CN103602714A - 一种金色链霉菌发酵生产四环素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种金色链霉菌发酵生产四环素的方法,包括金色链霉菌的斜面孢子培养、种子培养和发酵培养,其特点在于采用糊精、蔗糖、玉米浆、水解豆粕等中效碳氮源代替原迟效碳氮源,通过降低原发酵培养基中淀粉和豆粉含量,并结合发酵过程混合料配方及补入方法的调整,将发酵培养基中的部分氮源放入发酵过程的补料中,有效控制了发酵过程培养基的浓度,改善发酵前期的溶氧条件,通过补料控制发酵最终培养基的残留,降低物料消耗,减少固废排放;有效控制四环素发酵过程中对数生长期的代谢速度,减少发酵过程中发酵液转红发酸等异常情况,提高了发酵水平。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域,特别是涉及一种金色链霉菌发酵生产四环素的方法。
背景技术
四环素是以金色链霉菌为发酵菌株,经发酵法生产出来的抗菌物质,对革兰氏阳性菌、阴性菌、立克次体、滤过性病毒、螺旋体属乃至原虫类都有很好的抑制作用,是一种广谱抗菌素。
现有技术中,以金色链霉菌发酵生产四环素的发酵过程中,使用大量的黄豆饼粉、淀粉等迟效碳、氮源,存在利用不彻底的现象,发酵结束后仍有近50%的营养物质未被利用完,这不仅造成原材料的浪费,并且在发酵液放罐时大量的残留碳氮源给后续提取造成困难。而且,在发酵过程中,通常都采用通氨工艺,这种浓配方培养基(发酵培养基中各种原料的浓度都有较大,通常将适用于通氨工艺的培养基配方称为浓配方)和通氨工艺过程,发酵前期很难控制,经常出现菌丝生长太快,发酵液变得非常粘稠,造成搅拌和通气效果差,供氧不足,菌体呼吸困难,最后导致发酵液转红代谢异常,生产水平下降。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷,提供一种可最大限度的利用原料中的营养成分,降低发酵过程中培养基的浓度,改善溶氧条件,提高发酵单位的金色链霉菌发酵生产四环素的培养基;
本发明的另一目的是提供利用上述培养基发酵生产四环素的方法。
为实现上述发明目的所采取的技术方案为:
一种金色链霉菌发酵生产四环素的方法,包括金色链霉菌的斜面孢子培养、种子培养和发酵培养,其特征在于所述发酵培养采用的发酵培养基的组成为:
淀粉30~40g/L,糊精5~10g/L,豆粉6~10g/L玉米浆15~30g/L,硫酸铵2~6g/L,轻质碳酸钙3.5~5g/L,溴化钠0.5~1.5g/L,磷酸二氢钾:0.05~0.1g/L,淀粉酶0.1g/L。
在发酵过程中,当总糖低于4.0%时补入混合料,所述混合料的组成为:
淀粉300~400g/L,20%水解黄豆粕40~60g/L,玉米浆10~15g/L,硫酸铵1~2g/L,轻质碳酸钙3.5~5g/L,溴化钠0.5~1.5g/L,磷酸二氢钾:0.05~0.1g/L,淀粉酶0.3g/L。
所述水解黄豆粕是采用细度在100~120目的黄豆粕,用水配置到20%浓度,加入(按体积重量计算)0.03~0.05%的蛋白酶,加热至50~60℃,保温10~15hr后所得。
所述混合料的补入量参照发酵液总糖的残留量,开始补料至发酵140hr控制总糖残留2.0~4.0%,141hr至发酵结束,控制总糖残留在2.0~1.5%。
在所述发酵培养过程中,当发酵PH小于6.0,总糖降至4.0%以下补入混合料,并通氨水控制发酵PH5.8~6.0之间,101hr至发酵结束控制pH在5.6~5.8。
本发明具有以下技术特点:
1、本发明在发酵培养基的配制上将淀粉和黄豆粉含量减少了50~70%,有利于蒸汽灭菌,使灭菌温度降低2℃,保温时间缩短10分钟,可节约灭菌蒸汽20~25%。
2、本发明通过采用糊精、蔗糖、玉米浆、水解豆粕等介于迟效碳氮源和速效碳氮源之间的中效碳氮源代替原迟效碳氮源,首先采用降低发酵培养基中迟效氮源的配比,然后将迟效氮源黄豆粕粉经蛋白水解后,配入混合料中作为发酵补料,有利于氮源的充分利用,并可降低发酵液中氮源的残留。
3、由于发酵基础料浓度降低,通过补料时间及补入量的控制,可有效控制发酵对数生长期的代谢速度,降低溶氧需求,减少发酵过程的通气量,降低发酵动力成本10~15%。同时,可避免发酵前期缺氧造成的发酵液转红、发酸等异常现象。
4、本发明将混合料的补入量时间提前,从而弥补发酵基础料碳氮源不足对发酵前期的影响。
5、本发明将发酵结束时发酵液中总糖的残留控制降低了40~57%,有效降低了发酵液中碳源的残留。
6、本发明使用新的培养基配方及补料方法后可使发酵时间控制在160~180小时,发酵单位与原方法相比提高10%以上,发酵原材料淀粉与黄豆粕降低15~25%。
综上所述,本发明采用糊精、玉米浆、水解豆粕等介于迟效碳氮源和速效碳氮源之间的中效碳氮源代替原迟效碳氮源,首先通过降低原发酵培养基中淀粉和豆粉含量,并结合发酵过程混合料配方及补入方法的调整,将发酵培养基中的部分氮源放入发酵过程的补料中,有效控制了发酵过程培养基的浓度,改善发酵前期的溶氧条件,通过补料控制发酵最终培养基的残留,降低物料消耗,减少固废排放;有效控制四环素发酵过程中对数生长期的代谢速度,减少发酵过程中发酵液转红发酸等异常情况,提高了发酵水平。
具体实施方式
下面用实例予以说明本发明,应该理解的是,实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
实验设备:
本发明中种子罐使用某公司BLBZO-15SJ型15L实验罐。
发酵罐使用BLBZO-50SJ型50L实验罐。
实验罐全程可检测溶氧、PH、温度、搅拌转速等参数。
混合料根据给定量自动补入,温度自动控制。
混合料罐使用本公司自制30L不锈钢实验罐,温度可自动控制,可进行湿热灭菌操作。
对比实施例:
1、孢子斜面制备:
按常规方法将金色链霉菌接到灭菌好的斜面培养中培养4~7天,得到四环素斜面孢子,将四环素孢子接种于一级种子液中。
2、种子培养:
培养基配比:淀粉10~25g/L,豆粉:10~15g/L、玉米浆0.1~0.8g/L,硫酸铵1~5g/L,轻质碳酸钙0.5~2g/L,溴化钠0.5~1.5g/L。按培养基重量体积比配制5.0L种子培养基,蒸汽湿热灭菌,控制温度120~122℃,保温25分钟。
接四环素斜面孢子,接种量为500ml茄型瓶斜面的25%,控制培养温度32~35℃,通气量1:0.4~0.8v/v/min,搅拌转速400~600r/min,培养25~30hr得种子培养液。
3、发酵:
培养基配比:淀粉60~90g/L,豆粉:20~30g/L玉米浆15~30g/L,硫酸铵2~6g/L,轻质碳酸钙3.5~5g/L,溴化钠0.5~1.5g/L,磷酸二氢钾:0.05~0.1g/L,淀粉酶0.3g/L。按培养基重量体积比配制25L发酵培养基,饱和蒸汽湿热灭菌,控制温度120~122℃,保温30分钟。
将通过上述培养好的种子培养液按接种量10~20%接入灭菌好的培养基。控制发酵培养温度29~33℃,通气量1:0.8~1.2v/v/min,搅拌,保证发酵过程溶氧20%以上,培养160~180hr放罐,得到含有四环素的发酵液。
4、混合料配制:
混合料配比:淀粉300~400g/L,玉米浆:10~15g/L,硫酸铵1~2g/L,轻质碳酸钙3.5~5g/L,溴化钠0.5~1.5g/L;磷酸二氢钾:0.05~0.1g/L;淀粉酶0.3g/L。按培养基重量体积比配制18L混合料,饱和蒸汽湿热灭菌,控制温度120~122℃,保温25分钟。
5、补料控制:
在发酵过程中,当总糖降至6.0%以下,约在发酵接种后18~20hr时补入混合料,并通氨水控制发酵PH,100hr前控制发酵PH在5.8~6.0之间,100hr至发酵结束控制PH在5.6~5.8之间。全程混合料的补入量为发酵液体积的50~70%。过程补入量参照发酵液总糖的残留量,开始补料至发酵140hr控制总糖残留6.0~3.5%,140hr以后控制总糖残留在2.5~3.5%。
6、实验数据:
发酵周期 | 发酵单位 | 放罐总糖 | 发酵液固含量 |
177 | 30620u/ml | 3.1% | 51% |
实施例1:
1、孢子斜面制备、种子制备与对比实施例相同。
2、发酵培养基:
培养基配比:淀粉30g/L,糊精:5g/L,豆粉:6g/L,玉米浆15~30g/L,硫酸铵2~6g/L,轻质碳酸钙3.5~5g/L,溴化钠0.5~1.5g/L,磷酸二氢钾0.05~0.1g/L,淀粉酶0.1g/L。按培养基重量体积比配制,湿热灭菌温度118℃,保温20分钟。
将种子培养液按接种量10~20%接入灭菌好的培养基,培养温度29~33℃,通气量1:0.6v/v/min,搅拌,发酵过程溶氧在20%以上,培养160~180hr放罐,得到含有四环素的发酵液。
3、混合料配制:
混合料配比:淀粉300g/L,20%水解黄豆粕:40g/L,玉米浆10~15g/L,硫酸铵1~2g/L,轻质碳酸钙3.5~5g/L,溴化钠0.5~1.5g/L;磷酸二氢钾0.05~0.1g/L,淀粉酶0.3g/L。按培养基重量体积比配制,湿热灭菌温度120~122℃,保温25分钟。
黄豆粕水解:使用细度在100~120目的黄豆粕,用水配制到20%浓度,加体积重量0.03%的蛋白酶,加热至50℃,保温10hr。
4、补料控制:
在发酵过程中,当发酵PH小于6.0,总糖降至4.0%以下,约在发酵接种后8~15hr时补入混合料,并通氨水控制发酵PH,100hr前控制发酵PH在5.8~6.0之间,100hr至发酵结束控制PH在5.6~5.8之间。全程混合料的补入量为发酵液体积的45%,过程补入量参照发酵液总糖的残留量,开始补料至发酵140hr控制总糖残留2.0~4.0%,140hr以后控制总糖残留在2.0~1.5%。
5、实验数据:
发酵周期 | 发酵单位 | 放罐总糖 | 发酵液固含量 |
168 | 33750u/ml | 1.6% | 34% |
实施例2:
1、孢子斜面制备、种子制备与对比实施例相同。
2、发酵培养基:
培养基配比:淀粉35g/L,糊精:7.5g/L,豆粉:8g/L,玉米浆15~30g/L,硫酸铵2~6g/L,轻质碳酸钙3.5~5g/L,溴化钠0.5~1.5g/L;磷酸二氢钾:0.05~0.1g/L,淀粉酶0.1g/L。按培养基重量体积比配制,湿热灭菌温度119℃,保温20分钟。
将种子培养液按接种量10~20%接入灭菌好的培养基,培养温度29~33℃,通气量1:0.8v/v/min,搅拌,发酵过程溶氧在20%以上,培养160~180hr放罐,得到含有四环素的发酵液。
3、混合料配制:
混合料配比:淀粉350g/L,20%水解黄豆粕:50g/L,玉米浆10~15g/L,硫酸铵1~2g/L,轻质碳酸钙3.5~5g/L,溴化钠0.5~1.5g/L,磷酸二氢钾0.05~0.1g/L,淀粉酶0.3g/L。按培养基重量体积比配制,湿热灭菌温度120~122℃,保温25分钟。
黄豆粕水解:使用细度在100~120目的黄豆粕,用水配制到20%浓度,加体积重量0.04%的蛋白酶,加热至55℃,保温12hr。
4、补料控制:
在发酵过程中,当发酵PH小于6.0,总糖降至4.0%以下,约在发酵接种后8~15hr时补入混合料,并通氨水控制发酵PH,100hr前控制发酵PH在5.8~6.0之间,100hr至发酵结束控制PH在5.6~5.8之间。全程混合料的补入量为发酵液体积的53%,过程补入量参照发酵液总糖的残留量,开始补料至发酵140hr控制总糖残留2.0~4.0%,140hr以后控制总糖残留在2.0~1.5%。
5、实验数据:
发酵周期 | 发酵单位 | 放罐总糖 | 发酵液固含量 |
172 | 34620u/ml | 1.8% | 37% |
实施例3:
1、孢子斜面制备、种子制备与对比实施例相同。
2、发酵培养基:
培养基配比:淀粉40g/L,糊精:10g/L,豆粉:10g/L,玉米浆15~30g/L,硫酸铵2~6g/L,轻质碳酸钙3.5~5g/L,溴化钠0.5~1.5g/L,磷酸二氢钾,0.05~0.1g/L,淀粉酶0.1g/L。按培养基重量体积比配制,湿热灭菌温度120℃,保温20分钟。
将种子培养液按接种量10~20%接入灭菌好的培养基,培养温度29~33℃,通气量1:1.0v/v/min,搅拌,发酵过程溶氧在20%以上,培养160~180hr放罐,得到含有四环素的发酵液。
3、混合料配制:
混合料配比:淀粉400g/L,20%水解黄豆粕:60g/L,玉米浆10~15g/L,硫酸铵1~2g/L,轻质碳酸钙3.5~5g/L,溴化钠0.5~1.5g/L,磷酸二氢钾:0.05~0.1g/L,淀粉酶0.3g/L,按培养基重量体积比配制,湿热灭菌温度120~122℃,保温25分钟。
黄豆粕水解:使用细度在100~120目的黄豆粕,用水配制到20%浓度,加体积重量0.05%的蛋白酶,加热至60℃,保温15hr。
4、补料控制:
在发酵过程中,当发酵PH小于6.0,总糖降至4.0%以下,约在发酵接种后8~15hr时补入混合料,并通氨水控制发酵PH,100hr前控制发酵PH在5.8~6.0之间,100hr至发酵结束控制PH在5.6~5.8之间。全程混合料的补入量为发酵液体积的53%,过程补入量参照发酵液总糖的残留量,开始补料至发酵140hr控制总糖残留2.0~4.0%,140hr以后控制总糖残留在2.0~1.5%。
5、实验数据:
发酵周期 | 发酵单位 | 放罐总糖 | 发酵液固含量 |
177 | 34970u/ml | 1.9% | 40% |
Claims (4)
1. 一种金色链霉菌发酵生产四环素的方法,包括金色链霉菌的斜面孢子培养、种子培养和发酵培养,其特征在于所述发酵培养采用的发酵培养基组成为:
淀粉30~40g/L,糊精5~10g/L,豆粉6~10g/L,玉米浆15~30g/L,硫酸铵2~6g/L,轻质碳酸钙3.5~5g/L,溴化钠0.5~1.5g/L,磷酸二氢钾:0.05~0.1g/L,淀粉酶0.1g/L。
2. 按照权利要求1所述的金色链霉菌发酵生产四环素的方法,其特征是:在发酵过程中,当总糖低于4.0%时补入混合料,所述混合料的组成为:
淀粉300~400g/L,20%水解黄豆粕 40~60g/L,玉米浆 10~15g/L,硫酸铵1~2g/L,轻质碳酸钙3.5~5g/L,溴化钠0.5~1.5g/L,磷酸二氢钾0.05~0.1g/L,淀粉酶0.3g/L。
所述水解黄豆粕是采用细度在100~120目的黄豆粕,用水配置到20%浓度,加入0.03~0.05%的蛋白酶,加热至50~60℃,保温10~15hr后所得。
3.按照权利要求2所述的金色链霉菌发酵生产四环素的方法,其特征在于所述混合料的补入量参照发酵液总糖的残留量,开始补料至发酵140hr控制总糖残留2.0~4.0%,141hr至发酵结束,控制总糖残留在2.0~1.5%。
4.按照权利要求按照权利要求1所述的金色链霉菌发酵生产四环素的方法,其特征是:在所述发酵培养过程中,当pH 低于4.0%时通入氨水,发酵开始至100hr控制1PH在5.8~6.0之间,101hr至发酵结束控制pH在5.6~5.8。
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