辣椒根际土的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7，它可拮抗立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉病原菌等多种病原真菌，还可产生淀粉酶、蛋白酶、尿素酶等酶类，考虑到鸡粪中营养物质种类繁杂，在复合鸡粪腐熟发酵剂配方中再添加中性纤维素酶、中性木聚糖酶、耐高温脂肪酶等多种酶类，旨在丰富其酶系组成，接种鸡粪后能更迅速有效地酶解其碳水化合物、蛋白、非蛋白氮、纤维素、半纤维素、脂肪等多种营养物质，为解淀粉芽孢杆菌在鸡粪中的萌发、生长、繁殖等生命活动提供足够的养分与能量。耐高温脂肪酶的加入，还可在发酵中期环境温度较高时持续发挥作用，释放养分以维持菌体增殖，可显著降低鸡粪中粪大肠菌群数量，杀菌率达99.99％，并可显著降低氨氮含量，提高发芽指数与幼苗定植成功率，很好地实现了鸡粪等养殖废弃物的无公害化处理。

发明内容

本发明提供了一种含有解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的复合鸡粪腐熟发酵剂及其应用，使用本发明所述的复合鸡粪腐熟发酵剂，可显著降低鸡粪中粪大肠菌群数量，杀菌率超过99.99％，并可显著降低氨氮含量，提高发芽指数与幼苗定植成功率，很好地实现了鸡粪等养殖废弃物的无公害化处理。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种含有解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的复合鸡粪腐熟发酵剂，它以稻壳粉为复配载体，还包括以下组分：含菌量为4×10⁸CFU/g～4.4×10⁸CFU/g的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7，酶活为900U/g～1000U/g的中性纤维素酶，酶活为200U/g～250U/g的中性木聚糖酶和酶活为80U/g～100U/g的耐高温脂肪酶。

所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7经分子鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens，于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号是CGMCC No.10011。

本发明还提供了所述的含有解淀粉芽孢杆菌的复合鸡粪腐熟发酵剂，所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7选用含菌量为2000×10⁸CFU/g--2200×10⁸CFU/g的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉；中性纤维素酶选用酶活为45000U/g～50000U/g的中性纤维素酶原酶粉；中性木聚糖酶选用酶活为100000U/g～125000U/g的中性木聚糖酶原酶粉；耐高温脂肪酶选用酶活为40000U/g～50000U/g的耐高温脂肪酶原酶粉。

所述鸡粪腐熟发酵剂组成成分的质量比例为：解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉：中性纤维素酶原酶粉：中性木聚糖酶原酶粉：耐高温脂肪酶原酶粉：稻壳粉＝1:10:1:1:500，混合均匀。

本发明还提供了所述的含有解淀粉芽孢杆菌的复合鸡粪腐熟发酵剂在发酵鸡粪中的应用。

对上述技术方案的进一步改进：所述鸡粪腐熟发酵剂以占物料1％的质量比例接种于含水量50％-55％的复合有机物料中，所述复合有机物料的主料为鸡粪、辅料为蘑菇棒，主料：辅料质量比＝6:4，混合均匀，进行好氧发酵。

对上述技术方案的进一步改进：所述好氧发酵的时间为15d，每3天翻抛一次。

对上述技术方案的进一步改进：所述腐熟发酵剂接种于鸡粪发酵后，能显著鸡粪中的杀灭粪大肠菌群，降低氨氮含量。

对上述技术方案的进一步改进：所述发酵剂接种于鸡粪发酵后获得的腐熟后鸡粪，能显著提高油菜种子发芽指数，防止烧苗现象。

对上述技术方案的进一步改进：所述发酵剂接种于鸡粪发酵后获得的腐熟后鸡粪，用做幼苗定植底肥，能显著辣椒苗定植成功率。

与现有技术相比，本发明方法的优点和技术效果是：

1、本发明提供的解淀粉芽孢杆菌菌株HFJ-7具有优异的产尿素酶、降氨氮等能力，是选出的优异菌株，经分子鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号是CGMCC No.10011。

2、本发明所述复合鸡粪腐熟发酵剂含有解淀粉芽孢杆菌菌株HFJ-7，此菌株在鸡粪腐熟发酵过程中，可进行好氧呼吸与繁殖，产生大量热量，使得鸡粪的平均温度高于70℃，可显著降低鸡粪中大肠菌群数量，杀菌率达99.9％，并实现氨氮的有效去除，腐熟后可提高发芽指数，作为底肥也可提高幼苗定植成功率，真正实现了鸡粪等养殖废弃物的无公害化处理。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他优点将变得更加清楚。

附图说明

图1表明解淀粉芽孢杆菌HFJ-7对多种土传病害病原真菌的拮抗特性；

图2表明解淀粉芽孢杆菌HFJ-7具有产生淀粉酶与蛋白酶的特性；图2a为淀粉酶酶解平板，图2b为蛋白酶酶解平板；

图3表明不同菌株以鸡粪为底物培养后的尿素酶活性与氨氮含量；

图4表明解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉的生产工艺流程图；

图5表明所述含解淀粉芽孢杆菌复合鸡粪腐熟发酵剂的应用方案；

图6表明鸡粪腐熟发酵过程中翻抛次数对发酵平均温度与粪大肠菌群数量的影响；

图7表明同一稀释梯度下腐熟前与腐熟后的粪大肠菌群数量；

图8表明鸡粪腐熟发酵前后油菜种子发芽指数的变化；

图9腐熟前后鸡粪用作底肥时的辣椒苗定植成功率。

具体实施方式

为更好地了解该解淀粉芽孢杆菌复合鸡粪腐熟发酵剂的功能，下面结合附图和具体实施例对本发明的产品引用特点做进一步详细的说明。

实施例1、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的分离筛选与鉴定保藏

一、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的分离筛选

2012年1月至2012年3月，从山东省潍坊市寿光市上口镇10家辣椒蔬菜大棚取30个辣椒根际土样本。土样分别充分研磨，于75℃水浴内加热处理20min，然后用无菌生理盐水中1000倍稀释，于营养琼脂NA平板上稀释涂布，挑取单菌落划线纯化，共筛选出68株纯菌，经镜检均为芽孢杆菌，其中包括菌株HFJ-7。

二、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与其他菌株的病原真菌抗性能力比较

采用平板对峙的方法，以立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉等土传病害病原真菌为靶标病原真菌，考察68株芽孢杆菌之间病原真菌拮抗特性的差异。先用打孔器获得6mm直径的病原菌菌块，接于PDA平板中央，在平皿四周，垂直据中心约3cm出，接种靶标菌菌线，长度约为1cm。考虑到不同病原真菌生长速度不同，立枯丝核菌预培养8h、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉病原菌预培养24h，然后每平皿接种4株待试菌株，28℃培养4d后，考察解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与其他芽孢杆菌相比，对多种土传病害病原真菌的拮抗特性。记录抑菌带宽度，即两种菌平行生长之间的无菌区域宽度。根据拮抗带的宽窄，选取对病原真菌有较强拮抗能力的菌株。

筛选结果显示，15株菌对立枯丝核菌有较强拮抗作用，13株菌对尖孢镰刀菌有较强拮抗作用，10株菌对根腐菌有较强拮抗作用，9株菌对黄瓜枯萎病病原菌有较强拮抗作用，7株菌对辣椒疫霉病原菌有较强拮抗作用。仅有4株菌同时对5种病原真菌靶标菌均具有拮抗作用，分别为：解淀粉芽孢杆菌HFJ-7、枯草芽孢杆菌G4和G11、地衣芽孢杆菌D2。

图1展示了解淀粉芽孢杆菌HFJ-7对多种土传病害病原真菌的拮抗特性，其中a-1图表示在解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的四面接种的拮抗下，病原真菌立枯丝核菌的生长受到明显抑制。a-2图表示，与枯草芽孢杆菌G4、地衣芽孢杆菌D5、侧孢芽孢杆菌M9相比，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7具有更强立枯丝核菌拮抗效果；b图表示与枯草芽孢杆菌G1、G11、地衣芽孢杆菌D2等相比，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7能更好地拮抗靶标病原菌-尖孢镰刀菌菌，且抑菌带宽度为6mm；c图表示与枯草芽孢杆菌G7、地衣芽孢杆菌D8相比，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7能更好地拮抗靶标病原菌-根腐病病原菌，且抑菌带宽度为5mm；d图表示与地衣芽孢杆菌D8相比，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7能更好地拮抗靶标病原菌-黄瓜枯萎病病原菌，且抑菌带宽度为8mm；e图表示与枯草芽孢杆菌G4相比，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7能更好地拮抗靶标病原菌-辣椒疫霉，且抑菌带宽度为6mm。

系列对比拮抗试验结果显示，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与枯草、地衣、侧孢等芽孢杆菌相比，可对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、根腐病病原菌、黄瓜枯萎病病原菌、辣椒疫霉病原菌等多种土传病害病原真菌，产生明显的抑菌带，均大于等于5mm，其中对黄瓜枯萎病病原菌的抗性最强，抑菌带宽度高达8mm。

三、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的生理理化与分子遗传学分类鉴定

分别采用生理生化法语分子遗传学方法，对解淀粉芽孢杆菌HFJ-7进行鉴定。

经细菌生理生化方法初步鉴定，菌株HFJ-7为芽孢杆菌属，其生物学特性：革兰氏染色阳性，在营养琼脂平板上形成的菌落直径约3-3.5mm，边缘不整齐，中间褶皱，淡黄色。菌体形态呈杆状，芽孢椭圆形，端生，0.84×0.52μm。

接着采用分子遗传学方法，对菌株芽孢杆菌HFJ-7进一步分类鉴定。首先提取菌株HFJ-7的DNA，以该DNA为模板，16S rRNA通用引物为引物，对16S rRNA片段进行扩增，扩增片段进行序列测定。测序结果用Blast软件与GenBank中相关属种的16S rRNA序列进行比对，结果显示该菌株16S rRNA序列与GenBank基因库中芽孢杆菌属中的Bacilluspumilus的16srRNA序列同源度最高，同源率达到99％。通过DNAMAN6.0对Genbank中已有的芽孢杆菌属的16S rRNA序列进行遗传进化分析，结果显示，菌株S3 16S rRNA与Bacillusamyloliquefaciens同源性最高，判定该菌株为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌。

将筛选到的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2014年11月19日；解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens的保藏编号为CGMCC No.10011。

实施例2、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7具有产生淀粉酶与蛋白酶的特性

分别在淀粉酶与蛋白酶活性检测培养基上测定解淀粉芽孢杆菌HFJ-7产生淀粉酶与蛋白酶的能力，并与本实验室自主分离保存的解淀粉芽孢杆菌HFJ-8、枯草芽孢杆菌G4与G7、地衣芽孢杆菌D2、侧孢芽孢杆菌M9等进行对比。

淀粉酶活性检测培养基：可溶性淀粉2g，蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL，调节PH调节至7.2，121℃灭菌30min。卢哥氏碘液配制方法：碘片1g，碘化钾2g，加蒸馏水定容至250ml。试验过程如下：于90mm灭菌培养皿内分装培养基，每皿20mL，凝固后于37℃下恒温预培养24h，确定无污染方可使用。将90mm平皿分为6个扇形区域，每个区域正中心距离平皿中间点约30mm处，分别点接6株芽孢菌于该培养基上，37℃恒温培养箱内倒置培养培养24h，测定淀粉酶解圈大小。在平皿菌落周围滴加卢哥氏碘液，轻摇平皿，使碘液铺满培养基表明，等待片刻，若有水解圈说明此菌株具有产生淀粉酶活性，观察并记录酶解圈与菌落直径大小，计算比值，以比较这6株菌产淀粉酶的能力。

蛋白酶活性检测培养基：干酪素10g，酵母膏1g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL，调节PH调节至7.3，116℃灭菌30min。酸性汞试剂配制方法：HgCl₂15g，浓盐酸20mL，加蒸馏水定容至100mL。试验过程如下：于90mm灭菌培养皿内分装培养基，每皿20mL，凝固后于37℃下恒温预培养24h，确定无污染方可使用。将90mm平皿分为6个扇形区域，每个区域正中心距离平皿中间点约30mm处，分别点接6株芽孢菌于该培养基上，37℃恒温培养箱内倒置培养培养24h，取出培养皿，在菌落周围滴加酸性汞试剂，放置10s，可产生蛋白酶的菌落周围会出现透明圈，观察并记录酶解圈与菌落直径大小，计算比值，以比较这6株菌产蛋白酶的能力。

图2展示了解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与其他5株菌在淀粉酶与蛋白酶活性检测培养基上的产酶特性，酶解比值记录如下表1：

表1.解淀粉芽孢杆菌HFJ-7与其他5株菌在淀粉酶与蛋白酶活性检测培养基上的酶解比值

图2与表1表明，与枯草芽孢杆菌G4、G11，地衣芽孢杆菌D2，侧孢芽孢杆菌M9相比，解淀粉芽孢杆杆菌具有更强的产生淀粉酶与蛋白酶能力(图2a和图2b所示)，其中解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的产酶能力最强，淀粉酶酶解圈与菌落的直径比值可达5.34，蛋白酶酶解圈与菌落的直径比值可达5.11，显著强于其他菌株，这将促进其对土壤中淀粉类碳源、蛋白类氮源的迅速利用，该特性也将有利于解淀粉芽孢杆菌HFJ-7液体发酵增殖培养与成本降低。

实施例3、解淀粉芽孢杆菌HFJ-7具有产生尿素酶的特性

以20％鸡粪溶液为底物，接种解淀粉芽孢杆菌HFJ-7，对比菌株枯草芽孢杆菌HFB-3和HFB-12，地衣芽孢杆菌HFD-1和乳酸菌HFL-10，180rpm，震荡培养24h，根据国标GB/T8622-2006饲料用大豆制品中尿素酶活性的测定测定尿素酶活性，采用CJT 51-2004城市污水水质检验方法标准-纳氏试剂分光光度法，测定氨氮含量。每个处理3个重复，并应用SPSS软件对数据进行差异性分析。

图3显示了上述不同菌株以鸡粪为底物培养后的尿素酶活性与氨氮含量，说明不同菌株间的脲酶活性与降氨氮能力有较大差异。柱状图表示不同菌株的尿素酶活性，结果显示解淀粉芽孢杆菌菌株HFJ-7的脲酶活性显著高于其他4株菌(p<0.05)，而2株枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌HFD-1的脲酶酶活性物显著差异(p>0.05)。线状图显示了不同菌株鸡粪发酵液的氨氮含量，其中解淀粉芽孢杆菌菌株HFJ-7鸡粪发酵液的氨氮含量显著低于其他4株菌(p<0.05)。氨氮含量与脲酶活性值显现出相对应的趋势，即脲酶活性高的菌株，残留的氨氮含量相应较低，反之，乳酸菌HFL-10的尿素酶活性较低，其鸡粪发酵液的氨氮含量则比较高。结果显示，解淀粉芽孢杆菌解淀粉芽孢杆菌菌株HFJ-7有较强的尿素酶产生与降氨氮能力，是潜在的鸡粪腐熟发酵优势菌株。

实施例4、含解淀粉芽孢杆菌的复合鸡粪腐熟发酵剂的制备

本发明所述含有解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的复合鸡粪腐熟发酵剂，它包括以下组分：含菌量为4×10⁸CFU/g～4.4×10⁸CFU/g的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7，酶活为900U/g～1000U/g的中性纤维素酶，酶活为200U/g～250U/g的中性木聚糖酶，酶活为80U/g～100U/g的耐高温脂肪酶，以稻壳粉为复配载体。本发明所使用的稻壳粉为市售普通产品。本发明所述中性纤维素酶、中性木聚糖酶、耐高温脂肪酶等，均为市售常规高浓度酶粉稀释配制而成。

所述含解淀粉芽孢杆菌复合鸡粪腐熟发酵剂各组分为：所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7选用含菌量为2000×10⁸CFU/g--2200×10⁸CFU/g的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉；中性纤维素酶选用酶活为45000U/g～50000U/g的中性纤维素酶原酶粉；中性木聚糖酶选用酶活为100000U/g～125000U/g的中性木聚糖酶原酶粉；耐高温脂肪酶选用酶活为40000U/g～50000U/g的耐高温脂肪酶原酶粉。

本实施例中含解淀粉芽孢杆菌复合鸡粪腐熟发酵剂组成成分的质量比例为：解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉：中性纤维素酶原酶粉：中性木聚糖酶原酶粉：耐高温脂肪酶原酶粉：稻壳粉＝1:10:1:1:500。采用SLHSJ双轴桨叶式高效混合机，混合20min～25min，保证均匀度，制备成含有解淀粉芽孢杆菌的鸡粪腐熟发酵剂。

所述解淀粉芽孢杆菌的复合鸡粪腐熟发酵剂种选用解淀粉芽孢杆菌HFJ-7，它作为一种芽孢杆菌，其孢子状态的菌粉具有非常强的抗拟性，在鸡粪中因养分合适又可迅速萌发、繁殖，是非常好的复合腐熟剂菌株。解淀粉芽孢杆菌HFJ-7本身可产生淀粉酶、蛋白酶、尿素酶等酶，考虑到鸡粪中营养物质种类繁杂，在复合鸡粪腐熟发酵剂配方中再添加中性纤维素酶、中性木聚糖酶、耐高温脂肪酶等多种酶类，旨在丰富其酶系组成，接种鸡粪与蘑菇棒等辅料后，能更迅速有效地酶解其碳水化合物、蛋白、非蛋白氮、纤维素、半纤维素、脂肪等多种营养物质，为解淀粉芽孢杆菌在鸡粪中的萌发、生长、繁殖等生命活动提供足够的养分与能量。耐高温脂肪酶的加入，还可在发酵中期环境温度较高时持续发挥作用，释放养分以维持菌体增殖。

本发明所述解淀粉芽孢杆菌菌粉是由自主分离筛选的菌株，解淀粉芽孢杆菌HFJ-7发酵后喷雾而成，其生产工艺流程图如图4所示，具体步骤如下：

(1)种子罐培养

将不低于99％孢子率的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7一级种子，接种到装有种子培养基的灭菌种子罐中，37℃培养10h，形成大量营养体，作为二级种子培养液。所述种子培养基组分包括(g/L)：糖蜜，24.5～25.0；蛋白胨，13.5～13.7；磷酸二氢钾，1.7～1.8；柠檬酸钠，1.5～1.6；硝酸铵，1.5～1.6；硫酸镁，0.5～0.52；调节起始pH至7.2。种子罐体积为500L，培养基定容至300L，实消条件：恒温121℃保持30min；培养条件：恒温37℃±1℃，罐压0.05Mpa，转速0-6h 130rpm、6-10h 160rpm；通风量0-6h 5.1m³/h、6-10h 8.8m³/h。

(2)发酵罐培养

将种子罐中种子培养液转接至30吨生产罐进行发酵培养，37℃培养24h，当孢子率超过95％时，停罐，获得发酵液；发酵培养基组成(g/L)：豆粕粉，25.0；玉米浆干粉，18.5；氯化钠，4.0；磷酸二氢钠，2.8；磷酸氢二钾，1.2；氯化镁，0.55；硫酸锰，0.15；中性蛋白酶，2.0；糖化酶，1.5；消泡剂，1.3；用50％氢氧化钠流加，调节起始pH至7.4；种子罐体积为30000L，培养基定容至21000L，实消条件：恒温116℃保持30min；培养条件：恒温37℃±1℃，罐压0.05Mpa，转速0-10h 140rpm、10-18h 180rpm、18-24h 160rpm；通风量0-10h 165m³/h、10-18h 215m³/h、18-24h 180m³/h。所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7发酵液在放罐时的菌量一般达到450×10⁸CFU/g～500×10⁸CFU/g。

(3)将发酵液与载体混合进行后处理，获得解淀粉芽孢杆菌菌菌粉。

所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7后处理过程：喷雾干燥塔，LPG-6000型，进风145℃-150℃，出风65℃-70℃，载体为轻质碳酸钙，添加载体占发酵液的质量比例为：10％-15％。所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7筛分与质检过程：超过90％菌粉均过80目筛，并参考国标GBT 26428-2010饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测，测定解淀粉芽孢杆菌菌量，质检合格，制备为解淀粉芽孢杆菌菌粉。所述解淀粉芽孢杆菌HJF-7菌粉中含菌量范围2000×10⁸～2200×10⁸CFU/g。

实施例5、含解淀粉芽孢杆菌复合鸡粪腐熟发酵剂的应用方案

本发明所述含解淀粉芽孢杆菌复合鸡粪腐熟发酵剂的应用方案如图5所示，具体为：鸡粪作为主要原料进场，水分一般为60％-70％之间，辅料多选用蘑菇棒、锯末等。本发明所述含解淀粉芽孢杆菌复合鸡粪腐熟发酵剂，以占有机物料1％的质量比例，接种于以鸡粪为主料、蘑菇棒为辅料的复合有机物料中，主料：辅料质量比＝6:4，复合有机物料的含水量为50％-55％，发酵时间为15d，每2天-3天翻抛一次。采用链板式翻抛机将所有物料在发酵池内混合均匀，采用槽式好氧深层发酵工艺进行发酵，一般发酵15d左右后发酵完成，可以出池。出池后进入后熟程序，这是为了使得有机物料更好地实现腐殖化，一般时间为冬季30d，夏季20d，之后进行摊开晾晒，保证水分低于15％，然后进行养分调配，保证有机质含量超过53％，氮、磷、钾三者相加不低于10％，然后进行筛选与质检，合格产品才能包装入库或进入其他产品生产程序。

实施例6、含解淀粉芽孢杆菌复合鸡粪腐熟发酵剂的应用方案中翻抛次数确定

本试验旨在确定含解淀粉芽孢杆菌复合鸡粪腐熟发酵剂的应用方案中最适合的翻抛次数。本发明所述含解淀粉芽孢杆菌复合鸡粪腐熟发酵剂，以1％的质量比例，接种于含水量50％的鸡粪为主料、蘑菇棒为辅料的复合有机物料中，主料：辅料质量比＝6:4。采用链板式翻抛机将所有物料在发酵池内混合均匀，采用槽式好氧深层发酵工艺进行发酵，发酵时间为15d。试验组1在发酵过程中不翻抛，试验组2在发酵过程中5天翻抛一次，试验组3在发酵过程中3天翻抛一次，试验组4在发酵过程中1天翻抛一次。发酵结束后，根据国标GB/T19524.1—2004肥料中粪大肠菌群的测定确定鸡粪中粪大肠菌群数量。利于水银温度计分别测定发酵15cm、45cm、75cm不同位置的发酵温度，取平均值。每个处理3个重复，并应用SPSS软件对数据进行差异性分析。

图6显示了鸡粪腐熟发酵过程中翻抛次数对发酵平均温度与粪大肠菌群数量的影响，说明翻抛次数显著影响了发酵温度，继而影响了粪大肠菌群等有害菌的数量。若不翻抛，则菌量非常高，发酵温度也很难升上来，主要是因为解淀粉芽孢杆菌为典型好氧菌，在没有氧气供应时，菌量很难增值，也难以产生大量ATP与发酵底物温度提升，相应的粪大肠菌群液现在高于其他实验组(p<0.05)。随着翻抛频率的增加，发酵平均温度也是逐渐升高，但3天一次与1天一次两种翻抛频率间发酵平均温度与粪大肠菌群的数量无显著差异(p>0.05)，但也明显显示并非翻抛越频繁越好，过多的翻抛不利于热量的累积与温度的持续提升。结果表明，3天一次，是比较合适的翻抛频率，此模式下发酵平均温度最高，且粪大肠菌群数量最低。

实施例7、含解淀粉芽孢杆菌复合鸡粪腐熟发酵剂应用后氨氮、粪大肠菌群与解淀粉芽孢杆菌HFJ-7含量变化

本发明所述含解淀粉芽孢杆菌复合鸡粪腐熟发酵剂，以占有机物料1％的质量比例，接种于以鸡粪为主料、蘑菇棒为辅料的含水量50％的复合有机物料中，主料：辅料质量比＝6:4。采用链板式翻抛机将所有物料在发酵池内混合均匀，采用槽式好氧深层发酵工艺进行发酵，发酵时间为15d，每3天翻抛一次。鸡粪发酵腐熟前与发酵腐熟后，分别根据国标GB/T 19524.1-2004肥料中粪大肠菌群的测定确定鸡粪中粪大肠菌群数量，技术有害菌杀菌率。根据CJT 51-2004城市污水水质检验方法标准-纳氏试剂分光光度法，测定氨氮含量，计算氨氮去除率。根据参考国标GBT 26428-2010饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测，测定解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的数量。每个处理3个重复，并应用SPSS软件对数据进行差异性分析。

表2显示了鸡粪腐熟发酵前后氨氮、粪大肠菌群与解淀粉芽孢杆菌HFJ-7含量的变化，图7显示了在同一稀释梯度下腐熟前与腐熟后的粪大肠菌群数量，其中图7A表示鸡粪腐熟前大肠杆菌菌量，图7B表示腐熟后大肠杆菌菌量，两者均说明含解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的复合鸡粪腐熟发酵剂的使用，可去除鸡粪中86.79％的氨氮，并杀灭超过99.99％的粪大肠菌群，并实现解淀粉芽孢杆菌HFJ-7高达1307.5倍的增殖，所有指标在鸡粪发酵腐熟前后，均达到极其显著差异(p<0.01)。结果表明，在合适发酵条件下，经本发明所述含解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的复合鸡粪腐熟发酵剂处理后，鸡粪中解淀粉芽孢杆菌的含量不低于5×10⁹CFU/g。

表2.鸡粪腐熟发酵前后氨氮、粪大肠菌群与解淀粉芽孢杆菌HFJ-7含量变化

实施例8、含解淀粉芽孢杆菌复合鸡粪腐熟发酵剂发酵鸡粪对油菜种子发芽指数影响

本发明所述含解淀粉芽孢杆菌复合鸡粪腐熟发酵剂，以1％的质量比例，接种于以鸡粪为主料、蘑菇棒为辅料的含水量50％的复合有机物料中，主料：辅料质量比＝6:4。采用链板式翻抛机将所有物料在发酵池内混合均匀，采用槽式好氧深层发酵工艺进行发酵，发酵时间为15d，每3天翻抛一次。鸡粪发酵腐熟前与发酵腐熟后，分别采用油菜种子的发芽过程，测定发芽指数G1。分别取10g腐熟前与腐熟后鸡粪，加90ml灭菌蒸馏水，稀释并在磁力搅拌器上常温下搅拌1h，4000rpm离心10min，收集滤液备用。90cm平皿内放一层滤纸，130℃干热灭菌4h；加3ml上述滤液于滤纸上，均匀摆放20粒油菜种子，25℃避光培养，48h后测定发芽率与总根长；以等量的灭菌蒸馏水为对照。发芽指数计算公式：以加水组为对照，GI＝100％*(处理组发芽率×种子总根长)/(对照组发芽率×种子总根长)。每个处理3个重复，并应用SPSS软件对数据进行差异性分析。

图8显示了鸡粪腐熟发酵前后油菜种子发芽指数的变化，其中8A表明使用腐熟前的鸡粪试验组，油菜的种子发芽指数为(2.34±0.11)％，8B表明使用腐熟后的鸡粪试验组，油菜的种子发芽指数为(91.15±3.64)％，说明本发明所述含有解淀粉芽孢杆菌的腐熟剂，可很好地腐熟发酵鸡粪，有效消除了影响发芽的不良成分，可极其显著地提高种子发芽指数(p<0.01)。

实施例9、含解淀粉芽孢杆菌复合鸡粪腐熟发酵剂发酵鸡粪对椒苗定植成功率影响

本发明所述含解淀粉芽孢杆菌复合鸡粪腐熟发酵剂，以1％的质量比例，接种于以鸡粪为主料、蘑菇棒为辅料的含水量50％的复合有机物料中，主料：辅料质量比＝6:4。采用链板式翻抛机将所有物料在发酵池内混合均匀，采用槽式好氧深层发酵工艺进行发酵，发酵时间为15d，每3天翻抛一次。鸡粪发酵腐熟前与发酵腐熟后，用作辣椒苗定植时的底肥，在寿光市16个辣椒蔬菜大棚进行试验，统计辣椒苗定植时的存活情况与辣椒苗状态。

图9表明了腐熟前后鸡粪用作底肥时的辣椒苗定植成功率，其中9A表示使用腐熟前的鸡粪作为底肥，辣椒苗多出现萎蔫、死棵等现象，定植成功率仅为35％-45％，9B表示使用本发明所述鸡粪腐熟剂腐熟后的鸡粪作为底肥，辣椒苗健康生长，茎杆粗壮，定植成功率高达86％-94％。辣椒苗在不同的鸡粪底肥的定植情况，也说明本发明所述含解淀粉芽孢杆菌的鸡粪腐熟剂，有利于消除氨氮、粪大肠菌群有害菌等不良影响，为植物的定植奠定了环境渗透压方面、卫生方面的环境，也有利于有机养分释放与植物的吸收与利用。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种含有解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的复合鸡粪腐熟发酵剂，其特征在于它由以下组分组成：以稻壳粉为复配载体，还包括以下组分：含菌量为4×10⁸CFU/g~4.4×10⁸ CFU/g的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7，酶活为900U/g~1000 U/g的中性纤维素酶，酶活为200U/g~250U/g 的中性木聚糖酶和酶活为80U/g~100U/g的耐高温脂肪酶；所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7经分子鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号是CGMCC No. 10011；所述解淀粉芽孢杆菌HFJ-7选用含菌量为2000×10⁸CFU/g--2200×10⁸CFU/g的解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉；中性纤维素酶选用酶活为45000U/g~50000 U/g的中性纤维素酶原酶粉；中性木聚糖酶选用酶活为100000U/g~125000 U/g的中性木聚糖酶原酶粉；耐高温脂肪酶选用酶活为40000U/g~50000 U/g的耐高温脂肪酶原酶粉。

2.根据权利要求1所述的含有解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的复合鸡粪腐熟发酵剂，其特征在于：所述鸡粪腐熟发酵剂组成成分的质量比例为：解淀粉芽孢杆菌HFJ-7菌粉：中性纤维素酶原酶粉：中性木聚糖酶原酶粉：耐高温脂肪酶原酶粉：稻壳粉=1:10:1:1:500，混合均匀。

3.权利要求1所述的含有解淀粉芽孢杆菌HFJ-7的复合鸡粪腐熟发酵剂在发酵鸡粪中的应用，其特征在于：所述鸡粪腐熟发酵剂以占物料1%的质量比例接种于含水量50%-55%的复合有机物料中，所述复合有机物料的主料为鸡粪、辅料为蘑菇棒，主料：辅料质量比=6:4，混合均匀，进行好氧发酵；所述好氧发酵的时间为15d，每3天翻抛一次。

4.根据权利要求3所述的复合鸡粪腐熟发酵剂在发酵鸡粪中的应用，其特征在于：所述腐熟发酵剂接种于鸡粪发酵后，能显著杀灭鸡粪中的粪大肠菌群，降低氨氮含量。

5.根据权利要求3所述的复合鸡粪腐熟发酵剂在发酵鸡粪中的应用，其特征在于：所述发酵剂接种于鸡粪发酵后获得的腐熟后鸡粪，能显著提高油菜种子发芽指数，防止烧苗现象。

6.根据权利要求3所述的复合鸡粪腐熟发酵剂在发酵鸡粪中的应用，其特征在于：所述发酵剂接种于鸡粪发酵后获得的腐熟后鸡粪，用做幼苗定植底肥，能显著提高辣椒苗定植成功率。