CN103173396B - 鼠乳杆菌qt-0304菌株及其菌株发酵液和其在防治植物病原菌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术农业生产领域，尤其涉及一株鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）QT-0304菌株及其菌株发酵液和其在防治植物病原菌中的应用。鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）QT-0304菌株，该菌株的保藏编号为；CCTCC NO：M2012557，保藏地为：中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏日为：2012年12月30日。本发明的鼠乳杆菌QT-0304菌株经发酵能够产生对植物病原真菌如水稻纹枯病菌等植物病原真菌有拮抗作用的活性物质，进一步开发可以作为生物农药，是农业生产上重要的微生物资源。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术农业生产领域，尤其涉及一株鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）QT-0304菌株及其菌株发酵液和其在防治植物病原菌中的应用。
背景技术
水稻纹枯病（Rhizoctonia solani Kühn）又称“花秆”、“烂脚病”，分布于亚洲、非洲和美洲等稻区，在我国华南及长江流域地区发生严重。植株发病后叶片枯死，结实率下降，一般减产10%～30%，严重时达到50%以上。我国防治该病主要采用井岗霉素，近年来由于井岗霉素大面积长期使用，防效日趋降低，国内外主要水稻区普遍开展了水稻纹枯病的生防研究工作。
根际是植物—土壤一微生物及其环境条件相互作用的场所和特殊微生态环境，是指植物的根表以及受根系直接影响的几毫米的微小的土壤区域，也是土壤微生物生活特别旺盛的区域；根际微生物在植物养分持续供给、促进根系生长、改善土肥力、有害生物综合防治及土壤保持中起着举足轻重的作用。如根际微生物分泌的抗生素类物质，有助于植物避免病原菌的侵染。利用土壤根际有益微生物资源进行植物病害综合防治，因其对环境无污染而呈现出良好的研究与发展前景。
根际土壤中拮抗微生物数量及其所占的比例是植物染病的关键因素之一。因此，从根际土壤中筛选拮抗细菌，再将其发酵培养增殖后回施土壤，可取得对病原菌的有效治理。
乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群；乳杆菌属是乳酸菌中一类，属于益生菌，广泛分布于动物消化道、蔬菜和食品等生境。
利用拮抗菌防治水稻纹枯病已经取得了一些进展，有报道称木霉、青霉、芽孢杆菌以及放线菌等的一些种对水稻纹枯病菌均有一定的拮抗作用；但在已报道的对水稻纹枯病菌具有拮抗作用的众多的生防微生物，乳杆菌属（Lactobacillus）尚未见有报道。
发明内容
针对化学农药不安全与微生物源农药种类较少的问题，本发明的第一个目的是的提供一株鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）QT-0304菌株，本发明的第二个目的是的提供上述的鼠乳杆菌QT-0304菌株的菌株发酵液，本发明的第三个目的是的提供一种制备上述的菌株发酵液的方法，本发明的第四个目的是的提供上述的鼠乳杆菌QT-0304菌株的菌株及其发酵液在在防治植物病原菌中的应用。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）QT-0304菌株，该菌株的保藏编号为；CCTCC NO:M2012557，保藏地为：中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏日为：2012年12月30日。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种菌株发酵液，该发酵液由所述的鼠乳杆菌QT-0304菌株通过利用有机碳源和氮源发酵制备得到。
作为优选，所述的有机碳源选自葡萄糖、甘露糖、甘露醇、乳糖、半乳糖和麦芽糖中的一种或多种。
作为优选，所述的氮源选自胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉浸膏和硝酸钾中的一种或多种。
为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种制备菌株发酵液的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：
1）取保存于-20℃的甘油鼠乳杆菌QT-0304菌株涂布到含牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板上，28℃培养24h后挑单菌落接到100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于28℃，180r/min摇床中培养12h，OD600≈0.6，活化；
2）取10mL转接于牛肉膏蛋白胨液体培养基，置于28℃，180r/min摇床中培养5h，OD600≈0.6，作种子液；
3）再以10%的接种量接入液体发酵培养基，在温度28℃，摇床速度220r/min，起始pH为7.2的条件下培养48h；
4）离心即可得到约为80g/L的湿菌体，取1g菌体与40mL无菌水混匀，进行超声波破碎，破碎功率为600W，工作5s，间歇10s，破碎1h，获得鼠乳杆菌QT-0304菌株发酵液。
作为优选，各个培养基的组分如下：
牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl5g/L、琼脂20g/L，pH7.0-7.2；
牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl5g/L，pH7.0-7.2；
PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH6.0-7.5。
为了实现上述的第四个目的，本发明采用了以下的技术方案：
上述的鼠乳杆菌QT-0304菌株或该菌株的发酵液用于防治植物病原菌的方法。作为优选，所述的植物病原菌为水稻纹枯病菌、苹果腐烂病病菌、杨树溃疡病菌、小麦赤霉病菌、番茄早疫病菌、烟草赤星病菌或苦瓜枯萎病菌。
本发明另外还提供了一种防治植物病原菌的生物农药，该生物农药中包括权利要求1所述的鼠乳杆菌QT-0304菌株或该菌株的发酵液。作为优选，所述的植物病原菌为水稻纹枯病菌、苹果腐烂病病菌、杨树溃疡病菌、小麦赤霉病菌、番茄早疫病菌、烟草赤星病菌或苦瓜枯萎病菌。
本发明针对化学农药不安全与微生物源农药种类较少的问题，提供一株从水稻田水稻植株根际土壤样品中分离筛选出能拮抗水稻纹枯病病菌的鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）QT-0304菌株，通过对该拮抗菌株的进一步研究，鼠乳杆菌QT-0304菌株经发酵能够产生对植物病原真菌如水稻纹枯病菌等植物病原真菌有拮抗作用的活性物质，进一步开发可以作为生物农药，是农业生产上重要的微生物资源。
附图说明
图1鼠乳杆菌QT-0304菌株的菌落形态。
图2鼠乳杆菌QT-0304菌株的菌体形态（X1000）。
图3鼠乳杆菌QT-0304菌株的菌体周生鞭毛（X1500）。
图4基于16s rDNA基因序列建立的乳杆菌属系统发育树。
图5鼠乳杆菌QT-0304菌体对水稻纹枯病菌抑制效果，1为QT-0304菌体，2为水稻纹枯病菌。
图6鼠乳杆菌QT-0304菌株菌体破碎后对水稻纹枯病菌抑制效果，1，3QT-0304菌株破碎菌体悬浮液，2，4对照无菌水。
图7鼠乳杆菌QT-0304菌株对苹果腐烂病菌的抑制效果，1为QT-0304菌体，2为苹果腐烂病菌。
图8鼠乳杆菌QT-0304菌株对杨树溃疡病菌的抑制效果，1为QT-0304菌体，2为杨树溃疡病菌。
图9鼠乳杆菌QT-0304菌株对小麦赤霉病菌的抑制效果，1为QT-0304菌体，2为小麦赤霉病菌。
图10鼠乳杆菌QT-0304菌株对苦瓜枯萎病菌的抑制效果，1为QT-0304菌体，2为苦瓜枯萎病菌。
生物材料保藏说明
鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）QT-0304菌株，该菌株的保藏编号为；CCTCC NO:M2012557，保藏地为：中国典型培养物保藏中心（CCTCC），藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏日为：2012年12月30日。
具体实施方式
实施例1
拮抗水稻纹枯病菌的鼠乳杆菌QT-0304菌株的分离筛选和鉴定。
（一）培养基
牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl5g/L、琼脂20g/L，pH7.0-7.2；
牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl5g/L，pH7.0-7.2；
PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH6.0-7.5。
（二）方法
本发明的QT-0304菌株分离筛选自浙江省金华市郊水稻田采集的水稻根际土壤，采用梯度稀释分离法。取土样1.0g，加9mL无菌水稀释，进行10-1～10-6梯度稀释，取10-5稀释液100μL涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，28℃培养24h。挑取细菌单菌落，进行分离、纯化；进一步纯化菌株采用划线法，所得纯菌株置-20℃冰箱中保存，备用。
用对峙培养法对所获的纯菌株进行拮抗水稻纹枯病菌活性的筛选，经初筛和复筛后获一株编号为QT-0304高拮抗纹枯病菌的细菌菌株（附图5）。
对QT-0304菌株进行形态学、生理生化和16S r DNA序列鉴定。
菌株形态特征：菌落扁平呈白色，不透明，无光泽，表面有褶皱，边缘无规则（附图1）；菌体呈杆状（附图2），革兰氏染色为阳性，周生鞭毛（附图3），无芽孢；
菌株生理生化特征：淀粉水解实验、VP反应、硫化氢试验、柠檬酸试验均呈阳性，吲哚试验呈阴性；菌株生长温度范围为15℃～60℃，最适温度为28℃。最适生长pH为7.0；菌株能利用的碳源有葡萄糖、甘露糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖、半乳糖等；能利用的氮源有胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉浸膏和硝酸钾等。菌株能在3%、5%、7%NaCl的盐浓度下生长，在NaCl浓度为10%时生长受抑制。
16S rDNA基因序列：16S rDNA基因测序分析结果表明，其碱基序列全长为1466bp，运用在线Blast软件进行同源性分析，选取14株乳杆菌属的菌株构建系统发育树（附图4）。由图4显示，QT-0304菌株与鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）在进化树的同一支上，两菌株同源性最高达99%。结合菌株形态特征、生理生化特征，鉴定该菌株为鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）。
实施例2
对水稻纹枯病菌具有拮抗作用的鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）QT-0304菌株发酵液的制备方法。
（一）菌株：QT-0304菌株。
（二）方法
取保存于-20℃的甘油菌20μL涂布到含牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板上，28℃培养24h后挑单菌落接到100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于28℃，180r/min摇床中培养12h（OD600≈0.6）活化，取10mL转接于牛肉膏蛋白胨液体培养基（100mL），相同条件培养5h（OD600≈0.6）作种子液；再以10%的接种量接入液体发酵培养基，在温度28℃，摇床速度220r/min，起始pH为7.2的条件下培养48h。离心即可得到约为80g/L的湿菌体，取1g菌体与40mL无菌水混匀，进行超声波破碎，破碎功率为600W，工作5s，间歇10s，破碎1h，取200μL以牛津杯法测定抑菌效果，获得最大抑菌圈直径为约20mm（附图6）。
实施例3
鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）QT-0304菌株对其它植物病原真菌的抑制作用。
（一）供试植物病原真菌：
苹果腐烂病病菌（Valsa mali）、杨树溃疡病菌（Botryosphaeria ribis）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、烟草赤星病菌（Alternariaalternata）、苦瓜枯萎病菌[尖镰孢菌苦瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp.momordicae）]。
（二）培养基：
牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基。
（三）方法
将QT-0304菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上28℃培养24h活化备用；将上述6种供试植物病原菌在PDA培养基上培养5d活化，用打孔器（Φ5mm）制成菌饼备用。
平板对峙法测定：采用琼脂块移取法进行实验，即在PDA平板上过圆心画一条直径，在两端五分之一处分别接入备用的QT-0304菌株和各种病原菌菌饼，每个处理重复三次，设一个对照。28℃培养箱培养，1W后测量抑菌圈大小和拮抗带宽度。拮抗带宽度按照下式计算：
式中，A为抑菌圈的最大直径（mm），B为抑菌圈的最小直径（mm），C为QT-0304菌株的菌落直径（mm）。
（四）结果
实验结果显示QT-0304菌株对苹果腐烂病菌（V.mali）、杨树溃疡病病菌（B.ribis）等都有较好的抑制作用，其中对苹果腐烂病菌（V.mali）的抑制作用较强（图7），拮抗带宽达34.5mm，抑菌圈内有黄绿色物质产生；对杨树溃疡病菌（B.ribis）的拮抗带宽为23.0mm（图8）；对小麦赤霉病菌（图9）和苦瓜枯萎病菌（图10）的拮抗带宽均在10mm左右（见表1）。
表1 QT-0304菌株对其它植物病原真菌抑制作用的测定结果
| 植物病原真菌 | 最大直径/mm | 最小直径/mm | 菌落直径/mm | 拮抗带宽/mm |
| 苹果腐烂病菌 | 48 | 41 | 10 | 34.5 |
| 杨树溃疡病菌 | 37 | 35 | 13 | 23.0 |
| 小麦赤霉病菌 | 32 | 30 | 20 | 11.0 |
| 番茄早疫病菌 | 25 | 20 | 18 | 4.5 |
| 烟草赤星病菌 | 26 | 24 | 22 | 3.0 |
| 苦瓜枯萎病菌 | 35 | 30 | 20 | 12.5 |
Claims (8)
1.鼠乳杆菌（Lactobacillus murinus）QT-0304菌株，该菌株的保藏编号为；CCTCC M 2012557，保藏地为：中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏日为：2012年12月30日。
2.一种菌株发酵液，其特征在于：该发酵液由权利要求1 所述的鼠乳杆菌QT-0304菌株通过利用有机碳源和氮源发酵制备得到。
3.根据权利要求2所述的一种菌株发酵液，其特征在于：有机碳源选自葡萄糖、甘露糖、甘露醇、乳糖、半乳糖和麦芽糖中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的一种菌株发酵液，其特征在于：氮源选自胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉浸膏和硝酸钾中的一种或多种。
5.一种制备权利要求2所述的菌株发酵液的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：
1）取保存于-20℃的甘油鼠乳杆菌QT-0304菌株涂布到含牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板上，28℃培养24 h后挑单菌落接到100 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于28℃，180 r/min摇床中培养12 h，OD600≈0.6，活化；
2）取10 mL转接于牛肉膏蛋白胨液体培养基，置于28℃，180 r/min摇床中培养5 h，OD600≈0.6，作种子液；
3）再以10 %的接种量接入PDA培养基，在温度28℃，摇床速度220 r/min，起始pH为7.2的条件下培养48 h；
4）离心即可得到约为80 g/L的湿菌体，取1 g菌体与40 mL无菌水混匀，进行超声波破碎，破碎功率为600 W，工作5 s，间歇10 s，破碎1 h，获得鼠乳杆菌QT-0304菌株发酵液；
所述的牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、琼脂20 g/L，pH 7.0-7.2；
所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L，pH 7.0-7.2；
所述的PDA培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，pH 6.0-7.5。
6.权利要求1 所述的鼠乳杆菌QT-0304菌株或权利要求2所述的一种菌株发酵液用于防治植物病原菌的方法；所述的植物病原菌为水稻纹枯病菌、苹果腐烂病病菌、杨树溃疡病菌、小麦赤霉病菌、番茄早疫病菌、烟草赤星病菌或苦瓜枯萎病菌。
7.一种防治植物病原菌的生物农药，其特征在于：该生物农药中包括权利要求1 所述的鼠乳杆菌QT-0304菌株或权利要求2所述的一种菌株发酵液。
8.根据权利要求7所述的一种防治植物病原菌的生物农药，其特征在于：所述的植物病原菌为水稻纹枯病菌、苹果腐烂病病菌、杨树溃疡病菌、小麦赤霉病菌、番茄早疫病菌、烟草赤星病菌或苦瓜枯萎病菌。
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