CN104388501A

CN104388501A - 一种应用生物酶的红霉素制备方法

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Publication number: CN104388501A
Application number: CN201410596453.5A
Authority: CN
Inventors: 吴鹏; 王双平; 陈龙
Original assignee: NINGXIA YIZHENG BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: NINGXIA YIZHENG BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2014-10-30
Filing date: 2014-10-30
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2034-10-30
Also published as: CN104388501B

Abstract

本发明提供了一种应用生物酶的红霉素制备方法，包括以下步骤：(1)取红色链霉菌菌种接种于一级种子培养基中，培养得一级种子液；(2)将一级种子液接种于二级种子培养基中，培养得二级种子液；(3)将二级种子液接种于发酵培养基中，培养过程中补加豆油、脂肪酶、玉米浆、蛋白酶等物质，培养一定时间后得到高红霉素含量的发酵液。上述红霉素的制备方法，通过发酵培养基及培养过程的控制的优化，特别是通过引入生物酶，提高了原料利用率及红霉素的发酵水平，简化工艺，降低了生产成本。

Description

一种应用生物酶的红霉素制备方法

技术领域

本发明涉及抗生素发酵制备领域，特别是涉及一种红霉素的发酵制备方法。

背景技术

红霉素属大环内脂类抗生素,它的抗菌谱和青霉素相似,特别对革兰氏阳性细菌、抗酸杆菌、立克次氏体及大病毒有抗菌活性,是治疗耐药性金黄色葡萄球菌感染和溶血性链球菌感染所引起疾病的首选药物,临床上可用于对青霉素过敏的患者。近年来，随着红霉素临床应用领域的扩大和以阿奇霉素、罗红霉素、克拉霉素等为代表的新型半合成红霉素的出现，红霉素生产和销售日趋活跃。

红霉素发酵是采用一种放线菌(红色链霉菌)作为产生菌，经过复壮、分离、孢子培养制备成斜面孢子备用，然后将斜面孢子接入种子罐进行种子扩大培养，最后接入发酵复合培养基，通过对培养温度、PH、基质浓度等参数的控制，使其最大限度的产生红霉素的过程。目前国外红霉素发酵水平明显高于国内，因此，本领域迫切需要提供一种新的红霉素发酵制备方法，提高红霉素发酵水平，从而提高红霉素产量、降低发酵成本。

发明内容

提高红霉素发酵生产水平的主要途径一是改变菌种原有性能，进行诱变筛选或基因工程技术获得高产菌种，二是优化培养基组成成分和培养条件。本发明的目的在于通过优化发酵工艺提供一种简单可行、发酵水平高的红霉素制备方法。

一种应用生物酶的红霉素制备方法，包括以下步骤：

(1)取红色链霉菌按8～12％的接种量接种于一级种子培养基中，在30～32℃培养24～36h，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，培养即得一级种子液；

(2)将所述一级种子液按8～12％的接种量接种于二级种子培养基中，在30～32℃培养24～36h，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，培养即得二级种子液；

(3)将所述二级种子液按8～12％的接种量接种于发酵培养基中，在30～32℃培养，开始培养12～15h后，按每升培养基添加10～20u脂肪酶的比例添加脂肪酶，并开始按每升培养基流加豆油1.2～1.5g/h的比例添加豆油，培养24～30h后，按每升培养基添加10～20u蛋白酶的比例添加蛋白酶，并开始按每升培养基流加玉米浆0.6～0.9g/h的比例添加玉米浆，培养140～160h后，红霉素效价不再上升，终止培养，整个培养过程中，控制pH为6.9～7.1，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，其中，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖15～25g/L、淀粉30～50g/L、黄豆饼粉25～35g/L、玉米浆10～20g/L、硫酸铵1～2g/L、豆油8～15g/L、氯化钠3～6g/L、碳酸钙5～10g/L、泡敌0.1～0.2g/L；

其中，步骤(1)中的所述一级种子培养基和步骤(2)中的所述二级种子培养基的成分都为：葡萄糖20～40g/L、淀粉20～40g/L、黄豆饼粉20～30g/L、玉米浆10～20g/L、硫酸铵3～5g/L、豆油6～10g/L、氯化钠3～6g/L、碳酸钙5～10g/L、泡敌0.1～0.2g/L。

在其中一个实施例中，所述一级种子培养基、所述二级种子培养基的成分都为：葡萄糖30g/L、淀粉30g/L、黄豆饼粉25g/L、玉米浆15g/L、硫酸铵4g/L、豆油8g/L、氯化钠4g/L、碳酸钙10g/L、泡敌0.1g/L。

在其中一个实施例中，步骤(2)中，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖20g/L、淀粉40g/L、黄豆饼粉30g/L、玉米浆15g/L、硫酸铵1.5g/L、豆油12g/L、氯化钠4g/L、碳酸钙10g/L、泡敌0.1g/L。

在其中一个实施例中，步骤(3)中，通过添加氨水的方式控制pH为6.9～7.1。

上述应用生物酶的红霉素制备方法，通过发酵培养基及培养过程的控制的优化，特别是通过引入生物酶，提高了原料利用率及红霉素的发酵水平，简化工艺，降低了生产成本。

附图说明

图1为一实施方式的应用生物酶的红霉素制备方法流程图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

请参阅图1，一实施方式的应用生物酶的红霉素制备方法，包括以下步骤:

步骤S100、取红色链霉菌按8～12％的接种量接种于一级种子培养基中，在30～32℃培养24～36h，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，培养即得一级种子液。

其中，一级种子培养基的成分为：葡萄糖20～40g/L、淀粉20～40g/L、黄豆饼粉20～30g/L、玉米浆10～20g/L、硫酸铵3～5g/L、豆油6～10g/L、氯化钠3～6g/L、碳酸钙5～10g/L、泡敌0.1～0.2g/L。

步骤S200、将所述一级种子液按8～12％的接种量接种于二级种子培养基中，在30～32℃培养24～36h，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，培养即得二级种子液。

其中，二级种子培养基的成分为：葡萄糖20～40g/L、淀粉20～40g/L、黄豆饼粉20～30g/L、玉米浆10～20g/L、硫酸铵3～5g/L、豆油6～10g/L、氯化钠3～6g/L、碳酸钙5～10g/L、泡敌0.1～0.2g/L。

步骤S300、将所述二级种子液按8～12％的接种量接种于发酵培养基中，在30～32℃培养，开始培养12～15h后，按每升培养基添加10～20u脂肪酶的比例添加脂肪酶，并开始按每升培养基流加豆油1.2～1.5g/h的比例添加豆油，培养24～30h后，按每升培养基添加10～20u蛋白酶的比例添加蛋白酶，并开始按每升培养基流加玉米浆0.6～0.9g/h的比例添加玉米浆，培养140～160h后，红霉素效价不再上升，终止培养，整个培养过程中，控制pH为6.9～7.1，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，其中，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖15～25g/L、淀粉30～50g/L、黄豆饼粉25～35g/L、玉米浆10～20g/L、硫酸铵1～2g/L、豆油8～15g/L、氯化钠3～6g/L、碳酸钙5～10g/L、泡敌0.1～0.2g/L。

优选的，所述一级种子培养基、所述二级种子培养基的成分都为：葡萄糖30g/L、淀粉30g/L、黄豆饼粉25g/L、玉米浆15g/L、硫酸铵4g/L、豆油8g/L、氯化钠4g/L、碳酸钙10g/L、泡敌0.1g/L。

优选的，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖20g/L、淀粉40g/L、黄豆饼粉30g/L、玉米浆15g/L、硫酸铵1.5g/L、豆油12g/L、氯化钠4g/L、碳酸钙10g/L、泡敌0.1g/L。

优选的，控制pH值步骤为：通过添加氨水的方式控制pH为6.9～7.1。

本发明的主要优点在于：

1、优化了发酵培养基中的碳源，选择作为速效碳源的葡萄糖和作为迟效碳源的淀粉，可以防止单独使用葡萄糖时因为葡萄糖代谢过快导致中间代谢产物积累或pH降低，进而降低红霉素发酵水平。

2、由于葡萄糖对红霉素的生物合成有一定抑制作用，本发明在发酵过程中不补加葡萄糖，同时增加了发酵培养基中豆油的含量，并在发酵过程中流加大量豆油。以豆油作为发酵过程中主要碳源，此外豆油还能在被菌体分解后生成各种脂肪酸、甘油为红霉素合成提供代谢中间体。同时豆油加量的增大可以减少丙醇的使用，甚至不用流加丙醇，从而简化工艺，降低发酵成本。由于豆油被菌体分解过程中存在着油脂分解不彻底、利用速度慢、分解利用滞后这些问题，会造成发酵液中残留油脂较多，并加大原材料的消耗量，本发明在培养过程中添加脂肪酶，调节菌体利用油脂速度，使之满足菌体的生长代谢所需，并提高油脂利用率，降低残留油脂。本发明在培养过程中添加脂肪酶处理豆油相比专利CN 102732383 B中先用脂肪酶处理豆油再用于发酵而言，更便于控制豆油的降解速度，可以防止一次性或者直接加入大量豆油代谢物导致菌体生长过快、影响红霉素的生成，此外可以省略单独用酶处理豆油这一步骤，简化工艺，降低生产成本。

3、在发酵过程中流加玉米浆。玉米浆相比硫酸铵等速效无机氮源，菌体利用速度慢，但其除含有大量的氮外还含有丰富的微量元素等，能为菌体生长代谢提供全面的营养成分。为了提高玉米浆的利用速度，本发明在培养过程中添加蛋白酶，调节玉米浆中蛋白的降解速度，为菌体生长代谢提高足够的氮源，实现了流加玉米浆对流加硫酸铵的替代。

本发明的应用生物酶的红霉素制备方法通过优化发酵工艺能提高红霉素的发酵水平，并简化工艺，降低生产成本。

下面结合具体实施例，对本发明作进一步的阐述。

实施例1

一种应用生物酶的红霉素制备方法，包括以下步骤：

(1)取红色链霉菌按8％的接种量接种于一级种子培养基中，在32℃培养36h，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，培养即得一级种子液。

其中，一级种子培养基的成分为：葡萄糖30g/L、淀粉30g/L、黄豆饼粉25g/L、玉米浆15g/L、硫酸铵4g/L、豆油8g/L、氯化钠4g/L、碳酸钙10g/L、泡敌0.1g/L。

(2)将所述一级种子液按8％的接种量接种于二级种子培养基中，在32℃培养36h，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，培养即得二级种子液。

其中，二级种子培养基的成分为：葡萄糖30g/L、淀粉30g/L、黄豆饼粉25g/L、玉米浆15g/L、硫酸铵4g/L、豆油8g/L、氯化钠4g/L、碳酸钙10g/L、泡敌0.1g/L。

(3)将所述二级种子液按10％的接种量接种于发酵培养基中，在30℃培养，开始培养12h后，按每升培养基添加10u脂肪酶的比例添加脂肪酶，并开始按每升培养基流加豆油1.2g/h的比例添加豆油，培养24h后，按每升培养基添加20u蛋白酶的比例添加蛋白酶，并开始按每升培养基流加玉米浆0.6g/h的比例添加玉米浆，培养145h后，终止发酵，发酵液中红霉素含量为9850u/mL。整个培养过程中，通过补加氢氧化钠溶液控制pH为6.9～7.1，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，其中，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖15g/L、淀粉50g/L、黄豆饼粉25g/L、玉米浆10g/L、硫酸铵1g/L、豆油8g/L、氯化钠3g/L、碳酸钙5g/L、泡敌0.2g/L。

实施例2

一种应用生物酶的红霉素制备方法，包括以下步骤：

(1)取红色链霉菌按12％的接种量接种于一级种子培养基中，在30℃培养24h，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，培养即得一级种子液。

其中，一级种子培养基的成分为：葡萄糖20g/L、淀粉40g/L、黄豆饼粉20g/L、玉米浆10g/L、硫酸铵5g/L、豆油10g/L、氯化钠3g/L、碳酸钙5g/L、泡敌0.2g/L。

(2)将所述一级种子液按12％的接种量接种于二级种子培养基中，在30℃培养24h，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，培养即得二级种子液。

其中，二级种子培养基的成分为：葡萄糖20g/L、淀粉40g/L、黄豆饼粉20g/L、玉米浆10g/L、硫酸铵5g/L、豆油10g/L、氯化钠3g/L、碳酸钙5g/L、泡敌0.2g/L。

(3)将所述二级种子液按12％的接种量接种于发酵培养基中，在30℃培养，开始培养15h后，按每升培养基添加15u脂肪酶的比例添加脂肪酶，并开始按每升培养基流加豆油1.5g/h的比例添加豆油，培养30h后，按每升培养基添加10u蛋白酶的比例添加蛋白酶，并开始按每升培养基流加玉米浆0.9g/h的比例添加玉米浆，培养140h后，终止发酵，发酵液中红霉素含量为10150u/mL。整个培养过程中，通过补加氨水控制pH为6.9～7.1，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，其中，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖15g/L、淀粉40g/L、黄豆饼粉25g/L、玉米浆20g/L、硫酸铵2g/L、豆油8g/L、氯化钠3g/L、碳酸钙10g/L、泡敌0.1g/L。

实施例3

一种应用生物酶的红霉素制备方法，包括以下步骤：

(1)取红色链霉菌按12％的接种量接种于一级种子培养基中，在30℃培养30h，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，培养即得一级种子液。

其中，一级种子培养基的成分为：葡萄糖40g/L、淀粉20g/L、黄豆饼粉30g/L、玉米浆20g/L、硫酸铵3g/L、豆油6g/L、氯化钠6g/L、碳酸钙5g/L、泡敌0.2g/L。

(2)将所述一级种子液按12％的接种量接种于二级种子培养基中，在30℃培养30h，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，培养即得二级种子液。

其中，二级种子培养基的成分为：葡萄糖40g/L、淀粉20g/L、黄豆饼粉30g/L、玉米浆20g/L、硫酸铵3g/L、豆油6g/L、氯化钠6g/L、碳酸钙5g/L、泡敌0.2g/L。

(3)将所述二级种子液按8％的接种量接种于发酵培养基中，在32℃培养，开始培养15h后，按每升培养基添加20u脂肪酶的比例添加脂肪酶，并开始按每升培养基流加豆油1.5g/h的比例添加豆油，培养24h后，按每升培养基添加10u蛋白酶的比例添加蛋白酶，并开始按每升培养基流加玉米浆0.6g/h的比例添加玉米浆，培养160h后，终止发酵，发酵液中红霉素含量为9956u/mL。整个培养过程中，通过补加氨水控制pH为6.9～7.1，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，其中，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖20g/L、淀粉40g/L、黄豆饼粉30g/L、玉米浆15g/L、硫酸铵1.5g/L、豆油12g/L、氯化钠4g/L、碳酸钙10g/L、泡敌0.1g/L。

实施例4

一种应用生物酶的红霉素制备方法，包括以下步骤：

(1)取红色链霉菌按10％的接种量接种于一级种子培养基中，在32℃培养30h，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，培养即得一级种子液。

(2)将所述一级种子液按10％的接种量接种于二级种子培养基中，在32℃培养30h，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，培养即得二级种子液。

(3)将所述二级种子液按8％的接种量接种于发酵培养基中，在32℃培养，开始培养12h后，按每升培养基添加15u脂肪酶的比例添加脂肪酶，并开始按每升培养基流加豆油1.2g/h的比例添加豆油，培养30h后，按每升培养基添加20u蛋白酶的比例添加蛋白酶，并开始按每升培养基流加玉米浆0.9g/h的比例添加玉米浆，培养150h后，终止发酵，发酵液中红霉素含量为10251u/mL。整个培养过程中，通过补加氨水控制pH为6.9～7.1，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，其中，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖25g/L、淀粉30g/L、黄豆饼粉35g/L、玉米浆20g/L、硫酸铵2g/L、豆油15g/L、氯化钠6g/L、碳酸钙5g/L、泡敌0.2g/L。

对比例1

一种常规的红霉素制备方法，包括以下步骤：

(3)将所述二级种子液按8％的接种量接种于发酵培养基中，在32℃培养，开始培养12h后，开始按每升培养基流加葡萄糖2g/h的比例添加葡萄糖，按每升培养基流加丙醇0.4g/h的比例添加丙醇，培养20h后，开始按每升培养基流加硫酸铵1g/h的比例添加硫酸铵，培养150h后，终止发酵，发酵液中红霉素含量为8532u/mL。整个培养过程中，控制pH为6.9～7.0，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，其中，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖45g/L、黄豆饼粉35g/L、玉米浆20g/L、硫酸铵2g/L、豆油15g/L、氯化钠6g/L、碳酸钙5g/L、泡敌0.2g/L。

对比例2

一种常规的红霉素制备方法，包括以下步骤：

(1)取红色链霉菌按8％的接种量接种于一级种子培养基中，在32℃培养30h，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，培养即得一级种子液。

(2)将所述一级种子液按8％的接种量接种于二级种子培养基中，在32℃培养30h，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，培养即得二级种子液。

(3)将所述二级种子液按8％的接种量接种于发酵培养基中，在32℃培养，开始培养15h后，开始按每升培养基流加葡萄糖1.5g/h的比例添加葡萄糖，按每升培养基流加丙醇0.4g/h的比例添加丙醇，培养20h后，开始按每升培养基流加硫酸铵1.2g/h的比例添加硫酸铵，培养150h后，终止发酵，发酵液中红霉素含量为8340u/mL。整个培养过程中，控制pH为6.9～7.0，通过调整搅拌转速或通入无菌空气控制溶氧在30％以上，其中，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖50g/L、黄豆饼粉35g/L、玉米浆20g/L、硫酸铵2g/L、豆油15g/L、氯化钠6g/L、碳酸钙5g/L、泡敌0.2g/L。

根据上述实施例1～4及对比例1～2可知，实施例1～4中发酵液红霉素平均含量为10052u/mL，对比例1～2中发酵液红霉素平均含量为8436u/mL。本发明的红霉素的制备方法相比常规制备方法，发酵水平提高了19％，同时简化了补料种类。这说明本方法通过优化发酵工艺达到了提高红霉素的发酵水平、简化工艺的目的。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种应用生物酶的红霉素制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的应用生物酶的红霉素制备方法，其特征在于，所述一级种子培养基、所述二级种子培养基的成分都为：葡萄糖30g/L、淀粉30g/L、黄豆饼粉25g/L、玉米浆15g/L、硫酸铵4g/L、豆油8g/L、氯化钠4g/L、碳酸钙10g/L、泡敌0.1g/L。

3.根据权利要求1所述的应用生物酶的红霉素制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖20g/L、淀粉40g/L、黄豆饼粉30g/L、玉米浆15g/L、硫酸铵1.5g/L、豆油12g/L、氯化钠4g/L、碳酸钙10g/L、泡敌0.1g/L。

4.根据权利要求1所述的应用生物酶的红霉素制备方法，其特征在于，步骤(3)中，通过添加氨水的方式控制pH为6.9～7.1。