CN102719383B

CN102719383B - 一种解淀粉芽孢杆菌及其菌剂和应用

Info

Publication number: CN102719383B
Application number: CN201210219470.8A
Authority: CN
Inventors: 缪礼鸿; 高素芹; 于靓; 许波; 曾驰
Original assignee: Wuhan Polytechnic University
Current assignee: Wuhan Polytechnic University
Priority date: 2012-06-29
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2032-06-29
Also published as: CN102719383A

Abstract

本发明提供了一种既可抑制有害藻，又可促有益藻生长的解淀粉芽孢杆菌菌株，该菌株还可降低水体中的氨氮和亚硝酸盐等有害物含量。本发明还提供了制备解淀粉芽孢杆菌菌剂的方法。本发明提供的淀粉芽孢杆菌及其微生物菌剂可防治微囊藻水华、修复养殖水体生态，并可应用在发酵生产水产动物饲料中。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌及其菌剂和应用

技术领域

本发明属于农用与环保境微生物菌剂领域，具体地说涉及一种解淀粉芽孢杆菌，以及利用该解淀粉芽孢杆菌生产的微生物菌剂、制备方法和应用。

背景技术

天然湖泊和人工养殖水体的富营养化已成为我国目前及今后相当长一段时期内的重大水环境问题。我国除了滇池、太湖和巢湖三大淡水湖泊已发生严重的蓝藻水华危害外，长江中下游的许多湖泊和水库也都相继发生蓝藻水华污染现象并检测到藻毒素的存在。由于片面追求水库和鱼塘渔业的产量，大量施肥和投饵所带来的过量外源氮、磷等营养元素已导致水体的严重富营养化，许多水库有害蓝藻频发，对水产养殖业造成了重大经济损失。微囊藻属Microcystis是蓝藻（蓝细菌）中一个很重要的类群,因其在世界各地产生严重的水华并形成藻毒素，直接影响水生态环境的安全，该属的铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）是许多湖泊和水库发生富营养化时的优势藻种和主要产毒株。（Sivonen,K.Cyanobacterial toxins and toxin production.Phycologia,1996,35：12–24；闫海，潘纲，张明明.微囊藻毒素研究进展，生态学报，2002，22（11）：1968-1975.）

目前，藻类的控制及治理技术主要分为物理法、化学法和生物法三种。传统的物理除藻方法虽然有一定效果且无污染，但需要投入大量的人力物力，且治标不治本。采用化学药剂除藻，硫酸铜是治理蓝藻水华和赤潮中常用的化学药品，但是硫酸铜容易造成局部浓度过高而对生态环境产生不利的影响，且不可避免地造成二次环境污染，滥用化学除藻剂等已对水产品的安全构成严重威胁。与传统的机械除藻和施用化学除藻剂等方法相比，微生物控藻技术因具有成本低和环境安全性好等方面突出优势而受到国内外的广泛关注。现已发现多种溶藻细菌、蓝藻嗜菌体和真菌能裂解藻类营养细胞或破坏细胞。有人从水华铜绿微囊藻中分离出一种类似噬菌体的藻类病毒，该病毒能够感染铜绿微囊藻的细胞并使藻细胞溶解（Manage P M,Kawabata Z,Akano S N.Dynamics of cyanophage-like particlesand algicidal bacteria causing Microcystis aeruginosa mortality.Limnology，2001,2(2)：73-78.）。马宏瑞等分离出具有溶藻作用的芽孢杆菌Z5，其无菌滤液对处于稳定期的铜绿微囊藻的去除效果达到91.36％（马宏瑞，章欣，王晓蓉等.芽孢杆菌Z5溶铜绿微囊藻特性研究。中国环境科学,201l，31(5)：828～833.）李雪梅等将EM应用于藻型富营养化的湖泊水体中,结果表明有效微生物群对水体的透明度、叶绿素a含量的改善有明显的效果,水中的溶解氧含量和水体的透明度上升(李雪梅,杨中艺,简曙光等.有效微生物群控制富营养化湖泊蓝藻的效应.中山大学学报(自然科学版),2000,39(1)：81-85.)；王平等考察了有效微生物群(EM)对3种常见“水华”藻类生长的抑制作用及适宜条件，实验结果表明EM能显著抑制衣藻、四尾栅裂藻和盘星藻的生长,3种藻类生物量平均降低率分别46.80%、99.07%和97.17%(王平,吴晓芙,李科林等.有效微生物群(EM)抑藻效应研究.环境科学研究,2004,17(3)：34-38)。

芽孢杆菌被认为兼有改善水生动物消化道和改良水环境的双重功效而受重视（吴希阳等，芽胞杆菌益生菌在水产业的应用，渔业现代化，2007，4）。吕乐等对投加由芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌、放线菌和沼泽红假单胞菌组成的环境有效微生物菌剂（EM菌剂）治理蓝藻水华污染的效果进行了研究。实验结果表明，与对照相比，投加千分之一比例的EM菌剂不仅可以快速降低蓝藻数量，使蓝藻生物量减少55%以上，而且能够迅速降低水体中的氨氮、亚硝酸氮、总氮和磷酸盐浓度并维持在较低水平波动，从而降低了形成蓝藻水华所需要的氮和磷营养元素（吕乐等，环境科学与技术，2010，8）。解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，近年对解淀粉芽孢杆菌的研究与探索越来越多，由于其自身具有广泛地抑制真菌与细菌的能力，因而成为具有生物农药开发潜力的微生物。王英国等从堆肥中分离到1株解淀粉芽孢杆菌，其对于尖孢镰刀菌、草莓蛇病菌等植物病原真菌均有很强的抑制作用（王英国等，中国生物工程杂志，2007，12）。Chen L等报道了从深海沉积物中分离获得B.amyloliquefaciens SH-B10菌株能够产生2种抗真菌的脂肽化合物，对5种植物病原真菌具有显著抑制作用（Chen L等，Bioresour Technol.2010）。

利用溶藻细菌控制蓝藻水化的研究，最早由日本研究者报道分离到具有溶藻作用的腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)（Nakamura N,et al.,Water Sci Technol.2002；Nobuyukinakamura,et al.,J.Bioscience and Bioengineering,2003），但该菌株存在安全性问题，在我国微生物肥料生物安全分级目录中属于第三级的需要做致病性试验的菌种，不宜作为微生态菌剂的生产菌株（微生物肥料生物安全通用技术准则NY1109-2006）。Ahn CY等报道B.subtilis C1在肉汤培养基上能产生一种生物表面活性物质，对水华藻铜绿微囊藻的去除率达85%（Ahn CY等Biotechnol Lett.2003）。卢兰兰等分离获得一株溶藻细菌DC-L5，通过形态及16S rDNA测序分析鉴定为短小芽孢杆（卢兰兰等，水生生物学报，2009）。解淀粉芽孢杆菌在自然界广泛分布，可通过分泌抗生素、抗菌蛋白或多肽类物质起到生物防治作用。李超等报道了一株解淀粉芽孢杆菌DC1，对水华鱼腥藻具有高效抑藻效果(李超等，环境科学学报,2011,31(8))。中国专利ZL200910070709.8公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其在水产养殖上的应用，菌株CGMCC3261使养殖水体中的硝态氮、亚硝态氮、COD等含量降低，可规模化生产用于改善水产养殖环境，但未见该菌种具溶藻效果的报道。中国专利ZL201010614948.8也公开了一种解淀粉芽孢杆菌，菌株CGMCC4516对水华鱼腥藻的抑制率最高仅达95.54%，溶藻效果一般且未见该菌种有使水体中的硝态氮、亚硝态氮、COD下降报道。水华鱼腥藻（Anabaenaflosaquae）为一种多细胞丝状蓝藻，而铜绿微囊藻为一种单细胞球状蓝藻，它们为不同属的蓝藻。更重要的是，目前尚未见解淀粉芽孢杆菌既对铜绿微囊藻等有害藻类有抑制作用，同时又对有益藻种小球藻具有促进作用的报道。

发明技术内容：

本发明的一个目的是提供一种既可抑制有害藻，又可促有益藻生长并可降低水体中的氨氮和亚硝酸盐等含量的解淀粉芽孢杆菌菌株。

本发明的另一个目的是提供含有解淀粉芽孢杆菌菌株的微生物菌剂及其制备方法。

本发明的再一个目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌及其微生物菌剂在防治微囊藻水华上的应用。

本发明的再一个目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌及其微生物菌剂在发酵生产水产动物饲料中的应用。

本发明的再一个目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌及其微生物菌剂在养殖水体生态修复上的应用。

本发明公开了一株新的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于,该菌株为解淀粉芽孢杆菌T1（Bacillus amyloliquefaciens T1），保藏于国家知识产权局指定的保藏机构-中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2012184，保藏日期是2012年5月28日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话：027-68752319，Email：cctccwhu.edu.cn。解淀粉芽孢杆菌T1株是从武汉市东西湖区农田土壤中分离经筛选获得。该菌株有如下特征：解淀粉芽孢杆菌T1可产抑制铜绿微囊藻的活性物质，其发酵液对铜绿微囊藻的抑制率达98.8%，无菌过滤液对铜绿微囊藻的抑制率达100%，同时T1菌株发酵液对小球藻具有明显的促生作用，促生率达78.1%。由T1菌株经发酵制备的液体菌剂对水体中氨氮和亚硝酸盐的去除率分别达到53.7%和65.6%。即解淀粉芽孢杆菌T1株具有较强的抑制有害蓝藻铜绿微囊藻的生长并促进有益藻种小球藻的生长的能力，对水体中有害物质氨氮和亚硝酸盐的去除效果较好。

解淀粉芽孢杆菌T1株形态特征是：菌落淡黄色、形状为规则圆形、表面隆起、干燥。细胞为杆状，产芽孢。

解淀粉芽孢杆菌T1株生化特征是：可利用葡萄糖，蔗糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、淀粉、乳糖、柠檬酸三钠；不能利用甘油。能在含7%NaCl的牛肉膏蛋白胨培养基中生长。

解淀粉芽孢杆菌T1株生长特征是：牛肉膏蛋白胨平板上划线接种，分别在37℃至45℃下培养均生长良好，在50℃下能够生长。

解淀粉芽孢杆菌T1株16S rDNA基因序列分析显示：解淀粉芽孢杆菌T1株与Bacillus amyloliquefaciens DSM7菌株的同源性大于99%。

本发明还公开了一种含解淀粉芽孢杆菌T1的菌剂，该菌剂组合物主要成份是解淀粉芽孢杆菌T1株及其胞外产物和发酵基质。

本发明的还公开了解淀粉芽孢杆菌T1及其微生物菌剂在防治微囊藻水华上的应用。

本发明的还公开了解淀粉芽孢杆菌T1及其微生物菌剂在发酵生产水产动物饲料中的应用。

本发明的还公开了解淀粉芽孢杆菌T1及其微生物菌剂在养殖水体生态修复上的应用。

在本发明中采用的参比菌株均为普通微生物菌种，其中解淀粉芽孢杆菌ACCC10225，枯草芽孢杆菌CICC10071分别登载于中国农业微生物菌种保藏管理中心和中国工业微生物菌种保藏管理中心目录中，处于公开状态，科学工作者可向该菌种保藏中心索取。铜绿微囊藻为FACHB905和蛋白核小球藻405均来源于中国科学院水生生物研究所藻种保藏中心（FACHB），可公开索取。

本发明公开的益生菌剂为液态或固态。优先的，本发明公开的T1芽孢杆菌菌剂为固态。

本发明还公开了制备固态菌剂的方法，包括如下步骤：

（1）T1菌种活化：用接种环挑取一环T1菌种接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，置37℃恒温培养箱中培养20-24h。

（2）种子液的制备：挑取一环经活化的T1菌株接入装有100mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180r/min摇床培养24h备用。

（3）固体发酵培养基制备：按玉米粉20%，麸皮20%，米糠40%，菜籽粕20%，料：水=1：1，pH自然，混合均匀，配制成固体发酵培养基，并分装于耐高温的塑料方盒中，120℃灭菌30min后冷却待用。

（4）固体菌剂培养：按5-10%接种量接入预先培养好的T1种子液至固体发酵培养基中，混合均匀后置37℃，湿度为85%的恒温恒湿培养箱中培养2天，每12h搅拌一次。

（5）干燥及粉碎：将上述发酵完毕的T1固体培养物置于55℃烘箱中烘至含水率低于10%，用万能粉碎机将干燥的培养物粉碎、过100目筛后，制备成固体粉末状菌剂并装入密封的塑料袋中，放置干燥、阴凉处或冰箱保鲜层中保藏。

（6）采用稀释平板测数法检测样品中T1芽孢杆菌的活菌数达100-200亿cfu/克。

本发明还公开了制备液态菌剂的方法，包括如下步骤：

（1）T1菌种活化：用接种环挑取一环T1菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，在恒温培养箱中37℃培养20h。

（2）种子液的制备：挑取一环经活化的T1菌株接入装有100mL的牛肉膏蛋白胨三角瓶液体培养基中，37℃180r/min摇床培养24h备用。

（3）液体发酵培养基制备：按蔗糖4%，酵母膏2%，蛋白胨1%,KH₂PO₄0.05%,MgSO₄0.02%，pH6.5～7.0配制成液体培养基，120℃灭菌20min备用。

（4）液体菌剂培养：按5-10%接种量接入预先培养好的T1种子液至液体发酵培养基中，37℃、180r/min摇床培养18-24h。

（5）包装及保存：将培养好的T1菌液装入密封的塑料瓶中制备成液体菌剂，置冰箱保鲜层中保藏。

（6）活菌数的测定：采用稀释平板测数法测定样品中T1芽孢杆菌的活菌数达10-20亿cfu/mL。

本发明的优点：

1、相同培养条件下，解淀粉芽孢杆菌T1菌株对铜绿微囊藻的溶藻活性很高，其牛肉膏蛋白胨发酵液对藻细胞的抑制率达98.8%，分别比参比菌株解淀粉芽孢杆菌ACCC10225和枯草芽孢杆菌CICC10071抑藻率高35.1%和29.3%。T1菌株发酵的无菌过滤液对铜绿微囊藻的抑制率达100%，分别比参比菌株ACCC10225和CICC10071高37.7%和40.3%。远高于目前所报道的其他溶藻菌株的抑藻活性（中国专利ZL201010614948.8中菌株CGMCC4516对水华鱼腥藻的抑制率最高仅达95.54%）。同时，T1芽孢杆菌产生的抑藻活性物质具有较好的耐高温能力。添加0.1%和0.05%剂量的T1固体菌剂对微囊藻的抑制率分别达到100%和88.9%。

2、生物安全性好，解淀粉芽孢杆菌为我国微生物肥料菌种目录中第一级免作毒理学试验的菌种。

3、T1菌株发酵液可明显促进小球藻的生长，促生率78.1%。添加0.01%的T1固体菌剂对铜绿微囊藻有一定抑制作用的同时，可明显增加水体中其他类型有益藻的种类和数量，具有调控和优化水体浮游生物结构的能力。

4、T1液体菌剂对水体中氨氮和亚硝酸盐的去除率分别达到53.7%和65.6%。具有明显改善养殖水体生态环境的功能。

附图说明

图1是解淀粉芽孢杆菌T1菌株的系统发育树图

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施例

实施例1解淀粉芽孢杆菌T1菌株的分离与鉴定

1.1解淀粉芽孢杆菌T1菌株的分离：从武汉市东西湖农场采集农田土壤样品，称取土样10g，加入90ml无菌水的三角烧瓶中，振荡，使土样与水充分混合，置80℃水浴锅中处理30分钟。用微量取液器从中吸取1ml土壤悬液加入9ml试管无菌水中充分混匀，进行系列稀释，取0.1mL适当稀释度的菌悬液涂布牛肉膏蛋白胨平板，37℃恒温培养2d,挑取平板上长出的单菌落，经简单染色用显微镜观察到芽孢后，分别接种到牛肉膏蛋白胨平板上，37℃恒温培养2d,进行菌株编号，然后分别接种各芽孢杆菌菌株于牛肉膏蛋白胨液体三角瓶培养基中，置37℃，180r/min摇床上培养30h,取1ml菌液用用细菌过滤器过滤除去菌体，取0.2ml无菌滤液加至含10ml铜绿微囊藻905藻液的培养瓶中，空白对照用0.2ml无菌水代替无菌滤液。25℃光照培养5d,观察比较各芽孢杆菌菌株无菌滤液的溶藻效果。采用此方法经筛选后获得1株具有明显溶藻效果的芽孢杆菌，菌株编号为T1,其用牛肉膏蛋白胨培养的菌液的溶藻率达98.8%（表2），其牛肉膏蛋白胨发酵液的无菌滤液抑藻率高达100%(表3)。

本发明人将分离的一株新的解淀粉芽孢杆菌T1株（Bacillusamyloliquefaciens T1）保藏于国家知识产权局指定的保藏机构-中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2012184，保藏日期是2012年5月28日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话：027-68752319，Email：cctccwhu.edu.cn。1.2解淀粉芽孢杆菌T1株的鉴定：通过形态特征观察、生理生化测定及16SrDNA基因序列分析结果对T1进行鉴定。在鉴定中，本实验选择枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CICC10071、和解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensACCC10225菌株作为对照菌株。枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌为常用普通微生物菌种，分别登载于中国工业菌种保藏中心和中国农业菌种保藏中心目录，处于公开状态，科学工作者可向保藏中心索取。

1.2.1解淀粉芽孢杆菌T1株形态特征观察：菌落淡黄色、形状为规则圆形、表面隆起、干燥。细胞为杆状，产椭圆形芽孢。

1.2.2通过16S rDNA序列分析进行系统发育地位鉴定

以基因组DNA为模板作PCR扩增16S rDNA，扩增引物采用通用引物16S-27F（5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和16S-1492R（5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）。

PCR反应体系（25μL）：10×PCR缓冲液（含20mmol/L的Mg²⁺）2.5μL，引物16S-27F/16S-1492R（10μmol/L）各1μL，模板DNA（约50ng/mL）1.8/2.8μL，dNTP（10mmol/L each）0.5μL，Taq酶（5U/μL）0.2μL，双蒸水18/17μL。PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，53℃退火40s，72℃延伸60s，30个循环后，72℃延伸5min。所得PCR产物进行测序，用校正后的分离菌株的16S rDNA序列，在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索（BLAST search），以比较分离菌株与已知细菌标准菌株相应序列的相似程度。根据同源序列搜索结果，下载相关细菌菌种的16S rDNA序列，与分离菌株的序列放在一起，用ClustalX1.8软进行多序列匹配排列，通过Neighbor-Joining分析方法构建系统进化树，并进行1000次bootstrap统计学检验。

实验得到1042bp的基因序列，在Genbank核酸序列数据库中进行同源序列搜索，T1与Bacillus amyloliquefaciens DSM7的同源性超过99%，符合Kuttzman&Robnett所定的同种内不同菌株见差异不超过1%的标准。图1是根据16S rDNA序列所做的系统发育树。

1.2.3：解淀粉芽孢杆菌T1株的生理生化实验测定结果：见表1。根据16S rDNA序列分析结果和生理生化实验测定结果，参照文献报道（东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京：科学出版社,2001,267-295.）,可判断T1菌为解淀粉芽孢杆菌。

表1解淀粉芽孢杆菌T1株的生理生化实验结果

测定项目	结果	测定项目	结果
				接触酶	+	葡萄糖	+
厌氧生长	-	木糖	+
				甲基红试验	+	阿拉伯糖	+
硝酸盐还原	+	甘露醇	+
				50℃生长	+	乳糖	+
pH 5.7生长	+	甘油	-
				7%NaCl生长	+	蔗糖	+
淀粉水解	+	发酵葡萄糖产气	-
				分解酪素	+	利用柠檬酸盐	+

实例2T1菌株对微囊藻的抑制作用和对小球藻的促生作用分析

2.1不同的芽孢杆菌培养物对铜绿微囊藻905的抑藻效果比较

分别挑取一环芽孢杆菌T1、CICC10071和ACCC10225斜面菌种接种于100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃,180r/min摇床培养24h，用无菌水将三种菌液浓度稀释至10⁸个/mL，按1%接种量分别加入初浓度为2.5×10⁶个/mL的微囊藻905藻液中，置于恒温光照摇床中，在28℃,2000lux,14：10(光：暗),180r/min的条件下培养。从第3d开始，每隔24h用血球计数板法测定藻数。实验结果表明（表2），接种T1芽孢杆菌的牛肉膏蛋白胨培养液的溶藻效果明显高于解淀粉芽孢杆菌ACCC10225和枯草芽孢杆菌CICC10071。CK为添加1%无菌水替代菌液。观测比较接种后第5d的藻细胞数，在接种量相同的条件下，添加1%的T1芽孢杆菌培养液的抑藻效率分别比解淀粉芽孢杆菌ACCC10225和枯草芽孢杆菌CICC10071抑藻率高35.1%和29.3%。

表2添加1%不同芽孢杆菌菌液对微囊藻905溶藻效果比较

2.2T1芽孢杆菌对小球藻生长的促进作用

小球藻是一种鱼类可虑食性的有益藻，用该藻作指示藻种测定T1芽孢杆菌发酵液对水体中其他藻类的影响。将新鲜培养的蛋白核小球藻415稀释至含藻数1.7×10⁶个/mL。按1%接种量加入用牛肉膏蛋白胨培养基培养的T1菌液，置于恒温光照摇床中，在28℃,2000lux,14：10(光：暗),180r/min的条件下培养。每隔24h用血球计数板法测定藻数。测定结果表明，T1芽孢杆菌发酵液对小球藻的生长不仅没有抑制作用，反而具有一定的刺激生长的作用。其中接种T1菌株的牛肉膏蛋白胨发酵液对小球藻的促生作用达78.1%，分别比解淀粉芽孢杆菌ACCC10225和枯草芽孢杆菌CICC10071菌株的促进作用高10%和8%。表明T1芽孢杆菌对小球藻无任何毒害作用，而且能明显促进其生长。

2.3不同的芽孢杆菌无菌滤液对铜绿微囊藻905的影响

分别挑取一环芽孢杆菌T1、CICC10071和ACCC10225斜面菌种接种于100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃,180r/min摇床培养24h，菌液经5000r/min离心除去菌体，吸取上清液，用0.25um无菌纤维素酯微孔滤膜过滤获得无菌滤液，按1%添加量分别将3种菌株的无菌滤液加入到藻细胞初始浓度约为1.0×10⁶个/mL的铜绿微囊藻905藻液中，然后置于恒温光照摇床中，在28℃,2000lux,14：10(光：暗),180r/min的条件下培养。空白对照添加1%的无菌水替代无菌滤液，每个处理2个重复，每隔24h用血球计数板法测定藻数。结果表明（表3），与添加1%无菌水的CK相比，添加1%的枯草芽孢杆菌CICC10071和解淀粉芽孢杆菌ACCC10225无菌滤液的抑藻率只有60%左右，而添加1%T1芽孢杆菌无菌滤液的抑藻率达到100%，具有很强的溶藻活性，其抑藻率分别比菌株ACCC10225和CICC10071高37.7%和40.3%。

表3添加1%不同的芽孢杆菌无菌滤液对905A的影响

2.3高温处理T1芽孢杆菌无菌滤液对其溶藻活性的影响

挑取一环芽孢杆菌T1斜面菌种接种于100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃,180r/min摇床培养24h，菌液经5000r/min离心除去菌体，吸取上清液，用0.25um无菌纤维素酯微孔滤膜过滤获得无菌滤液，取10mLT1无菌滤液置于高压灭菌锅中经115℃高温处理30min，对照为室温放置的T1无菌滤液。按1%的添加量分别将经高温处理的T1无菌滤液和室温放置的对照滤液加入藻细胞初始浓度约为1.0×10⁶个/mL的铜绿微囊藻905藻液中，在28℃、2000lux，14：10（光：暗）恒温光照培养箱中进行光照培养，每个处理2个重复，每隔24h用血球计数板法测定藻数。实验结果表明，与不加热的对照相比，经过115℃处理30min的T1芽孢杆菌无菌滤液对铜绿微囊藻的溶藻活性没有差异，加入经高温处理和不经高温处理的T1无菌滤液,5d后的抑藻率均达100%，表明T1菌株的溶藻活性物质具有较好的耐高温度能力。

实施例3T1芽孢杆菌固体菌剂的制备方法

按照如下步骤进行：

实施例4T1芽孢杆菌固体菌剂对微囊藻的抑制效果分析

取天然湖泊水样经人工添加氮、磷营养后配制成重度富营养化的水，并接种铜绿微囊藻905，于室外自然光下培养，然后添加不同剂量的T1芽孢杆菌固体菌剂进行抑藻试验。结果表明（表4），添加0.1%和0.05%剂量的T1固体菌剂都有很明显的溶藻作用，对微囊藻的抑制率分别达到100%和88.9%，且效果稳定。而添加0.01%的T1固体菌剂的处理对微囊藻有一定的抑制作用，抑藻率达34.3%,同时，经显微镜观察发现水体中除微囊藻外的其他类型的藻的种类和数量明显增加，显示出水体中藻类的多样性增加。表明T1芽孢杆菌固体菌剂不仅可控制对鱼类有害的微囊藻的生长，还促进了可供鱼类食用的藻类生长，具有调控和改善富营养化养殖水体浮游生物的结构的功能。

表4添加不同剂量的T1固体菌剂抑藻试验效果

实施例5T1芽孢杆菌液体菌剂的制备方法

实施例6T1芽孢杆菌液体菌剂的应用效果

取天然湖泊水样经人工添加氮、磷营养后配制成重度富营养化的水，并接种铜绿微囊藻905。用无菌水将液体菌剂T1和CICC10071的菌数稀释至0.2×10₈个/mL。然后将稀释后的枯草芽孢杆菌CICC10071和T1菌剂发酵液分别按0.5%、1%的接种量接入微囊藻905藻液中，置25℃,2000Lux,14：10(光：暗)的光照培养箱中培养，每24h用血球计数板法测定藻细胞数。结果表明（表5），在接种量相同的条件下，T1的溶藻效果明显高于枯草芽孢杆菌CICC10071。

表5T1芽孢杆菌液体菌剂对藻905的抑藻效果

实施例7T1液体菌剂对水体中氨氮和亚硝酸盐的去除效果

取天然湖泊水样2000mL,经人工添加氯化铵和亚硝酸钠，使水体中的氨氮和亚硝酸盐的初浓度分别达到20.1mg/L和12.5mg/L。氨氮含量测定采用纳氏试剂分光光度法；亚硝态氮含量测定采用分光光度法。将实施例6中制备好的T1液体菌剂按0.5%添加量加至含一定浓度的氨氮和亚硝酸盐浓度的人工加富水样中，于室外自然光下培养7d，测定T1液体菌剂对水中氨氮及亚亚硝酸盐的去除率。结果表明（表6），T1液体菌剂对水体中氨氮和亚硝酸盐的去除率分别达到53.7%和65.6%，具有明显的改善水质的功能。

表6T1液体菌剂对氨氮和亚硝酸盐的去除效果

实施例8，解淀粉芽孢杆菌T1及其微生物菌剂在发酵生产水产动物饲料中的应用。

按菜籽粕80%，麸皮20%，料：水=1：1，混合均匀，配制成水产发酵饲料固体培养基，按发酵料干基重量的0.5%接种量上述T1固体菌剂，混合均匀后将培养料堆至30-40cm厚，于28-40℃发酵30-40h，每12h翻堆一次。将发酵完毕的培养物置于50-60℃下烘干、粉碎、包装，制备成含T1活菌剂并具有溶藻活性的水产固体发酵生物活性饲料。该饲料投放至养殖水体后具有明显抑制蓝藻，调控水质的作用。

实施例9，解淀粉芽孢杆菌T1及其微生物菌剂在养殖水体生态修复上的应用。

2010年6月湖北某水库养鱼爆发大面积蓝藻水华，每亩投放5Kg含T1活菌剂的水产固体发酵饲料，10d后用显微镜观测水体中藻的种类和数量，结果显示导致蓝藻水华的微囊藻数量下降了80%,而小球藻等有益藻数量增加60%。T1菌剂具有明显的修复养殖水体的功能。

Claims

1.一株解淀粉芽孢杆菌，其特征在于,该菌株为解淀粉芽孢杆菌（ Bacillus amyloliquefaciens）T1,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2012184。

2.一种含权利要求1中所述的解淀粉芽孢杆菌T1的微生物菌剂，其特征在于其活性成分为解淀粉芽孢杆菌T1菌体及其代谢产物。

3.根据权利要求2中所述的微生物菌剂，其特征在于所述的菌剂为固态菌剂或液态菌剂。

4.根据权利要求3中所述的微生物菌剂，其特征在于所述的菌剂为固态菌剂。

5.根据权利要求3中所述的微生物菌剂，其特征在于所述的菌剂为液态菌剂。

6.制备权利要求4中所述的固态菌剂的方法，该方法包括如下步骤：

（1）菌种活化：用接种环挑取一环解淀粉芽孢杆菌T1菌种接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，置37℃恒温培养箱中培养20-24h；

（2）种子液的制备：挑取一环经活化的解淀粉芽孢杆菌T1菌株接入装有100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250mL三角瓶中，37℃ 、180r/min摇床培养24h备用；

（3）固体发酵培养基制备：按玉米粉20%，麸皮20%，米糠40%，菜籽粕20%，料：水=1:1，pH自然，混合均匀，配制成固体发酵培养基，并分装于耐高温的塑料方盒中，120℃灭菌30min后冷却待用；

（4）固体菌剂培养：按5-10%接种量接入预先培养好的解淀粉芽孢杆菌T1种子液至固体发酵培养基中，混合均匀后置37℃培养箱中培养2天，每12h搅拌一次；

（5）干燥、粉碎及包装：将上述发酵完毕的固体培养物置于55℃烘箱中烘至含水率低于10%，用万能粉碎机将干燥的培养物粉碎、过100目筛后，制备成固体粉末状菌剂并装入密封的塑料袋中，放置干燥、阴凉处或冰箱保鲜层中保藏。

7.制备权利要求5中所述的液态菌剂的方法，该方法包括如下步骤：

（1）解淀粉芽孢杆菌T1菌种活化及液体培养：挑取一接种环解淀粉芽孢杆菌T1菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，置恒温培养箱中37℃培养20h，挑取经活化的解淀粉芽孢杆菌T1菌株接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180r/min摇床培养24h备用；

（2）液体发酵培养基制备：按蔗糖4%，酵母膏2%，蛋白胨1%, KH₂PO₄ 0.05%, MgSO₄ 0.02%，pH6.5～7.0配制成液体培养基，120℃灭菌20min备用；

（3）液体菌剂培养：按5-10%接种量接入预先培养好的解淀粉芽孢杆菌T1种子液至液体发酵培养基中，37℃、180r/min摇床培养18-24h；

（4）包装及保存：将培养好的解淀粉芽孢杆菌T1菌液装入密封的塑料瓶中制备成液体菌剂，置冰箱保鲜层中保藏。

8.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在水体中防治有害水华蓝藻上的应用。

9.权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌T1的微生物菌剂在防治微囊藻水华上的应用。

10.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在发酵生产水产动物饲料中的应用。

11.权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌T1的微生物菌剂在发酵生产水产动物饲料中的应用。

12.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在养殖水体生态修复上的应用。

13.权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌T1的微生物菌剂在养殖水体生态修复上的应用。