CN107011396A - 一种降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明发现了解决井冈霉素发酵液中放罐时残糖浓度过高的方法，得以克服井冈霉素发酵液过滤困难，喷雾干燥粉粘壁，喷雾干燥粉润湿性差的问题，该方法是通过将发酵至衰退期的井冈霉素发酵液补入一定比例的糖化酶及有机氮源，然后加入杆菌状态的蜡质芽孢杆菌发酵液，进行培养，通过蜡质芽孢杆菌的繁殖，有效利用井冈霉素发酵液中残糖浓度，使井冈霉素残糖浓度比例可以降低三分之二，有利于井冈霉素发酵液的后处理，而且也不影响井冈霉素的效价。

Description

一种降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法
技术领域
本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法。
背景技术
井冈霉素是防治水稻纹枯病的主要杀菌剂之一，由吸水链霉菌井冈变种发酵而成。井冈霉素为氨基糖苷类抗生素，生物合成过程中需要大量的糖分，但井冈霉素发酵至后期，菌丝衰老，部分糖不能利用，发酵结束井冈霉素的残糖浓度在1.5％以上。发酵液残糖浓度过多，会造成发酵液粘度变大，过滤速度变慢，后处理设备粘壁以及井冈霉素喷雾干燥粉剂润湿性不合格，影响产品质量。因此，有必要尽量降低井冈霉素发酵液中残糖浓度的含量。
蜡质芽孢杆菌是微生物源杀菌剂，主要应用于防治土壤传播的细菌性病害，如姜瘟病、茄子青枯病、辣椒青枯病等，作用机理为蜡质芽孢杆菌能通过体内的SOD酶，提高作物对病菌和逆境危害引发体内产生氧的清除能力，调节作物细胞微生境，维护细胞正常的生理代谢和生化反应，提高抗逆性，加速生长，提高产量和品质。蜡质芽孢杆菌属微生物制剂，低毒、低残留，不污染环境，使用安全。
发明内容
本发明是基于以下发现做出的：
通过将井冈霉素发酵液加入糖化酶处理，然后补加一定比例的有机氮源，同时补入一定量的蜡质芽孢杆菌菌液，在一定温度、供氧条件下进行培养，通过蜡质芽孢杆菌繁殖，可以将井冈霉素发酵液中的残糖浓度消耗。
发明人意外地发现通过加入糖化酶将井冈霉素发酵液中多糖转化为单糖，同时补加一定比例的有机氮源，使发酵液碳氮比适合蜡质芽孢杆菌生长，有助于蜡质芽孢杆菌快速繁殖。同时加入杆菌状态的蜡质芽孢杆菌发酵液进行发酵，可以将井冈霉素发酵液残糖浓度降低三分之二，同时，不影响井冈霉素产量。
即本发明的目的在于提供一种降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法，包括以下步骤：
1)将井冈霉素发酵液调节pH至4.0，每升发酵液补入10000u糖化酶，反应0.5小时；
2)将井冈霉素发酵液调回pH至6.3～6.8，每升发酵液补加1～5克的有机氮源，同时补入蜡质芽孢杆菌，通入空气，开启搅拌，发酵6～24小时。
优选地，本发明所述降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法中，所述步骤1) 中所述井冈霉素发酵液中的残糖浓度大于等于1.0％。
优选地，本发明所述降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法中，所述步骤2) 中所述有机氮源为酵母粉。
优选地，本发明所述降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法中，所述步骤2) 中所述发酵过程中的溶氧为控制在10％以上，所述发酵过程中的罐温为 20～40℃。
优选地，本发明所述降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法中，所述步骤2) 中蜡质芽孢杆菌为杆菌状态。
优选地，本发明所述降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法中，所述步骤2) 中所述蜡质芽胞杆菌培养方法为：培养基每升发酵液中含：葡萄糖3～10克, 花生饼：10～20克,酵母粉：5～10克，氯化钠：1～5克，pH：7.5，发酵溶氧控制在10％以上，罐温25～40℃。
优选地，本发明所述降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法中，所述步骤2) 中所述蜡质芽胞杆菌的接入量为：每升发酵液补入50毫升，单位活菌数为 107～108cfu。
优选地，本发明所述降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法中，在所述步骤2)中接入蜡质芽胞杆菌后，调整搅拌转速通气量，使溶氧控制在10％～50％，罐温30℃，发酵12小时。
本发明的另一目的在于提供上述降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法获得的井冈霉素发酵液，其中所述井冈霉素发酵液中残糖浓度的比例为低于 0.6％重量；优选地，本发明井冈霉素发酵液中残糖浓度的比例为低于0.5％重量；最优选地，本发明井冈霉素发酵液中残糖浓度的比例为低于或等于 0.46％重量。
本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明发现了解决井冈霉素发酵液中放罐时残糖浓度过高的方法，得以克服井冈霉素发酵液过滤困难，喷雾干燥粉粘壁，喷雾干燥粉润湿性差的问题，该方法是通过将发酵至衰退期的井冈霉素发酵液补入一定比例的糖化酶及有机氮源，然后加入杆菌状态的蜡质芽孢杆菌发酵液，进行培养，通过蜡质芽孢杆菌的繁殖，有效利用井冈霉素发酵液中残糖浓度，使井冈霉素残糖浓度比例可以降低三分之二，有利于井冈霉素发酵液的后处理，而且也不影响井冈霉素的效价。
说明书附图
图1为蜡质芽孢杆菌杆菌发酵液OD600与单位杆菌数线性关系图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
将井冈霉素菌种接种入井冈霉素发酵培养基中，每升含有可溶性淀粉 120克，酵母粉20克，氯化钠3克，碳酸钙3克，磷酸二氢钾3克，pH值为7.0，发酵过程中溶氧控制在30％以上，罐温38℃，发酵过程中溶氧控制在30％以上，进行发酵。发酵周期，发酵结束，测定残糖浓度、氨基氮，试验结果见表1。
井冈霉素菌种采用吸水链霉菌井冈变种Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis hfjg01(CGMCC No.6636)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年09月26日，本专利相关试验均采用该菌。残糖浓度检测方法为斐林试剂法，氨基氮采用中性甲醛法，井冈霉素检测方法采用国标GB/T 9553-1993进行，以下实施例均采用该方法。
表1实施例1试验结果参数表
实施例2
将蜡质芽孢杆菌菌种(获得自浙江工业大学)接入蜡质芽孢杆菌培养基中，蜡质芽胞杆菌培养基为每升发酵液中含：葡萄糖30克,花生饼5克，酵母粉10克，氯化钠，5克，pH：7.5，发酵溶氧控制在20％以上，罐温35℃培养，每小时取样，测OD600，同时用倍比稀释法测定蜡质芽孢杆每毫升发酵液活菌数。根据OD600及对应的活菌数作图，结果见图1。
如图1所示，蜡质芽孢杆菌发酵液OD600与单位杆菌数呈线性关系，可以根据OD600结果估测单位发酵液中杆菌数。
实施例3
将井冈霉素菌种(同实施例1)接种入井冈霉素发酵培养基中每升含有可溶性淀粉120克，酵母粉20克，氯化钠10克，碳酸钙1克,磷酸二氢钾2 克，pH值为7.5，发酵过程中溶氧控制在30％以上，罐温40℃，发酵过程中溶氧控制在30％以上，进行发酵。发酵结束，测定残糖浓度量。
将蜡质芽孢杆菌菌种(同实施例2)接入蜡质芽孢杆菌培养基中，蜡质芽胞杆菌培养基为每升发酵中含：葡萄糖5克,花生饼20克，酵母粉10克，氯化钠，5克，pH：7.5，发酵溶氧控制在20％以上，罐温33℃培养，每小时取样镜检、测OD600，在蜡质芽孢杆菌转为芽孢之前，根据OD600与活菌数的关系，估测每毫升杆菌量，用无菌水调配成5×107的蜡质芽孢杆菌溶液，同时，用倍比稀释法测定蜡质芽孢杆菌数，每升井冈霉素发酵液中移入50毫升蜡质芽胞杆菌溶液，开启搅拌及通气，使发酵溶氧控制在20％以上，罐温30℃，培养24小时，测定发酵液中残糖浓度浓度。该试验重复三次。蜡质芽孢杆菌检测方法按照国标GB-T26428-2010进行。OD600用可见光分光光度计进行检测，结果见表2。
试验发现，井冈霉素发酵至中后期补加对数生长期后期，未转为芽孢的蜡质芽孢杆菌发酵液，结果发现对井冈霉素效价及产量未见明显影响，残糖浓度下降25.4％。
表2实施例3试验结果参数表
实施例4
将井冈霉素菌种(同实施例1)接种入井冈霉素发酵培养基中每升含有可溶性淀粉120克，酵母粉20克，氯化钠1克，碳酸钙3克,磷酸二氢钾3克， pH值为7.5，发酵过程中溶氧控制在30％以上，罐温40℃，发酵过程中溶氧控制在30％以上，罐温38℃，进行发酵。发酵结束，测定残糖浓度量。
将井冈霉素放罐液调节PH值为4.0，每升发酵液补入10000u糖化酶，反应0.5小时。然后将发酵液调回PH至6.5左右，补加5克的酵母粉。
将蜡质芽孢杆菌菌种(同实施例2)接入蜡质芽孢杆菌培养基中，蜡质芽胞杆菌培养基为每升发酵液中含：葡萄糖30克,花生饼5克，酵母粉10克，氯化钠，5克，pH：7.5，发酵溶氧控制在20％以上，罐温35℃培养，每小时取样镜检，测OD600，等蜡质芽孢杆菌95％转为芽孢时，根据OD600与芽孢数的关系，估测每毫升芽孢量，用无菌水调配成2×108的蜡质芽孢杆菌溶液，同时，用倍比稀释法测定蜡质芽孢杆芽孢数。
每升井冈霉素发酵液中移入100毫升蜡质芽胞杆菌溶液，开启搅拌及通气，使发酵溶氧控制在20％以上，罐温32℃，培养24小时，测定发酵液中残糖浓度浓度。该试验重复三次。蜡质芽孢杆菌杆菌检测方法：按照活菌检测方法进行，采用倍比稀释法进行，OD600用可见光分光光度计进行检测，试验结果见表3。
表3实施例4试验结果参数表
实施例5
将井冈霉素菌种(同实施例1)接种入井冈霉素发酵培养基中，每升培养基含有可溶性淀粉120克，酵母粉20克，氯化钠3克，碳酸钙3克,磷酸二氢钾2克，pH值为7.5，发酵过程中溶氧控制在30％以上，罐温38℃，发酵过程中溶氧控制在30％以上进行发酵。发酵结束，测定残糖浓度量。
将井冈霉素放罐液调节PH值为4.0，每升发酵液补入10000u糖化酶，反应0.5小时，然后将发酵液调回PH至6.5左右，补加5克灭菌后花生饼粉。
将蜡质芽孢杆菌菌种(同实施例2)接入蜡质芽孢杆菌培养基中，蜡质芽胞杆菌培养基为每升发酵液中含：葡萄糖5克，花生饼20克，酵母粉10克，氯化钠，5克，pH：7.5，发酵溶氧控制在20％以上，罐温33℃培养，每小时取样镜检、测OD600，在蜡质芽孢杆菌转为芽孢之前，根据OD600与活菌数的关系，估测每毫升杆菌量，用无菌水调配成1×108的蜡质芽孢杆菌溶液，同时，用倍比稀释法测定蜡质芽孢杆菌数。
每升井冈霉素发酵液补入50毫升的蜡质芽孢杆菌发酵液，开启搅拌及通气，使发酵溶氧控制在20％以上，罐温32℃培养18小时，测定发酵液中残糖浓度浓度。该试验重复三次。
蜡质芽孢杆菌检测方法：按照活菌检测方法进行，采用倍比稀释法进行。 OD600用可见光分光光度计进行检测，试验结果见表4。
表4实施例5试验结果参数表
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法，包括以下步骤：
1)将井冈霉素发酵液调节pH至4.0，每升发酵液补入10000u糖化酶，反应0.5小时；
2)将井冈霉素发酵液调回pH至6.2～6.8，每升发酵液补加1～5克的有机氮源，同时补入蜡质芽孢杆菌，通入空气，开启搅拌，发酵6～24小时。
2.根据权利要求1所述降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法，其特征在于，所述步骤1)中所述井冈霉素发酵液中的残糖浓度大于等于1.0％。
3.根据权利要求1所述降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法，其特征在于，所述步骤2)中所述有机氮源为酵母粉。
4.根据权利要求1所述降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法，其特征在于，所述步骤2)中所述发酵过程中的溶氧为控制在10％以上，所述发酵过程中的罐温为20～40℃。
5.根据权利要求1所述降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法，其特征在于，所述步骤2)中蜡质芽孢杆菌为杆菌状态。
6.根据权利要求5所述降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法，其特征在于，所述步骤2)中所述蜡质芽胞杆菌培养方法为：培养基每升发酵液中含：葡萄糖3～10克,花生饼：10～20克,酵母粉：5～10克，氯化钠：1～5克，pH：7.5，发酵溶氧控制在10％以上，罐温25～40℃。
7.根据权利要求5所述降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法，其特征在于，所述步骤2)中所述蜡质芽胞杆菌的接入量为：每升发酵液补入50毫升，单位活菌数为107～108cfu。
8.根据权利要求7所述降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法，其特征在于，在所述步骤2)中接入蜡质芽胞杆菌后，调整搅拌转速通气量，使溶氧控制在10％～50％，罐温30℃，发酵12小时。
9.一种根据权利要求1～8任一项所述降低井冈霉素发酵液残糖浓度的方法获得的井冈霉素发酵液，其特征在于，所述井冈霉素发酵液中残糖浓度的比例为低于0.6％重量。
10.根据权利要求9井冈霉素发酵液，其特征在于，所述井冈霉素发酵液中残糖浓度的比例为低于0.5％重量。
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