CN102168051B - 一株对井岗霉素水剂具有较高抗性的蜡状芽孢杆菌及应用 - Google Patents
一株对井岗霉素水剂具有较高抗性的蜡状芽孢杆菌及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一株对井冈霉素水剂具有较高抗性的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)WR-12，该菌株于2010年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC No.4195；该蜡状芽孢杆菌WR-12对井冈霉素水剂有较高的抗性，在井冈霉素水剂中存活率高，且与井冈霉素水剂能够协同抑制水稻立枯丝核菌，复配农药的生产、运输、保存和使用方便，降低生产成本，使农民受益，从而提高经济和社会效益。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一株对井冈霉素水剂有较高抗性的蜡状芽孢杆菌及其与井冈霉素水剂混合防治水稻等植物的纹枯病的应用。
(二)背景技术
随着社会的进步和人们生活水平的提高，对无污染和无公害食品的要求日益高涨，因此开展了各种无公害防治植物病虫害的研究，研究的重点即为生物农药。与传统的化学农药相比，生物农药具有对人畜和非靶标生物安全，环境兼容性好，不易产生抗性，易于保护生物多样性，来源广等优点。因此，高效生物农药的开发应用对人类健康，环境保护和农业的可持续发展都有极其重大的意义。
井冈霉素(jingangmycin)是上海市农药研究所20世纪70年代开发的一种农用抗生素，是一种典型的生物农药，在我国被大量用于水稻纹枯病、稻曲病、小麦纹枯病等真菌病害的防治。30多年来使用经久不衰，年防治面积达2亿多亩，为我国水稻的高产稳产做出了重要的贡献，为目前农村中无法替代的优良药剂。然而由于价格低廉等因素，农民经常擅自扩大使用剂量和使用次数，尽管至今未发现抗药性，但这对于稻米安全、生态环境和人畜构成潜在危害。
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，又称蜡样芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌，是一种革兰氏阳性杆菌，可产生抗菌物质，抑制有害微生物的繁殖；还可以降解土壤中的磷、钾等营养成分，改善生态环境。植物上的蜡状芽孢杆菌还可以改善植物营养，刺激植物生长和防治发生植物病害，因而可以促进植物的生长，提高产量。另外，蜡状芽孢杆菌还能产生多种生物活性物质。因此，蜡状芽孢杆菌在植物病害防治中得到了较为广泛的应用。目前已有多个单位对蜡状芽孢杆菌进行了研究，发现其对很多致病菌具有拮抗性能。文献“蜡质芽孢杆菌R2防治水稻纹枯病研究”(植物病理学报，1993，23(2)：101-105)发现蜡质芽孢杆菌R2对水稻纹枯菌菌丝生长有抑制作用，并且可以对水稻生长发育有一定促进作用。文献“一株芽孢杆菌的初步分离鉴定与拮抗性试验”(西北农林科技大学学报(自然科学版)，2004.32(7)：93-96)，推测蜡状芽孢杆菌具有较广的抗菌谱，对试验中的大多数病原菌具有较好的拮抗能力。蜡状芽孢杆菌作为抗菌制剂已开始应用于农业生产中，基于它对水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的拮抗作用，多用于水稻纹枯病的防治。
为克服井冈霉素在应用上的局限和降低潜在威胁，近年来国内相继开发了井冈霉素与生防芽孢杆菌混配的系列农药产品，井冈霉素与蜡状芽孢杆菌复配剂就是其中一种。在诸多大田研究中，井冈霉素与蜡状芽孢杆菌复配剂的防效表现为增效。文献“12.5％井冈霉素·蜡质芽孢杆菌防治水稻纹枯病的试验”(湖北植保，2009，113(3)：45)，文献“10％井冈霉素·蜡质芽孢杆菌防治稻曲病试验”(湖北植保，2009，113(3)：46)，文献“10％井·蜡芽菌悬浮剂防治水稻纹枯病试验初报”(中国稻米，2009，4：67-68)，文献“井·蜡芽40％可湿性粉剂防治水稻纹枯病和稻曲病药效试验”(安徽农学通报，2008，14(21)：169-170)都报道，井冈霉素·蜡状芽孢杆菌对水稻纹枯病的防效十分显著，均高于30％苯醚甲环唑·丙环唑(爱苗)，且增产效果明显，表明宜于在水稻上进行推广应用。
目前市场上已经有井冈霉素·蜡芽复配粉剂，商品名为纹枯清，如浙江省桐庐汇丰生物化工有限公司、江苏省苏科农化有限责任公司、安徽省合肥福瑞德生物化工厂等均有相应产品生产和销售，并且在水稻纹枯病和稻曲病的防治中起到很好的作用，创造出较大的经济和社会价值。而这些复配农药属于粉剂，生产和施用过程操作复杂，成本较高。如果将蜡状芽孢杆菌直接与井冈霉素水剂复配，就可以降低生产成本，而且方便使用，提高农药效用。
然而，文献“井冈霉素对混剂中拮抗细菌B-5423-R和稻株上土著细菌群体数量的影响”(植物保护学报.2007，34(6)：657-658)，文献“井冈霉素对土壤可培微生物的生态效应”(农药，2006，45(11)：771-774)等研究均报道井冈霉素能降低与之混配的生防细菌及土著细菌的种群数量。因此，在使用井冈霉素时，提高生防菌的存活种群数量而增加生防效果，成为当前迫切需要解决的一个问题。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株对井冈霉素水剂有较高抗性的蜡状芽孢杆菌及其与井冈霉素水剂混合防治水稻等植物的纹枯病的应用，该蜡状芽孢杆菌在井冈霉素水剂中存活率高，且与井冈霉素水剂能够协同抑制水稻立枯丝核菌，复配农药的生产、运输、保存和使用方便，降低生产成本，使农民受益，从而提高经济和社会效益。
本发明采用的技术方案是：
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)WR-12，保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号：中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.4195，保藏日期2010年9月25日。
本发明所述的蜡状芽孢杆菌WR-12按照以下步骤筛选：
从浙江省桐庐县附近的稻田中采集土壤样品→分离鉴定→NTG诱变处理→井冈霉素水剂中长期放置→分离鉴定→摇瓶发酵选育→分离鉴定→梯度平板选育→分离鉴定→获得抗性菌株。不断增加培养基中所含井冈霉素水剂的量，摇瓶发酵选育与梯度平板选育交替重复进行。通过多轮自然选育，最终获得了井冈霉素水剂抗性菌株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)WR-12。
本发明所述的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)WR-12的筛选按照以下步骤进行：
(1)菌种分离
将从浙江省桐庐县附近的稻田中采集的土壤样品用无菌生理盐水制成悬液，于70℃水浴加热10min，采用平板涂布活菌分离法，涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板，30℃培养24h观察。挑取白色蜡质状单菌落于MYP鉴定平板划线分离，30℃培养24h，观察，挑取乳白色蜡质状并带有晕圈的单菌落接种于牛肉膏蛋白胨固体斜面，30℃培养12h，获得菌体命名为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)WR；所述的牛肉膏蛋白胨培养基配制方法为：牛肉膏3g、蛋白胨5g、NaCl 5g、琼脂20g，加热煮沸，加水至1000mL，调pH至7.0，121℃灭菌20min；所述的MYP鉴定培养基配制方法为为：制备50％卵黄液：取鲜鸡蛋，用硬刷将蛋壳彻底洗净，沥干，放于75％酒精溶液中浸泡1h，以无菌操作取出卵黄，加入等量生理盐水，混合后备用；取甘露醇卵黄多粘菌素琼脂基础培养基44g，加蒸馏水900mL，加热溶解后分装每瓶90mL，121℃灭菌20min，冷却55℃左右，每瓶加入50％卵黄液5mL和多粘菌素B硫酸盐10000IU，混匀后倒平板。
(2)诱变育种
以N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)作为诱变剂，对蜡状芽孢杆菌WR进行化学诱变，致死率为86％。对经过诱变的菌株通过平板涂布活菌分离法分离鉴定，命名为蜡状芽孢杆菌WR-1。
(3)菌种选育
1)静置选育：将蜡状芽孢杆菌WR-1斜面制成菌悬液，发酵培养，发酵液离心弃上清液，加入井冈霉素水剂摇匀，室温放置一年。分离鉴定，命名为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)WR-2。
2)摇瓶选育：将蜡状芽孢杆菌WR-2菌种接种到含有井冈霉素水剂的培养基中，摇床培养，计量芽孢数，筛选井冈霉素水剂高抗性菌株，再次接种到含有不同浓度井冈霉素水剂的培养基中，摇床培养，计量芽孢存活率，筛选高浓度井冈霉素水剂高抗性菌株，转接斜面培养，不断增加培养基中所含井冈霉素水剂的量，摇瓶发酵选育与梯度平板选育交替选育，循环数次，鉴定，获得井冈霉素水剂高抗性蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)WR-12，保藏菌种。
本发明所述蜡状芽孢杆菌芽孢计数：
取0.5mL蜡状芽孢杆菌发酵液(或蜡状芽孢杆菌井冈霉素水剂放置液)加入4.5mL无菌水中稀释10倍混匀，70℃水浴10min，继续稀释至相应梯度；选取合适梯度稀释液，取100μL涂布于牛肉膏蛋白胨平板，3个平行，30℃培养20h计菌落数。
本发明所述蜡状芽孢杆菌芽孢存活率，按公式(1)计算：
公式(1)中a为芽孢存活率(％)，n0为放置前芽孢悬液的菌落平均数(CFU/mL)，n1为放置数天后芽孢悬液的菌落平均数(CFU/mL)。
本发明所述的蜡状芽孢杆菌WR-12菌株的特性：
1)菌株细胞形态：
所述的蜡状芽孢杆菌WR-12细胞形态为杆状，长3.0～5.1μm、宽1.2～2.0μm，有鞭毛，能运动；有芽孢，芽孢柱形，中生或近中生；革兰氏染色阳性；在牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基上，30℃培养24h，可形成圆形或近圆形菌落，直径5～7mm，白色，似融蜡状，不透明，表面较粗糙，扁平，不规则；所述蜡状芽孢杆菌WR-12生化实验：兼性好氧，生长温度范围20～45℃，4℃生长缓慢或不生长，50℃时不生长，最适生长温度28℃；在乳糖培养基中不产酸，也不产气，过氧化氢酶阳性，吲哚实验阳性，可使淀粉、明胶水解；V.P.和M.R.试验阴性；可以利用D-木糖、D-鼠李糖、可溶性淀粉，葡萄糖为唯一碳源生长，不能利用蔗糖、乳糖、半乳糖，麦芽糖为唯一碳源生长；能利用L-精氨酸、L-缬氨酸、丙氨酸、酪氨酸，L-脯氨酸为唯一氮源生长，不能利用NaNO3、(NH4)2HPO4，L-谷氨酸为唯一氮源生长。
菌种的保藏：斜面菌种放4℃冰箱短暂保存或制成冻干粉长期保存。
本发明所述的蜡状芽孢杆菌WR-12在防治水稻纹枯病中的应用。
所述蜡状芽孢杆菌WR-12对井冈霉素水剂具有较高的抗性，可以利用其芽孢与井冈霉素水剂混合制成复配农药，用于防治水稻纹枯病。
所述的应用是将蜡状芽孢杆菌WR-12接种到适用于芽孢杆菌的培养基中进行发酵培养，将发酵液离心分离获得蜡状芽孢杆菌WR-12菌体细胞，将蜡状芽孢杆菌WR-12菌体细胞与3％～5％井冈霉素水剂混合，制成复配农药用于抑制水稻纹枯菌以防治水稻纹枯病，所述的蜡状芽孢杆菌WR-12菌体以细胞数计为108～1010个/mL 3％～5％井冈霉素水剂。
所述的蜡状芽孢杆菌WR-12在防治水稻纹枯病中的应用，所述的蜡状芽孢杆菌WR-12菌体细胞按如下方法制得：
(1)斜面培养：将蜡状芽孢杆菌WR-12菌种接种到斜面培养基，30℃培养12h获得菌体斜面；所述斜面培养基终浓度组成为：牛肉膏3g/L、蛋白胨5g/L、NaCl 5g/L、琼脂20g/L，溶剂为水，调pH至7.0，121℃灭菌20min，备用；
(2)种子培养：从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基中，摇床转速200r/min，30℃培养24h，获得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为：牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，调pH至7.0，121℃灭菌20min，备用；
(3)发酵培养：取种子液以体积分数1～2％的接种量接种到发酵培养基，摇床转速200r/min，30℃培养18～30h，将发酵液离心获得菌体细胞；所述的发酵培养基的终浓度组成为：牛肉膏3g/L、蛋白胨5g/L、NaCl 5g/L、溶剂为水，调pH至7.0，121℃灭菌20min，备用。
一种利用蜡状芽孢杆菌WR-12制成的复配农药优选为：将蜡状芽孢杆菌WR-12菌体细胞与5％井冈霉素水剂混匀，制得蜡状芽孢杆菌WR-12菌体以细胞数计为108～1010个/mL5％井冈霉素水剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种新菌种蜡状芽孢杆菌WR-12，该蜡状芽孢杆菌WR-12对井冈霉素水剂有较高的抗性，在井冈霉素水剂中存活率高，且与井冈霉素水剂能够协同抑制水稻立枯丝核菌，复配农药的生产、运输、保存和使用方便，降低生产成本，使农民受益，从而提高经济和社会效益。
(四)附图说明
图1蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)WR菌落形态：图1中的A、图1中的B为蜡质芽孢杆菌WR形成的白色蜡质状单菌落；图1中的C为蜡质芽孢杆菌在MYP鉴定培养基上形成的微粉红色菌落；图1中的D为蜡质芽孢杆菌WR周围产生的卵磷脂酶沉淀环；
图2蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)WR显微镜照片：图2中的A为培养14h的芽孢染色；图2中的B为培养22h的芽孢染色；图2中的C为培养30h的芽孢染色；图2中的D为培养12h的革兰氏染色；
图3蜡状芽孢杆菌WR-12与蜡状芽孢杆菌WR芽孢存活率比较；
图4蜡状芽孢杆菌WR-12与蜡状芽孢杆菌WR抗井冈霉素水剂比较；图4中的A为蜡状芽孢杆菌WR抗性，图4中的B为蜡状芽孢杆菌WR-12抗性；
图5蜡状芽孢杆菌WR-12与井冈霉素水剂协同抑菌作用：图5中的A为蜡状芽孢杆菌WR-12组，图5中的B为空白对照组。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所用的培养基如下：
(1)牛肉膏蛋白胨培养基的配制：牛肉膏3g、蛋白胨5g、NaCl 5g、琼脂20g，加热煮沸，加水至1000mL，调pH至7.0，121℃灭菌20min，备用；
(2)MYP鉴定培养基的配制：制备50％卵黄液：取鲜鸡蛋，用硬刷将蛋壳彻底洗净，沥干，放于75％酒精溶液中浸泡1h，以无菌操作取出卵黄，加入等量生理盐水，混合后备用；取甘露醇卵黄多粘菌素琼脂基础培养基44g，加蒸馏水900mL，加热溶解后分装，每瓶90mL，121℃灭菌20min，冷却55℃左右，每瓶加入50％卵黄液5mL和多粘菌素B硫酸盐10000IU，混匀后倒平板；
(3)斜面培养基的配制：同牛肉膏蛋白胨培养基的配制；
(4)种子培养基的配制：牛肉膏3g、蛋白胨5g、NaCl 5g、加水至1000mL，调pH至7.0，121℃灭菌20min，备用；
(5)发酵培养基的配制：牛肉膏3g、蛋白胨5g、NaCl 5g、加水至1000mL，调pH至7.0，121℃灭菌20min，备用。
实施例1蜡状芽孢杆菌WR-12分离鉴定
(1)菌种分离：从浙江省桐庐县附近的稻田中采集土壤样品，称取1克，加入装有0.9％(m/v)无菌生理盐水99mL的三角瓶中(装有玻璃珠)，摇匀，制成1％的菌悬液，于70℃水浴加热10min，采用平板涂布活菌分离法，涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板，30℃培养24h，挑取白色蜡质状单菌落于MYP鉴定平板划线分离，30℃培养24h，挑取乳白色蜡质状并带有晕圈的单菌落接种于牛肉膏蛋白胨固体斜面，30℃培养12h，获得的菌体命名为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)WR，其菌落形态及显微镜照片如图1和图2所示，蜡状芽孢杆菌为好氧菌，涂布在普通牛肉膏蛋白胨培养基上30℃培养24h可形成圆形白色蜡质状单菌落，质地柔软且稍有光泽，直径5～7mm，如图1中的A、图1中的B所示；蜡状芽孢杆菌产磷脂酶C，可以把卵磷脂水解为二甘油脂和胆碱磷酸酯，在MYP鉴定培养基上可以形成微粉红色的菌落，如图1中的C所示，周围环绕产生卵磷脂酶沉淀环，提示该菌具有特异的卵磷脂酶活性，如图1中的D所示，与蜡状芽孢杆菌特性相符；取培养时间为12h、14h、22h和30h的菌体，分别进行芽孢染色，在15×100倍油镜下观察：培养14h菌体的染色，蜡状芽孢杆菌菌体细胞成链状，形态大小相同，有少许芽孢形成，如图2中的A所示；培养22h菌体的染色，大量芽孢着生在菌体中间，呈椭圆状，被染成绿色(孔雀绿的颜色)，菌体边缘呈红色(复染液番红的颜色)，表明芽孢还未脱落，如图2中的B所示；培养30h菌体的染色，大量椭圆芽孢脱落，并被染成绿色，如图2中的C所示；培养12h菌体革兰氏染色，菌体为紫色，表明为革兰氏阳性细菌，图2中的D所示。
(2)诱变育种：以N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)作为诱变剂，对蜡状芽孢杆菌WR进行化学诱变。对经过诱变的菌株分离鉴定，命名为蜡状芽孢杆菌WR-1。
(3)菌种选育
1)静置选育：
取0.9％的无菌生理盐水1mL，加入到步骤(2)培养14h的蜡状芽孢杆菌WR-1斜面制成菌悬液，取100μL转接于50mL发酵培养基中，30℃、200r/min摇床培养48h。取发酵液5mL，7000r/min离心10min，弃上清液，加入5％的井冈霉素水剂5mL摇匀，室温放置一年。分离鉴定，所得菌株命名为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)WR-2
2)摇瓶选育：
在50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中加入6mL 0.5％无菌井冈霉素水剂，接种步骤1)所获得的蜡状芽孢杆菌WR-2菌悬液100μL，30℃、200r/min摇床培养48h，计量芽孢数，选取芽孢数较高的蜡状芽孢杆菌平板，将其菌落影印至牛肉膏蛋白胨含井冈霉素水剂不同浓度的平板，30℃培养24h，计量芽孢存活率，选取蜡状芽孢杆菌存活率最高的井冈霉素水剂浓度平板上的活菌株转接斜面，不断增加培养基中所含井冈霉素水剂的量，摇瓶发酵选育与梯度平板选育交替选育，循环数次，鉴定，最终得到较高抗性菌株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)WR-12，4℃冰箱暂时保存或制成冻干粉长期保存。
实施例2蜡状芽孢杆菌WR-12发酵条件的确定
(1)最适发酵时间的测定
接种蜡状芽孢杆菌WR-12于5瓶细菌发酵培养基，pH 7.0，分别以24h、36h、48h、60h、72h为发酵时间，30℃发酵培养，取发酵液5mL，7000r/min离心10min，弃上清液，加入5％的井冈霉素水剂5mL摇匀，室温放置8d。以芽孢数及存活率为指标，分析蜡状芽孢杆菌WR-12耐井冈霉素水剂的情况，如表1所示，结果表明蜡状芽孢杆菌WR-12的最适发酵时间为48h。
表1蜡状芽孢杆菌WR-12最适发酵时间
| 序号 | 接种量 | 发酵时间 | 芽孢数 | 芽孢存活率 |
| 1 | 2％ | 24 | 0.11×108 | 27％ |
| 2 | 2％ | 36 | 2.89×108 | 17％ |
| 3 | 2％ | 48 | 5.01×108 | 45％ |
| 4 | 2％ | 60 | 6.40×108 | 47％ |
| 5 | 2％ | 72 | 4.71×108 | 4％ |
(2)最适初始pH的测定
配置初始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0无菌牛肉膏蛋白胨液体培养基5瓶，接种0.5mL蜡状芽孢杆菌WR-12(OD600约为1.0)，30℃，摇床培养48h，以芽孢数及存活率为指标，分析蜡状芽孢杆菌WR-12耐井冈霉素水剂的情况，如表2所示，结果表明蜡状芽孢杆菌WR-12的最适初始pH为6.0。
表2蜡状芽孢杆菌WR-12最适发酵pH
| 序号 | 接种量 | 发酵液pH | 芽孢数 | 芽孢存活率 |
| 1 | 2％ | 4 | 0.01×108 | 84％ |
| 2 | 2％ | 5 | 0.02×108 | 78％ |
| 3 | 2％ | 6 | 7.53×108 | 21％ |
| 4 | 2％ | 7 | 6.33×108 | 12％ |
| 5 | 2％ | 8 | 28.3×108 | 2％ |
实施例3蜡状芽孢杆菌WR-12抗井冈霉素水剂特性检测
(1)蜡状芽孢杆菌WR-12与蜡状芽孢杆菌WR芽孢存活率比较
分别将蜡状芽孢杆菌WR-12和蜡状芽孢杆菌WR接种于发酵培养基，30℃发酵48h。取发酵液5mL，7000r/min离心10min，弃上清液，加入5％的井冈霉素水剂5mL摇匀，室温放置8d，以WR为对照，分析蜡状芽孢杆菌WR-12的芽孢耐井冈霉素水剂的情况，如图3所示，结果表明，蜡状芽孢杆菌WR-12存活率约55％，而蜡状芽孢杆菌WR存活率11％左右，抗性菌株WR-12相比于亲株WR，其芽孢在井冈霉素水剂中8d放置存活率得到显著提高，达到5～50倍。
(2)管碟法检测蜡状芽孢杆菌WR-12与蜡状芽孢杆菌WR对井冈霉素水剂抗性
将蜡状芽孢杆菌WR-12与蜡状芽孢杆菌WR，分别接种于发酵培养基，30℃培养48h，取0.5mL发酵液稀释10倍，70℃水浴10min，取200μL至15mL牛肉膏蛋白胨固体培养基混匀倒平板，静置30min，取相同规格无菌牛津杯置于其上，一杯加入200μL无菌5％井冈霉素水剂，一杯加入200μL 0.9％生理盐水，30℃培养22h观察抑菌圈。以蜡状芽孢杆菌WR为对照，分析蜡状芽孢杆菌WR-12的菌体耐井冈霉素水剂的情况，如图4，蜡状芽孢杆菌WR-12抑菌圈很小，蜡状芽孢杆菌WR出现明显抑菌圈。
(3)蜡状芽孢杆菌WR-12与井冈霉素水剂协同作用检测
在存在井冈霉素浓度梯度的双层PDA培养基平板上，在低浓度一侧对称接种两块水稻立枯丝核菌，由低到高顺着井冈霉素浓度梯度方向放一张浸有蜡状芽孢杆菌WR-12发酵液(调整OD600至1.0～1.5)的滤纸片，以浸0.9％生理盐水滤纸片为对照，30℃培养5d，观察菌丝生长面积，如图5所示，结果表明，空白对照的菌丝面积明显大于蜡状芽孢杆菌WR-12菌丝生长面积，蜡状芽孢杆菌WR-12与水稻立枯丝核菌之间出现明显抑制区域，表明蜡状芽孢杆菌WR-12与井冈霉素水剂能够协同抑制水稻立枯丝核菌，比单用井岗霉素效果好。
PDA培养基的配制：马铃薯200g，去皮切块煮沸30min，用纱布过滤，加葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，调pH至7.0，121℃灭菌30min。用于真菌的常规培养以及芽孢杆菌与真菌对峙实验。
实施例4蜡状芽孢杆菌WR-12与5％井冈霉素复配农药
将蜡状芽孢杆菌WR-12接种于发酵培养基，30℃、200r/min摇床培养培养48h。然后8000r/min离心，弃去上清，收集菌体(主要为芽孢)，然后将蜡状芽孢杆菌WR-12菌体细胞与5％井冈霉素水剂混匀，制得蜡状芽孢杆菌WR-12菌体以细胞数计为108～1010个/mL5％井冈霉素水剂。
Claims (6)
1.蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)WR-12，保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.4195，保藏日期2010年9月25日。
2.如权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌WR-12在防治水稻纹枯病中的应用。
3.如权利要求2所述的蜡状芽孢杆菌WR-12在防治水稻纹枯病中的应用，其特征在于所述的应用是通过蜡状芽孢杆菌WR-12对水稻纹枯菌有抑制作用来防治水稻纹枯病。
4.如权利要求3所述的蜡状芽孢杆菌WR-12在防治水稻纹枯病中的应用，其特征在于所述的应用是将蜡状芽孢杆菌WR-12接种到适用于芽孢杆菌的培养基中进行发酵培养，将发酵液离心分离获得蜡状芽孢杆菌WR-12菌体细胞，将蜡状芽孢杆菌WR-12菌体细胞与3%~5%井冈霉素水剂混合，制成复配农药用于抑制水稻纹枯菌以防治水稻纹枯病，所述的蜡状芽孢杆菌WR-12菌体以细胞数计为108~1010个/mL3%~5%井冈霉素水剂。
5.如权利要求4所述的蜡状芽孢杆菌WR-12在防治水稻纹枯病中的应用，其特征在于所述的蜡状芽孢杆菌WR-12菌体细胞按如下方法制得：
(1)斜面培养：将蜡状芽孢杆菌WR-12菌种接种到斜面培养基，30℃培养12h获得菌体斜面；所述斜面培养基终浓度组成为：牛肉膏3g/L、蛋白胨5g/L、NaCl 5g/L、琼脂20g/L，溶剂为水，调pH至7.0，121℃灭菌20min，备用；
(2)种子培养：从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基中，摇床转速200r/min，30℃培养24h，获得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为：牛肉膏3g/L、蛋白胨5g/L、NaCl 5g/L、溶剂为水，调pH至7.0，121℃灭菌20min，备用；
(3)发酵培养：取种子液以体积分数1~2%的接种量接种到发酵培养基，摇床转速200r/min，30℃培养18~30h，将发酵液离心获得菌体细胞，所述的发酵培养基的终浓度组成为：牛肉膏3g/L、蛋白胨5g/L、NaCl 5g/L、溶剂为水，调pH至7.0，121℃灭菌20min，备用。
6.一种利用权利要求1所述蜡状芽孢杆菌WR-12制成的复配农药，其特征在于所述的复配农药为：将蜡状芽孢杆菌WR-12菌体细胞与5%井冈霉素水剂混匀，制得蜡状芽孢杆菌WR-12菌体以细胞数计为108~1010个/mL5%井冈霉素水剂。
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