CN111647535A

CN111647535A - 一株生产井冈霉素的吸水链霉菌突变株及其应用

Info

Publication number: CN111647535A
Application number: CN202010558185.3A
Authority: CN
Inventors: 殷红福; 王佳; 包霞霞; 申屠罗凤; 李忠; 倪烈
Original assignee: Zhejiang Tonglu Huifeng Bioscience Co ltd
Current assignee: Zhejiang Tonglu Huifeng Bioscience Co ltd
Priority date: 2020-06-18
Filing date: 2020-06-18
Publication date: 2020-09-11

Abstract

本发明提供了一株生产井冈霉素的吸水链霉菌突变株及其应用，属于井冈霉素生产技术领域，本发明提供的生产井冈霉素的吸水链霉菌突变株HF‑1823，保藏编号为CGMCC No.19793；突变株HF‑1823是以吸水链霉菌井冈变种hfgj‑01为出发菌株经过微波诱变、ARTP诱变和抗性筛选获得。本发明所述的突变株HF‑1823生产的井冈霉素中活性成分井冈霉素A含量高，非活性成分井冈羟胺A的含量显著降低。同时本发明提供的突变株HF‑1823遗传稳定性好，传至四代产井冈霉素水平与第一代相当；能够应用于井冈霉素的工业化生产中。

Description

一株生产井冈霉素的吸水链霉菌突变株及其应用

技术领域

本发明属于井冈霉素生产技术领域，尤其涉及一株生产井冈霉素的吸水链霉菌突变株及其应用。

背景技术

井冈霉素是一种放线菌产生的抗生素，具有较强的内吸性，易被菌体细胞吸收并在其内迅速传导，干扰和抑制菌体细胞生长和发育。井冈霉素是一种农用抗生素，主要用于水稻纹枯病，也可用于水稻稻曲病、玉米大小斑病以及蔬菜和棉花、豆类等作物病害的防治。多年大规模的田间使用结果充分显示其“防效高、无药害、无污染”的环保型农药的特点，深受国内外用户欢迎。井冈霉素已成为当今产量和使用面积最大的生物杀菌剂之一。

井冈霉素属于氨基糖苷类物质，主要由A、B、C、D、E、F等组分组成，井冈羟胺是井冈霉素生物合成的中间产物，高含量井冈霉素A应用前景十分广阔，井冈霉素A对纹枯病的防治作用最强，井冈羟胺A直接使用效果较差，井冈霉素A与井冈羟胺A的结构类似，难以通过离子交换树脂等方法去除，井冈羟胺A的存在使产品中井冈霉素A纯度维持在60％～70％，难以提高，影响了产品的进一步应用，因此，减少发酵液中井冈羟胺A的含量具有迫切性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株生产井冈霉素的吸水链霉菌突变株及其应用；所述突变株能够生产发酵生产井冈霉素，产量高，并且发酵液中井冈羟胺A的含量低；发酵液中井冈羟胺A/井冈霉素A比值低。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一株生产井冈霉素的吸水链霉菌井冈变种(Streptomyceshygroscopicus var.jinggangensis)突变株HF-1823，保藏编号为CGMCC No.19793。

本发明提供了所述的突变株HF-1823在生产井冈霉素中的应用。

优选的，包括以下步骤：

1)将所述突变株HF-1823活化、种子培养后获得种子液；

2)将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养获得发酵液。

优选的，所述种子培养的温度为39～41℃，所述种子培养的转速为220～260rpm，所述种子培养的时间为18～20h。

优选的，所述种子培养的培养基，以水为溶剂，每升包括以下质量的组分：大米粉35～45g，酵母粉15～25g，NaCl 0.2～0.4g，CaCO₃0.4～0.6g，KH₂PO₄0.2～0.4g。

优选的，步骤2)中所述种子液的接种量为5％～10％(V/V)。

优选的，步骤2)中所述发酵培养的通气比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)；所述发酵培养的搅拌转速为160～200rpm；所述发酵培养的温度为39～41℃，所述发酵培养的时间为35～40h。

优选的，所述发酵培养基，以水为溶剂，每升包括以下质量的组分：大米粉80～120g，花生饼粉22～28g，NaCl 0.2～0.4g，CaCO₃0.2～0.4g，KH₂PO₄0.2～0.4g，消泡剂0.08～0.12g。

本发明的有益效果：本发明提供了一株生产井冈霉素的吸水链霉菌突变株HF-1823，保藏编号为CGMCC No.19793；所述突变株HF-1823是以吸水链霉菌井冈变种hfgj-01为出发菌株经过微波诱变、ARTP诱变和抗性筛选获得。本发明所述的突变株HF-1823发酵液中国井冈霉素A的含量比出发菌株hfgj-01发酵液中井冈霉素A的含量高36.82％，发酵液中井冈羟胺A/井冈霉素A的比值比hfgj-01菌株低39.86％。本发明提供的突变株HF-1823生产的井冈霉素中活性成分井冈霉素A含量高，非活性成分井冈羟胺A的含量显著降低。同时本发明提供的突变株HF-1823遗传稳定性好，传至四代产井冈霉素水平与第一代相当；能够应用于井冈霉素的工业化生产中。

附图说明

图1为不同微波诱变时间下致死率(％)

图2为不同ARTP处理时间下致死率(％)

图3为为井冈羟胺A及井冈霉素A的液相标准谱图。

生物保藏说明

生产井冈霉素的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicusvar.jinggangensis)突变株HF-1823保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.19793，保藏日期为2020年5月9日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

吸水链霉菌井冈变种(Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis)hfgj-01保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.6636，保藏日期为2012年09月26日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

本发明提供了一株生产井冈霉素的吸水链霉菌井冈变种(Streptomyceshygroscopicusvar.jinggangensis)突变株HF-1823，保藏编号为CGMCC No.19793。

在本发明中，所述突变株HF-1823是以吸水链霉菌井冈变种hf gj-01为出发菌株经过微波诱变、ARTP诱变和抗性筛选获得。在本发明中，所述吸水链霉菌井冈变种(Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis)hf gj-01保藏编号为CGMCCNo.6636。

在本发明中，所述微波诱变的功率优选为650～750W，更优选为700W，所述微波诱变的脉冲频率为2400～2500MHz，更优选为2450MHz；本发明在所述微波诱变后优选的进行筛选，筛选井冈霉素A产量最好的突变株进行后续的ARTP(常压室温等离子诱变)诱变。

本发明在进行ARTP诱变前优选的制作致死曲线，所述致死曲线的制作方法优选的如下：固定ARTP诱变的功率、气量和处理距离，以不同的处理时间处理待诱变菌株的菌悬液，将处理后的菌悬液进行培养后活菌计数，以处理时间为纵坐标，活菌数为横坐标，绘制致死曲线。本发明在获得致死曲线后，选择致死率为85％～90％范围内的处理时间，处理待诱变菌株的菌悬液。本发明在所述ARTP诱变后，筛选井冈霉素A产量高并且井冈羟胺A的产量低的突变株进行后续的抗性筛选。

在本发明中，所述抗性筛选优选的为用高纯度、杂质含量低的代谢类似物处理菌株，在本发明中，所述代谢类似物优选为硫酸链霉素；所述代谢类似物能够杀死或抵制绝大多细胞的繁殖，能够筛选出大量产生大量产生该代谢物的抗反馈突变株。

本发明还提供了所述的突变株HF-1823在生产井冈霉素中的应用。

在本发明中，所述应用包括以下步骤：1)将所述突变株HF-1823活化、种子培养后获得种子液；2)将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养获得发酵液。

在本发明中，将所述突变株HF-1823活化、种子培养后获得种子液。在本发明中，所述活化优选的在高氏一号斜面培养基上进行，所述活化的温度优选为27～29℃，更优选为28℃，所述活化的时间优选为4～6d，更优选为5d。本发明在所述活化结束后，优选的用水将培养基上生长的菌苔洗下获得菌悬液。在本发明中，所述菌悬液孢子浓度优选为(0.5～5)×10⁸个/mL，更优选为1×10⁸个/mL。

本发明在获得所述菌悬液后，将所述菌悬液接种值种子培养基中进行种子培养。在本发明中，所述种子培养的温度优选为39～41℃，更优选为40℃；所述种子培养的转速优选为220～260rpm，更优选为240rpm；所述种子培养的时间优选为18～20h。在本发明中，所述种子培养的培养基，以水为溶剂，每升优选的包括以下质量的组分：大米粉35～45g，酵母粉15～25g，NaCl0.2～0.4g，CaCO₃0.4～0.6g，KH₂PO₄0.％～0.4g；更优选的包括大米粉40g，酵母粉20g，NaCl 0.3g，CaCO₃0.5g，KH₂PO₄0.3g。在本发明中，种子液经4000rpm离心10min后，获得的沉淀的体积优选的占总体积的40％～60％。在本发明中，所述种子培养优选的在种子发酵罐中进行。

本发明在获得所述种子液后，将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养获得发酵液。在本发明中，所述发酵培养的通气比优选为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)，更优选为1:1；所述发酵培养的搅拌转速优选为160～200rpm，更优选为180rpm；在本发明中所述发酵培养的温度优选为39～41℃，更优选为40℃，所述发酵培养的时间优选为35～40h。在本发明中，所述发酵培养基，以水为溶剂，每升优选的包括以下质量的组分：大米粉80～120g，花生饼粉22～28g，NaCl 0.2～0.4g，CaCO₃0.2～0.4g，KH₂PO₄0.2～0.4g，消泡剂0.08～0.12g，更优选的包括大米粉100g，花生饼粉25g，NaCl 0.3g，CaCO₃0.3g，KH₂PO₄0.3g，消泡剂0.1g。在本发明中，获得的发酵液中井冈霉素的含量在30000μg/mL以上，所述发酵液中井冈羟胺A/井冈霉素A优选的≤12.77％。在本发明中，所述发酵液中的将冈霉素A以及井冈羟胺A的含量测定优选的采用高效液相色谱进行。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.微波处理菌悬液

取吸水链霉菌井冈变种hfgj-01的斜面孢子，置于含有玻璃珠的无菌水中，孢子浓度在5×10⁷个/mL，充分摇匀打散，注入底部平整的平皿中，每个平皿的悬液量为10mL，调整微波功率为700W，脉冲频率为2450MHz。

微波处理时间不同，对hfgj-01的突变率也不同。处理时间过长，正突变很低，将1s、3s、5s、8s、10s诱变后的菌悬液稀释进行平板计数，平板培养基为高氏一号培养基，计算致死率，选取致死率在85％～90％对应的诱变时间重新诱变，超声处理5s，致死率为88.5％，选取诱变时间为5S，在诱变后的菌悬液中，吸取0.1mL处理后的菌悬液至无菌试管中，加入0.9mL无菌水混匀，以此管为10^-1管，依次做10倍稀释涂布。28℃恒温培养5天，观察长势，挑选菌落直径大、长势快、吸水快的、菌苔饱满中间凸起的菌落进行摇瓶筛选，获得一株HF-18菌株，产量与出发菌株(hfgj-01)相比，井冈霉素单位产量(μg/mL)高出10.9％。

2.ARTP(常压室温等离子体)诱变

经过微波诱变后的菌株，大多数细胞死亡，但有少数细胞中的DNA发生突变，将这些突变后的菌株再次进行ARTP诱变，可以影响DNA损伤的修复作用，使之出现更多的差错，提高诱变率，其诱变频率高且不易回复，ARTP产生的活性粒子能够对菌株的遗传物质产生损伤，并诱发生物细胞启动SOS修复机制，SOS修复过程作为一种高容错率修复，修复过程会产生丰富的错配位点，并最终稳定遗传进而形成突变株，有利于正突变型的产生，且筛选的菌株遗传稳定性好。

将培养好的HF-18斜面孢子刮下制成5×10⁷个/mL单孢子悬液，取10μL均匀涂布于已灭菌的金属载片上中，进行ARTP(功率100W，气量8L/min，处理距离2mm)，处理时间分别为0，10，20，40，80，120，150s，然后取经过不同处理时间的菌悬液0.1mL到平板培养基上28℃恒温培养5d，待菌落长出后进行活菌计数，并绘制致死曲线，在得到致死曲线后，用致死率在85％～90％处理时间处理菌株，处理80s，致死率为86.80％，将菌株孢子用ARTP处理80s，将处理过菌株稀释并涂布到含高氏一号培养基的平板上，28℃恒温培养5d，将长出的菌落编号摇瓶测定井冈霉素A的含量及井冈羟胺A的含量，获得一株HF-182菌株，摇瓶比HF-18菌株产井冈霉素A含量高8.7％。

3.通过抗性筛选得到高产井冈霉素A、井冈羟胺A组份低的菌株

本发明抗性筛选机理：井冈霉素A为氨基糖苷类抗生素，是放线菌的次级代谢产物，其代谢途径复杂，抗生素发酵受反馈抑制非常明显，特别是氨基糖苷类抗生素。次级代谢产物是某些生物为了避免在初级代谢过程中某些中间产物积累所造成的不利作用而产生的一类有利于生存的代谢类型。当菌体生长的环境中营养物质不均衡时，即某些营养过剩、某些营养缺乏，菌体不能有效的摄入营养，在代谢系统的作用下，其生长繁殖速率下降，并通过代谢途径的改变将过剩的营养物质转变成与生长繁殖无关的次级代谢产物。因此，在筛选菌株时，我们就以消除初级代谢产物对那些共同中间体的反馈调节，使之大量积累，这样就有利于井冈霉素A的合成，降低杂质含量。

将HF-182菌株进行抗性筛选，用高纯度硫酸链霉素(标准品)按不同浓度(有效含量0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2μg/mL)放入高氏一号培养基中共培养，，从而杀死或抵制绝大多细胞的繁殖，选出有150株该代谢物的抗反馈突变株。将这150株菌体在正常斜面上扩增，经过摇瓶发酵筛选，获得1株正突变株HF-1823菌株，该菌株产井冈霉素A的含量比HF-182菌株高15.2％，产井冈羟胺A的含量比HF-182菌株低30.86％。

4.菌株的鉴定

该菌株出发菌株为吸水链霉菌，革兰氏阳性菌，通过复合诱变后，该菌株形态孢子丝螺旋形，孢子卵圆形，表面光滑，菌落为鼠灰色，色素透入培养基内，基丝为深褐色，气丝鼠灰色。形态与出发菌株相同，未出现菌属的改变，菌株鉴定仍为吸水链霉菌。

5.菌株的遗传稳定性

将改良菌种HF-1823接斜面进行传代实验，以检验改良菌株的遗传稳定性，经传4代验证实验显示该菌株稳定性良好。

表1为HF-1823菌株的传代稳定性考核

数据显示，HF-1823菌株传至四代产井冈霉素水平与第一代相当，证明该菌株遗传稳定，可作为生产菌种投入生产。

表1 HF-1823菌株的传代稳定性情况

实施例2

利用突变株HF-1823生产井冈霉素

1)菌株活化

将保藏的菌株在高氏一号斜面培养基上活化，28℃培养5d，用适量无菌水将菌苔洗下，得到种子菌悬液，菌悬液孢子浓度约1×10⁸个/mL；

2)种子培养

将步骤1)所得种子100mL菌悬液接入种子发酵罐，240rpm，40℃培养19h，种子培养基成分为：大米粉4.0％，酵母粉2％，NaCl 0.03％，CaCO₃0.05％，KH₂PO₄0.03％，余量为水，各成分的含量均按质量体积比计算。

3)发酵培养

将步骤2)种子发酵液培养至：以4000rpm离心机离心所述种子发酵液10min，获得的菌体沉淀的体积占总体积的百分比为40％～60％时，移入大罐发酵罐中培养，设置发酵参数为：通气比1:1，搅拌速度180rpm，发酵温度40℃，培养时间38h，放罐后得到含有井冈霉素的发酵液，发酵培养基的成分为：大米粉10％，花生饼粉2.5％，NaCl 0.03％，CaCO₃003％，KH₂PO₄0.03％，消泡剂0.01％，余量为水，各成分的含量均按质量体积比。

4)放罐有效含量及杂质含量的HPLC检测

放罐样用3mol/L稀盐酸调PH值为3.0～3.5，加热到80℃，保温3min，用中速滤纸过滤，滤液用去离子水稀释500倍后用液相法检测，检测方法参照GB/T 34155-2017中液相检测方法。

5)数据分析

在色谱工作站调出3种浓度的标样图谱，进行较准、绘制标准曲线，标准谱图见图3，其中保留时间3.736min为井冈羟胺A，保留时间5.917min为井冈霉素A。根据井冈霉素A、井冈羟胺A的峰面积计算井冈羟胺A/井冈霉素A的含量比，同时根据对照和标准曲线计算井冈霉素A的含量，检测三批次生产的数据，同时以出发菌株为对照，结果见表2。

表2 HF-1823菌株与对照菌株的不同批次的试验数据

由表2数据显示，CK菌株生产的发酵液中井冈霉素A含量平均为2.246％，井冈羟胺A/井冈霉素A平均为20.85％；HF-1823菌株生产的发酵液中井冈霉素A含量平均为3.073％，井冈羟胺A/井冈霉素A平均为12.54％；HF-1823菌株的井冈霉素A含量比CK菌株提高了36.82％，井冈羟胺A/井冈霉素A降低了39.86％。

由上述实施例可知，本发明提供的突变株HF-1823生产的井冈霉素中活性成分井冈霉素A含量高，非活性成分井冈羟胺A的含量显著降低，能够应用于井冈霉素的工业化生产中。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一株生产井冈霉素的吸水链霉菌井冈变种(Streptomyces hygroscopicusvar.jinggangensis)突变株HF-1823，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.19793。

2.权利要求1中所述的突变株HF-1823在生产井冈霉素中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)将所述突变株HF-1823活化、种子培养后获得种子液；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述种子培养的温度为39～41℃，所述种子培养的转速为220～260rpm，所述种子培养的时间为18～20h。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述种子培养的培养基，以水为溶剂，每升包括以下质量的组分：大米粉35～45g，酵母粉15～25g，NaCl 0.2～0.4g，CaCO₃0.4～0.6g，KH₂PO₄0.2～0.4g。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述种子液的接种量为5％～10％(V/V)。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述发酵培养的通气比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)；所述发酵培养的搅拌转速为160～200rpm；所述发酵培养的温度为39～41℃，所述发酵培养的时间为35～40h。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基，以水为溶剂，每升包括以下质量的组分：大米粉80～120g，花生饼粉22～28g，NaCl0.2～0.4g，CaCO₃0.2～0.4g，KH₂PO₄0.2～0.4g，消泡剂0.08～0.12g。