CN110358798A - 一种发酵生产井冈霉素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种发酵生产井冈霉素的方法，属于抗生素生产技术领域，所述方法包括以下步骤：向发酵培养基中接种发酵菌种、添加中温a‑淀粉酶后进行发酵；所述发酵菌种为吸水链霉菌井冈变种，所述吸水链霉菌井冈变种的保藏号为CGMCC No.6636；所述中温a‑淀粉酶的酶活力单位为(1～5)×103U/g；所述中温a‑淀粉酶的质量与发酵培养基的质量比为1：(166～833)。本发明提供的方法，在保证井冈霉素产量不受影响的前提下，降低了成本，缩短了发酵周期，可大大降低无菌空气使用量，减少用电量，节约能源。

Description

一种发酵生产井冈霉素的方法
技术领域
本发明属于抗生素生产技术领域，尤其涉及一种发酵生产井冈霉素的方法。
背景技术
井冈霉素又称有效霉素，是一种放线菌产生的抗生素，具有较强的内吸性，易被菌体细胞吸收并在其内迅速传导，干扰和抑制菌体细胞生长和发育，属低毒杀菌剂。井冈霉素作为氨基糖苷类化合物，工业化生产中使用大米粉作为发酵培养基，大米粉经过高温消毒后粘度较大，造成氧气传递困难，为保证氧气供应，需加大通气量，造成能源的浪费。
为解决这一问题，可以采用培养基灭菌前用液化淀粉酶进行液化(使用大米粉液化糖化液发酵井冈霉素A，农药，2003年第5期)，存在问题是灭菌过程中泡沫较多，难以控制，而且液化过程需在发酵罐或者配料装置中进行，液化过程需要一定的温度，液化过程需要一定的时间，增加了能源消耗、操作工序及设备占用，该工艺在工业上应用存在困难。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种发酵生产井冈霉素的方法，所述方法成本低、能耗低、生产周期短。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种发酵生产井冈霉素的方法，包括以下步骤：
向发酵培养基中接种发酵菌种、添加中温a-淀粉酶后进行发酵；
所述发酵菌种为吸水链霉菌井冈变种，所述吸水链霉菌井冈变种的保藏号为CGMCC No.6636；
所述中温a-淀粉酶的酶活力单位为(1～5)×103U/ml；
所述中温a-淀粉酶的质量与发酵培养基的质量比为1：(166～833)。
优选的，所述中温a-淀粉酶在添加到发酵培养基之前进行过滤除菌。
优选的，所述过滤除菌的滤膜孔径为0.22μm。
优选的，所述发酵过程中进行通气，所述通气的通气量为2500～3500m3/h。
优选的，所述发酵过程中进行搅拌，所述搅拌的转速为100～150rpm。
优选的，所述发酵的时间为45～50h。
优选的，所述发酵的温度为38～42℃。
优选的，所述发酵菌种的接种量为5％～15％。
优选的，所述发酵培养基以水为溶剂，每升发酵培养基中包括以下组成：大米粉70～120g、花生饼粉20～30g、NaCl 1～2g、CaCl21～2g、KH2PO41～3g。
优选的，所述发酵培养基的pH值为7～8。
本发明的有益效果：本发明提供的发酵生产井冈霉素的方法，在接种发酵菌种的同时向所述发酵培养基中添加中温a-淀粉酶；在发酵的同时进行培养基中大米粉的液化，能够在不加大通气量的前提下，保证氧气供应，同时解决了直接采用大米粉液化糖化液作为培养基灭菌时泡沫无法控制的问题。本发明提供的方法，在保证井冈霉素产量不受影响的前提下，降低了成本，缩短了发酵周期，可大大降低无菌空气使用量，减少用电量，节约能源。
附图说明
图1为本发明提供的发酵生产井冈霉素的发酵装置简图，其中1为补料瓶(装中温a-淀粉酶)，2为蠕动泵，3为0.22μm微孔滤膜，4为发酵罐，5为种子罐。
生物保藏说明
本发明提供的吸水链霉菌井冈变种Streptomyces hygroscopicusvar.jinggangensis hfjg01保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.6636，保藏地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年09月26日。
具体实施方式
本发明提供了一种发酵生产井冈霉素的方法，包括以下步骤：向发酵培养基中接种发酵菌种、添加中温a-淀粉酶后进行发酵。
在本发明中，所述发酵菌种为吸水链霉菌井冈变种，所述吸水链霉菌井冈变种的保藏号为CGMCC No.6636；在本发明中，所述中温a-淀粉酶的酶活力单位为(1～5)×103U/ml，优选的为(2～3)×103U/ml；所述中温a-淀粉酶的质量与发酵培养基的质量比为1：(166～833)，优选为1：(277～417)。本发明中，所述中温a-淀粉酶在添加到发酵培养基之前优选的进行过滤除菌，所述过滤除菌的滤膜孔径优选为0.22μm。在本发明中，所述中温a-淀粉酶优选的置于补料瓶中，通过蠕动泵泵入到发酵培养基中；在本发明中，所述中温a-淀粉酶优选的购自山东隆科特生物科技有限公司。
在本发明中，所述发酵菌种的接种量优选为5％～15％，更优选为8％～12％。本发明对所述发酵菌种的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的发酵菌种种子液的制备方法即可。本发明在所述发酵过程中优选的进行通气，所述通气的通气量优选为2500～3500m3/h，更优选为2800～3200m3/h；在本发明中，所述发酵过程中优选的进行搅拌，所述搅拌的转速优选为100～150rpm，更优选为110～130rpm；在本发明中，所述发酵的时间优选为45～50h，更优选为46～49h；所述发酵的温度优选为38～42℃，更优选为39～41℃。
在本发明中，所述发酵培养基以水为溶剂，每升发酵培养基中优选的包括以下组成：大米粉70～120g、花生饼粉20～30g、NaCl 1～2g、CaCl2 1～2g，KH2PO4 1～3g，更优选为包括以下组成：大米粉80～110g、花生饼粉22～28g、NaCl 1.5g、CaCl2 1.5g，KH2PO4 2g。在本发明中，所述发酵培养基的pH值优选为7～8。在本发明中，所述发酵培养基优选的进行蒸汽灭菌后使用，本发明对所述蒸汽灭菌的方法没有特殊限定，采用本领域常规的蒸汽灭菌即可。在本发明中，所述发酵优选的在发酵罐中进行；本发明对所述发酵罐的体积没有特殊要求，采用本领域常规生产中发酵罐的体积即可；所述发酵罐的装液量优选的为发酵罐体积的70％～80％，更优选为72％～78％。在本发明具体实施过程中，所述发酵罐的体积为60吨，所述发酵罐的装液量优选为44～47吨。
本发明在所述发酵结束后，优选的进行放罐；测定井冈霉素的效价和放罐体积。在本发明中，所述井冈霉素的效价测定优选的采用采用液相法，具体步骤参见GB/T 34155-2017。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例、对比例以及试验例中发酵使用的发酵罐的体积为60吨，装液量为46吨。井冈霉素效价采用液相法，参见GB/T 34155-2017。井冈霉素发酵产量的计算通过以下公式进行：井冈霉素发酵产量＝井冈霉素效价×放罐体积。
实施例1～4使用的发酵装置如图1所示，其中1为补料瓶(装中温a-淀粉酶)，2为蠕动泵，3为0.22μm微孔滤膜，4为发酵罐，5为种子罐。
本发明中菌种的活菌浓度采用离心法，取样品10mL，放在刻度离心管中，用转速3000转每分的离心机分离约10min，然后计算菌丝体的百分数(V/V)。
实施例1
1)将吸水链霉菌井冈变种菌株接种至液体发酵培养基中，控制接种量为7％，发酵温度为40℃；每升液体发酵培养基含有大米粉70g、花生饼粉30g、NaCl 2g、CaCl2 2g、KH2PO43g，发酵培养基的pH值为8.0。同时，取1×103U/g的中温a-淀粉酶19.0kg，通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，通过蠕动泵泵入发酵罐中。
2)发酵过程中控制通气量为2500m3/h，搅拌转速120rpm。
3)培养45h，停止发酵，测定单位效价，放罐体积，记录试验前后的电表数值，计算用井冈霉素发酵产量、用电量。
结果，效价为22600ug/mL，放罐体积43.6吨，发酵产量985.4kg，用电量为7800KW·h。
实施例2
1)将吸水链霉菌井冈变种菌株接种至液体发酵培养基中，控制接种量为10％，发酵温度为38℃；每升液体发酵培养基含有大米粉120g、花生饼粉20g、NaCl 1g、CaCl2 1g、KH2PO4 1g，发酵培养基的pH值为7.0。同时，取5×103U/g的中温a-淀粉酶6.5kg，通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，通过蠕动泵泵入发酵罐中。
2)发酵过程中控制通气量为3000m3/h，搅拌转速100rpm。
3)培养45h，停止发酵，测定单位效价，放罐体积，记录试验前后的电表数值，计算用井冈霉素发酵产量、用电量。
结果，效价为24800ug/mL，放罐体积43.1吨，发酵产量1069kg，用电量为7703KW·h。
实施例3
1)将吸水链霉菌井冈变种菌株接种至液体发酵培养基中，控制接种量为12％，发酵温度为40℃；每升液体发酵培养基含有大米粉100g、花生饼粉25g、NaCl 1.5g、CaCl2 1g、KH2PO4 2g，发酵培养基的pH值为7.2。同时，取2×103U/g的中温a-淀粉酶13.5kg，通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，通过蠕动泵泵入发酵罐中。
2)发酵过程中控制通气量为3500m3/h，搅拌转速150rpm。
3)培养48h，停止发酵，测定单位效价，放罐体积，记录试验前后的电表数值，计算用井冈霉素发酵产量、用电量。
结果，效价为25100ug/mL，放罐体积42.4吨，发酵产量1064kg，用电量为9680KW·h。
实施例4
1)将吸水链霉菌井冈变种菌株接种至液体发酵培养基中，控制接种量为15％，发酵温度为40℃；每升液体发酵培养基含有大米粉90g、花生饼粉27g、NaCl 2g、CaCl2 1.5g、KH2PO4 2g，发酵培养基的pH值为8.0。同时，取3×103U/g的中温a-淀粉酶8.1kg，通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，通过蠕动泵泵入发酵罐中。
2)发酵过程中控制通气量为2800m3/h，搅拌转速120rpm。
3)培养46h，停止发酵，测定单位效价，放罐体积，记录试验前后的电表数值，计算用井冈霉素发酵产量、用电量。
结果，效价为24600ug/mL，放罐体积43.1吨，发酵产量1060kg，用电量为8120KW·h。
对比例1
1)将吸水链霉菌井冈变种菌株接种至液体发酵培养基中，控制接种量为5％，发酵温度为42℃；每升液体发酵培养基含有大米粉120g、花生饼粉30g、NaCl 2g、CaCl2 2g、KH2PO4 3g，发酵培养基的pH值为7.5。
2)发酵过程中控制通气量为3500m3/h，搅拌转速150rpm。
3)培养50h，停止发酵，测定效价，放罐体积，记录试验前后的电表数值，计算井冈霉素发酵产量、用电量。
结果，效价为25300ug/mL，放罐体积42.3吨，发酵产量1070kg，用电量为9720KW·h。
引用对比例1的条件，对部分参数进行调整，进行对比试验，除标示的条件差异以外，其余条件控制一致。
试验例1
1)将吸水链霉菌井冈变种菌株接种至液体发酵培养基中，控制接种量为15％，发酵温度为40℃；每升液体发酵培养基含有大米粉120g、花生饼粉30g、NaCl 2g、CaCl2 2g、KH2PO4 3g，发酵培养基的pH值为8。
2)发酵过程中控制通气量为3500m3/h，搅拌转速150rpm。
3)培养50h，停止发酵，测定单位效价，放罐体积，记录试验前后的电表数值，计算用电量。
试验例2
1)将吸水链霉菌井冈变种菌株接种至液体发酵培养基中，控制接种量为15％，发酵温度为40℃；每升液体发酵培养基含有大米粉120g、花生饼粉30g、NaCl 2g、CaCl2 2g、KH2PO4 3g，发酵培养基的pH值为8，测定发酵液效价。
2)发酵过程中通气量为3300m3/h，搅拌转速150rpm。
3)培养45h，停止发酵，测定单位效价，放罐体积，记录试验前后的电表数值，计算用电量。
试验例3
1)将吸水链霉菌井冈变种菌株接种至液体发酵培养基中，控制接种量为15％，发酵温度为40℃；每升液体发酵培养基含有大米粉120g、花生饼粉30g、NaCl 2g、CaCl2 2g、KH2PO4 3g，发酵培养基的pH值为8。
同时，取2×103单位/g的中温a-淀粉酶16.2kg，通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，通过蠕动泵泵入发酵罐中。
2)发酵过程中控制通气量为2500m3/h，搅拌转速100rpm。
3)培养46h，停止发酵，测定效价，放罐体积，记录试验前后的电表数值，计算用电量。
试验例1～3的结果见表1，与试验例1相比，试验例2中通气低5.7％，产量却低28.6％，说明在搅拌转速为150rpm情况下，3500m3/h通气量为保证井冈霉素产量的最低通气量。试验例3中，添加了中温a-淀粉酶，尽管大幅度降低了通气量和搅拌转速，但井冈霉素发酵产量并未降低，采用该方法，用电量节省30％，具有较好的经济性。
表1不同条件下井冈霉素产量及用电量
由上述实施例可知，本发明提供的发酵生产井冈霉素的方法，在保证井冈霉素产量不受影响的前提下，可大大降低无菌空气使用量，减少用电量，节约能源。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种发酵生产井冈霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
向发酵培养基中接种发酵菌种、添加中温a-淀粉酶后进行发酵；
所述发酵菌种为吸水链霉菌井冈变种，所述吸水链霉菌井冈变种的保藏号为CGMCCNo.6636；
所述中温a-淀粉酶的酶活力单位为(1～5)×103U/g；
所述中温a-淀粉酶的质量与发酵培养基的质量比为1:(166～833)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中温a-淀粉酶在添加到发酵培养基之前进行过滤除菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述过滤除菌使用的滤膜孔径为0.22μm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中进行通气，所述通气的通气量为2500～3500m3/h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中进行搅拌，所述搅拌的转速为100～150rpm。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述发酵的时间为45～50h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为38～42℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵菌种的接种量为5％～15％。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基以水为溶剂，每升发酵培养基中包括以下组成：大米粉70～120g、花生饼粉20～30g、NaCl 1～2g、CaCl21～2g、KH2PO41～3g。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH值为7～8。
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CN111647535A (zh) * 2020-06-18 2020-09-11 浙江省桐庐汇丰生物科技有限公司 一株生产井冈霉素的吸水链霉菌突变株及其应用

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