CN102191302A - 一种提高井冈霉素发酵水平的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高井冈霉素发酵水平的生产方法,包括:第一步,将在菌种室制备好的孢子悬浮液接种于种子罐内已灭菌的种子培养基中进行培养,得到成熟的种子培养液;第二步,将成熟的种子培养液用差压法移种入发酵罐内已灭菌的发酵培养基中进行发酵培养,发酵过程中当总糖浓度以质量百分数计低于4.0%时,流加或分批补入适量的碳源,实现井冈霉素的发酵生产。本发明明确了碳源的品种、补入时机和补入方式,根据碳源不同的补入量,可以把发酵周期由原来的40小时左右延长至65~100小时,发酵水平有原来的16~18g/L(A组分)提高至25g/L(A组分)以上,较大幅度地提高了井冈霉素的发酵水平。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物工程技术领域的方法,具体是一种提高井冈霉素发酵水平的生产方法。
背景技术
井冈霉素,国外又称有效霉素,是由吸水链霉菌井冈变种产生的水溶性氨基糖苷类抗生素,是我国及东南亚水稻主产区用于防治水稻纹枯病的最佳生物农药之一,具有高效、低毒、无残留等特点,对环境友好,无真菌抗药性发生。目前在我国农业生产的使用面积已达2亿亩,是我国使用最广泛的一种农用抗生素。同时它还是用于生产阿卡波糖(拜糖平)和伏格列波糖(倍欣)两种糖尿病临床用药的直接原料。
在井冈霉素近40年的工业化生产进程中,人们大多是通过菌种改造和培养基优化的手段来提高井冈霉素的发酵水平,通过许多专家和技术人员长期来的不懈努力,发酵水平取得从最初的0.8g/L提升至16~18g/L的巨大飞跃,但目前仍存在发酵周期短、发酵生产水平停滞不前的缺陷。期望在现有的培养基内增加碳、氮源等营养物质的量来达到延缓菌丝体衰老、延长发酵周期、提高发酵水平的目的,可能会带来一定难度。一方面,如果培养基中物料浓度过高,料液过于粘稠,不仅增加了搅拌动力能耗,同时带来灭菌困难,从而造成发酵受杂菌污染而导致发酵失败,给大生产造成大的损失;另一方面,培养基中的物料浓度过高会带来渗透压过高的问题,会抑制和影响菌丝体前期的生长,影响了菌体的正常的生长和代谢,从而造成发酵异常。因此,如何延缓菌丝体衰老、延长发酵周期、提高发酵水平是井冈霉素生产中的需研究解决的一个重要的课题。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足,提供一种提高井冈霉素发酵水平的生产方法,该方法工艺路线合理,操作简便,能延缓井冈霉素菌丝体的衰老,延长发酵代谢的周期,从而较大幅度地提高了井冈霉素的发酵水平。
本发明解决技术问题所采用的技术方案如下:一种提高井冈霉素发酵水平的生产方法,包括以下步骤:第一步:将在菌种室制备好的孢子悬浮液接种于种子罐内已灭菌的种子培养基中进行培养,得到成熟的种子培养液;第二步:将成熟的种子培养液用差压法移种入发酵罐内已灭菌的发酵培养基中进行发酵培养,发酵过程中当总糖浓度以质量百分数计低于4.0%时,流加或分批补入适量的碳源,实现井冈霉素的发酵生产。
所述的孢子悬浮液制备方法是:在培养成熟的斜面种子的250ml孢瓶内,加入50ml无菌水,然后用竹签或接种针刮取培养基表面的孢子,混合后制成孢子悬浮液。
所述的种子培养基的配方以质量百分数计为:大米粉2.0%~6.0%,花生饼粉1.5%~3.0%,酵母粉0.5%~1.5%,磷酸二氢钾0.01%~0.02%,氯化钠0.01%~0.05%,消泡剂0.025%~0.05%,余量为水;消前pH自然。
所述的发酵培养基的配方以质量百分数计为:大米粉6%~10%,花生饼粉0.5%~2.0%,黄豆粕粉0.5%~1.5%,磷酸二氢钾0.01%~0.1%,氯化钠0.05%~0.15%,碳酸钙0.1%~0.5%,消泡剂0.025~0.05%,余量为水;消前pH7.0~7.5。
所述的第一步具体为:用2~3个250ml孢瓶内的孢子制成的孢子悬浮液接种于种子罐内的种子培养基中,接种后在温度为28~42℃,空气量为1∶0.3~0.5vvm的条件下培养24~48小时。
所述的第二步具体为:将培养成熟的种子培养液和发酵培养基按体积比1~2∶10的比例移种入发酵培养基中,移种后在温度为37~42℃,空气量为1∶0.5~1.0vvm的条件下发酵培养,当培养至总糖浓度以质量百分数计低于4.0%时,开始流加或间歇分批补入适量碳源,控制发酵中期的总糖浓度以质量百分数计为3.0%~4.0%之间,在发酵结束前12小时以上停止补料,培养65~100小时发酵结束。
所述的补入适量碳源的品种为下列之一:大米粉液化液或玉米淀粉液化液。
所述的大米粉液化液或玉米淀粉液化液的制备方法具体为:用自来水调大米粉或玉米淀粉至浆浓度以质量百分数计为30%~40%,加入以质量百分数计为0.2%~0.3%的氯化钙,搅拌,用液碱调pH至6.0~6.4,在每克大米粉或玉米淀粉中加入10~20u中温a—淀粉酶,升温至80℃保温,当液化澄清液与稀碘液反应呈红棕色时,液化结束,后升温至90℃以上保温10分钟杀酶,然后加入以质量百分数计为0.025%~0.05%的消泡剂,在121℃实罐蒸汽灭菌30分钟,制得大米粉液化液或玉米淀粉液化液,用作碳源补料液。
本发明在现有优化的工艺条件基础上,通过在发酵中间过程中补入适量的营养物质(碳源),既能解决了培养基灭菌困难的问题,又能确保菌丝体的正常生长和代谢,延长了菌体的生命周期,刺激了次级代谢物的分泌,提高了井冈霉素的发酵水平。本发明明确了碳源的品种、补入时机和补入方式,根据碳源不同的补入量,可以把发酵周期由原来的40小时左右延长至65~100小时,发酵水平有原来的16~18g/L(A组分)提高至25g/L(A组分)以上,较大幅度地提高了井冈霉素的发酵水平。
具体实施方式
下面以具体实例来进一步说明本发明的技术方案,但本发明的保护范围不限于此。
实施例1:
在2300L发酵罐上实施补加玉米淀粉液化液对发酵周期和发酵水平的影响考察。成熟的种子培养液移种入发酵罐内的已灭菌的发酵培养基内培养,当总糖浓度降至以质量百分数计为4.0%以下时,开始每隔6小时补加以质量百分数计为35%左右的玉米淀粉液化液,每次的补入量为15~30L,实施的步骤和结果如下。
⑴种子培养:
以250L罐为种子液培养罐,种子培养基为:大米粉6kg,花生饼粉3kg,酵母粉1kg,磷酸二氢钾20g,氯化钠30g,泡敌75g,加水定容130L,消前pH自然,在121℃温度下灭菌30分钟,灭菌后冷却至40℃,接入2个250ml孢瓶的孢子悬浮液,在37±2℃的温度、1∶0.5vvm的空气量的培养条件下培养28小时。
⑵以质量百分数计为35%左右的玉米淀粉液化液的制备:
以250L罐作为碳源补料罐,投入60kg的玉米淀粉,加水至140L,搅拌,加入0.4kg的氯化钙,用液碱调pH至6.2,加入400g中温a-淀粉酶(酶活:2000u/g),然后升温至80℃,保温,当液化澄清液与稀碘液反应呈红棕色时,液化结束,后升温至90℃以上保温10分钟杀酶,然后加入75g的泡敌,在121℃实罐蒸汽灭菌30分钟,降温后待用。
⑶发酵培养,以2300L罐进行发酵实施:
对照罐:发酵培养基为:大米粉120kg,花生饼粉15kg,黄豆粕粉15kg,磷酸二氢钾1kg,氯化钠1.5kg,碳酸钙2kg,泡敌0.75 kg,加水定容1300L,消前pH7.2,在121℃灭菌40分钟,灭菌后冷却至42℃时移入150L已培养好的种子培养液,在温度为40±2℃,空气量为1∶0.8vvm的条件下培养,当发酵培养至pH上升至7.2以上,菌体经显微镜镜检后发现有大部分自溶后中止发酵,取样测定井冈霉素发酵液A组分含量(HPLC法)。
补玉米淀粉液化液的发酵罐:计料体积、培养基配方、灭菌方式及培养条件与对照罐一致,当发酵培养至24~30小时左右,经测定总糖浓度以质量百分数计低于4.0%时,开始补入以质量百分数计为35%左右的玉米淀粉液化液,每次补入15~30L,每隔6小时补一次,控制总糖浓度以质量百分数计为3.0%~4.0%,共补6次,补料结束后,当pH上升至7.2以上后,菌丝体经显微镜镜检后发现有大部分自溶后中止发酵,取样测定井冈霉素发酵液A组分含量(HPLC法)。
⑷实施结果和分析:
经实施发现,通过在井冈霉素发酵过程中补入适量玉米淀粉液化液可以延缓井冈霉素菌丝体的衰老,发酵周期明显延长,对照罐在发酵44小时时pH已上升至7.4,菌丝体经显微镜镜检后大部分已自溶,所测定的发酵液A组分效价为17.8g/L,补入玉米淀粉液化液的罐,发酵周期可延长至69小时,所测定的发酵液A组分效价为27.5g/L,发酵周期延长了25小时,发酵生产水平比对照罐提高了54.5%。
实施例2:
在2300L发酵罐上实施补加大米粉液化液对发酵周期和发酵水平的影响考察。成熟的种子培养液移种入发酵罐内的已灭菌的发酵培养基内培养,当总糖浓度降至以质量百分数计为4.0%以下时,开始每隔6小时补加以质量百分数计为35%左右的大米粉液化液,每次的补入量为15~30L,实施的步骤和结果如下。
⑴种子培养:同实施例1。
⑵以质量百分数计为35%左右的大米粉液化液的制备:
以250L罐作为碳源补料罐,投入60kg的大米粉,加水至140L,搅拌,加入0.4kg的氯化钙,用液碱调pH至6.2,加入400g中温a-淀粉酶(酶活:2000u/g),然后升温至80℃,保温,当液化澄清液与稀碘液反应呈红棕色时,液化结束,后升温至90℃以上保温10分钟杀酶,然后加入75g的泡敌,在121℃实罐蒸汽灭菌30分钟,降温后待用。
⑶发酵培养,以2300L罐进行发酵实施:
对照罐:同实施例1。
补大米粉液化液的发酵罐:培养基配方、灭菌方式及培养条件与对照罐一致,当发酵培养至24~30小时左右,经测定总糖浓度以质量百分数计低于4.0%时,开始补入以质量百分数计为35%左右的玉米淀粉液化液,每次补入15~30L,每隔6小时补一次,控制总糖浓度以质量百分数计为3.0%~4.0%,共补6次,补料结束后,当pH上升至7.2以上后,菌丝体经显微镜镜检后发现有大部分自溶后中止发酵,取样测定井冈霉素发酵液A组分含量(HPLC法)。
⑷实施结果和分析:
经实施发现,通过在井冈霉素发酵过程中补入适量大米粉液化液可以延缓井冈霉素菌丝体的衰老,发酵周期明显延长,对照罐在发酵44小时时pH已上升至7.4,菌丝体经显微镜镜检后大部分已自溶,所测定的发酵液A组分效价为17.8g/L,补入大米粉液化液的罐,发酵周期可延长至74小时,所测定的发酵液A组分效价为31.4g/L,发酵周期延长了30小时,发酵生产水平比对照罐提高了76.4%。
实施例3:
在40m3发酵罐上实施补加大米粉液化液对发酵周期和发酵水平的影响考察。成熟的种子培养液移种入发酵罐内的已灭菌的发酵培养基内培养,当总糖浓度降至以质量百分数计为4.0%以下时,开始每隔6小时补加以质量百分数计为35%左右的大米粉液化液,每次的补入量为300~600L,共补4次,实施的步骤和结果如下。
⑴种子培养:
以7000L罐为种子液培养罐,种子培养基为:大米粉160kg,花生饼粉80kg,酵母粉30kg,磷酸二氢钾0.6kg,氯化钠0.8kg,泡敌1.5kg,加水定容3700L,消前pH自然,在121℃温度下灭菌30分钟,灭菌后冷却至40℃,接入3个250ml孢瓶的孢子悬浮液,在37±2℃的温度,1∶0.5vvm的空气量的培养条件下培养40小时。
⑵以质量百分数计为35%左右的大米粉液化液的制备:
以7000L罐作为碳源补料罐,投入2000kg的大米粉,加水至4700L,搅拌,加入12kg的氯化钙,用液碱调PH至6.2,加入15kg中温a-淀粉酶(酶活:2000u/g),然后升温至80℃,保温,当液化澄清液与稀碘液反应呈红棕色时,液化结束,后升温至90℃以上保温10分钟杀酶,然后加入2kg的泡敌,在121℃实罐蒸汽灭菌30分钟,降温后待用。
⑶发酵培养,以40m3罐进行发酵实施:
对照罐:发酵培养基为:大米粉2500kg,花生饼粉250kg,黄豆粕粉200kg,磷酸二氢钾20kg,氯化钠30kg,碳酸钙50kg,泡敌l2kg,加水定容25 m3,消前pH7.2,在121℃蒸汽灭菌40分钟,灭菌后冷却至42℃时移入4000L已培养好的种子培养液,在温度为40±2℃,空气量为1∶0.8vvm的条件下培养,当发酵培养至pH上升至7.2以上,菌体经显微镜镜检后发现有大部分自溶后中止发酵,取样测定井冈霉素发酵液A组分含量(HPLC法)。
补大米粉液化液的发酵罐:培养基配方、灭菌方式及培养条件与对照罐一致,当发酵培养至24~30小时左右,经测定总糖浓度以质量百分数计低于4.0%时,开始补入以质量百分数计为35%左右的大米粉液化液,每次补入300~600L,每隔6小时补一次,控制总糖浓度以质量百分数计为3.0%~4.0%,共补4次,补料结束后,当pH上升至7.2以上后,菌丝体经显微镜镜检后发现有大部分自溶后中止发酵,取样测定井冈霉素发酵液A组分含量(HPLC法)。
⑷实施结果和分析:
经实施发现,通过在井冈霉素发酵过程中补入适量大米粉液化液后可以延缓井冈霉素菌丝体的衰老,发酵周期明显延长,对照罐在40小时时pH已上升至7.4,菌丝体经显微镜镜检后大部分已自溶,所测定的发酵液A组分效价为16.3g/L,补入大米粉液化液的罐批,发酵周期可延长至65小时,所测定的发酵液A组分效价为25.8g/L,发酵周期延长了25小时,发酵生产水平比对照罐提高了58.3%。
实施例4:
在40m3发酵罐上实施补加大米粉粉液化液对发酵周期和发酵水平的影响考察。成熟的种子培养液移种入发酵罐内的已灭菌的发酵培养基内培养,当总糖浓度降至以质量百分数计为4.0%以下时,开始每隔6小时补加以质量百分数计为35%左右的大米粉液化液,每次的补入量为300~600L,共补8次,实施的步骤和结果如下。
⑴种子培养:同实施例3。
⑵以质量百分数计为35%左右的大米粉液化液的制备:同实施例3。
⑶发酵培养,以40 m3罐进行发酵实施:
对照罐:同实施例3。
补大米粉液化液的发酵罐:培养基配方、灭菌方式及培养条件与对照罐一致,当发酵培养至24~30小时左右,经测定总糖浓度以质量百分数计低于4.0%时,开始补入以质量百分数计为35%左右的大米粉液化液,每次补入300~600L,每隔6小时补一次,控制总糖浓度以质量百分数计为3.0%~4.0%,共补8次,补料结束后,当pH上升至7.2以上后,菌丝体经显微镜镜检后发现有大部分自溶后中止发酵,取样测定井冈霉素发酵液A组分含量(HPLC法)。
⑷实施结果和分析:
经实施发现,通过在井冈霉素发酵过程中补入适量大米粉液化液后可以延缓井冈霉素菌丝体的衰老,发酵周期明显延长,对照罐在40小时时pH已上升至7.4,菌丝体经显微镜镜检后大部分已自溶,所测定的发酵液A组分效价为16.3g/L,补入大米粉液化液8次的罐批,发酵周期可延长至85小时,所测定的发酵液A组分效价为34.1g/L,发酵周期延长了45小时,发酵生产水平比对照罐提高了109.2%,发酵水平有较大幅度的提高。
Claims (8)
1.一种提高井冈霉素发酵水平的生产方法,其特征在于,包括以下步骤:
第一步:将在菌种室制备好的孢子悬浮液接种于种子罐内已灭菌的种子培养基中进行培养,得到成熟的种子培养液;
第二步:将成熟的种子培养液用差压法移种入发酵罐内已灭菌的发酵培养基中进行发酵培养,发酵过程中当总糖浓度以质量百分数计低于4.0%时,流加或分批补入适量的碳源,实现井冈霉素的发酵生产。
2.根据权利要求1所述的一种提高井冈霉素发酵水平的生产方法,其特征是,所述的孢子悬浮液制备方法是:在培养成熟的斜面种子的250ml孢瓶内,加入50ml无菌水,然后用竹签或接种针刮取培养基表面的孢子,混合后制成孢子悬浮液。
3.根据权利要求1所述的一种提高井冈霉素发酵水平的生产方法,其特征是,所述的种子培养基的配方以质量百分数计为:大米粉2.0%~6.0%,花生饼粉1.5%~3.0%,酵母粉0.5%~1.5%,磷酸二氢钾0.01%~0.02%,氯化钠0.01%~0.05%,消泡剂0.025%~0.05%,余量为水;消前pH自然。
4.根据权利要求1所述的一种提高井冈霉素发酵水平的生产方法,其特征是,所述的发酵培养基的配方以质量百分数计为:大米粉6%~10%,花生饼粉0.5%~2.0%,黄豆粕粉0.5%~1.5%,磷酸二氢钾0.01%~0.1%,氯化钠0.05%~0.15%,碳酸钙0.1%~0.5%,消泡剂0.025~0.05%,余量为水;消前pH7.0~7.5。
5.根据权利要求1所述的一种提高井冈霉素发酵水平的生产方法,其特征是,所述的第一步具体为:用2~3个250ml孢瓶内的孢子制成的孢子悬浮液接种于种子罐内的种子培养基中,接种后在温度为28~42℃,空气量为1∶0.3~0.5vvm的条件下培养24~48小时。
6.根据权利要求1所述的一种提高井冈霉素发酵水平的生产方法,其特征是,所述的第二步具体为:将培养成熟的种子培养液和发酵培养基按体积比1~2∶10的比例移种入发酵培养基中,移种后在温度为37~42℃,空气量为1∶0.5~1.0vvm的条件下发酵培养,当培养至总糖浓度以质量百分数计低于4.0%时,开始流加或间歇分批补入适量碳源,控制发酵中期的总糖浓度以质量百分数计为3.0%~4.0%之间,在发酵结束前12小时以上停止补料,培养65~100小时发酵结束。
7.根据权利要求1或6所述的一种提高井冈霉素发酵水平的生产方法,其特征是,所述的补入适量碳源的品种为下列之一:大米粉液化液或玉米淀粉液化液。
8.根据权利要求7所述的一种提高井冈霉素发酵水平的生产方法,其特征是,所述的大米粉液化液或玉米淀粉液化液的制备方法具体为:用自来水调大米粉或玉米淀粉至浆浓度以质量百分数计为30%~40%,加入以质量百分数计为0.2%~0.3%的氯化钙,搅拌,用液碱调pH至6.0~6.4,在每克大米粉或玉米淀粉中加入10~20u中温a—淀粉酶,升温至80℃保温,当液化澄清液与稀碘液反应呈红棕色时,液化结束,后升温至90℃以上保温10分钟杀酶,然后加入以质量百分数计为0.025%~0.05%的消泡剂,在121℃实罐蒸汽灭菌30分钟,制得大米粉液化液或玉米淀粉液化液,用作碳源补料液。
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