CN107418994A - 一种赤霉菌发酵生产的赤霉素ga1和ga4的工艺 - Google Patents

一种赤霉菌发酵生产的赤霉素ga1和ga4的工艺 Download PDF

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章泳
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Abstract

本发明涉及一种赤霉菌发酵生产的赤霉素GA1和GA4的工艺，其具体步骤如下：先将赤霉菌CGMCC NO.5588 1～3菌环接至活化培养基，进行双阶段活化培养得活化菌液；再将活化菌液接种到复合发酵培养基中发酵培养得赤霉素GA1和GA4发酵液；最后用大孔吸附树脂柱吸附，用丙酮洗脱吸附树脂柱，得吸附液，加乙酸乙酯萃取，得到GA4结晶和母液；再向母液加丙酮萃取，sevage法洗脱得到GA1结晶。本发明菌株能够在较短时间内生产较高产量GA1和GA4,得到的赤霉素混合物，发酵生产出的GA1效价可高达2950mg/L，发酵生产出的GA4效价可高达1441mg/L。

Description

一种赤霉菌发酵生产的赤霉素GA1和GA4的工艺
技术领域
本发明涉及生物工程领域，主要涉及一种赤霉菌发酵生产的赤霉素GA1和GA4的工艺。
背景技术
赤霉素(Gibberellins，简称GA)，又称九二零，是一种天然的植物生长调节剂。赤霉素属于生物体内的一类四环二萜类化合物，，是一族很重要的具有生物活性的内源植物生长调节剂，至今已发现100多种。常见具有生物活性的主要有赤霉素GA1、GA3、GA8、GA4、GA7等。不同的赤霉素可促进植物不同部位的生长，GA1存在于很多植物中，是一种广泛存在的有活性的植物激素，主要是促进植物生长发育，活性高，副作用小；GA4同样存在与多种植物中，主要是促进开花和拉伸果实，且GA4效果比GA3显著。在植物生长发育期，最重要的赤霉素是GA1和GA4，因此，得到赤霉素GA1和GA4在农业领域应用至关重要。
发明内容
本发明的目的是为了改进现有技术的不足而提供一种赤霉菌发酵生产的赤霉素GA1和GA4的工艺，以满足工业生产和农业应用的需求。
本发明的技术方案为：一种赤霉菌发酵生产的赤霉素GA1和GA4的工艺，其具体步骤如下：
A、将赤霉菌CGMCC NO.5588 1～3菌环接至活化培养基，进行双阶段活化培养：在活化前期，培养温度为27～29℃，摇床转速为200～250rpm，控制菌液pH为4.0～5.0，培养时间为12～48h；在活化后期，培养温度为30～32℃，摇床转速为300～400rpm，控制菌液pH为6.5～7.5，培养时间为3～5天得活化菌液；
B、将活化菌液接种到(高碳源和相对低氮源的灭菌后的)复合发酵培养基中，控制发酵温度为25～34℃；发酵时pH值为5.0～7.0，发酵4～15天后得赤霉素GA1和GA4发酵液；
C、发酵液用大孔吸附树脂柱吸附，用丙酮洗脱吸附树脂柱，树脂投加量体积占6～8％，吸附时间1.0～2.0h，吸附流速0.1～0.3ml/min，pH调整为4.0～6.0，得吸附液；加乙酸乙酯萃取，直到得到GA4结晶和母液；再向母液中加丙酮萃取，sevage法洗脱得到GA1。
优选活化培养基的体积装液量为10～15％。优选活化培养基的成分为：葡萄糖70～85g/L，小麦蛋白3～4.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1～0.4g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，NaMoO4·2H2O 0.03～0.06g/L；微量元素：H3BO3290～310mg/L，MnCl2·4H2O 90～110mg/L，ZnSO4·7H2O 90～110mg/L，FeCl3·6H2O 190～210mg/L，CuCl2·2H2O 480～520mg/L；pH为4.0～5.0。
优选活化菌液按复合发酵培养基体积的10～15％接种到复合发酵培养基中。
优选发酵培养基体积装液量为10～15％。
优选发酵培养基的组分及各组分占发酵培养基总量的质量百分比为碳源30～50％，氮源10～20％，微量元素1～5％，其余为水。
优选上述的碳源为葡萄糖、葡聚糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、糊精、玉米粉、燕麦粉、淀粉、植物油、糖蜜或脱脂乳中的一种或几种；氮源为硫酸铵、氯化铵、赖氨酸、酒石酸铵、酵母水解物、酵母自水解物、酵母提取物、酵母细胞、酪蛋白水解物、黄豆粉、花生粉或者棉籽饼粉中的一种或几种；微量元素为金属的氯化盐、硫酸盐、硝酸盐或磷酸盐，其中金属为钠、钾、钙、镁、锌、锰、钴或磷中的一种或几种。
一种赤霉菌，菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.5588，分类命名赤霉菌，菌种的拉丁学名Gibberellafujikuroi，参据的微生物株NJYHWG32261，保藏日期是2011.12.14。
CGMCC NO.5588菌株具有下述性质：
1.形态与培养特征：
在PDA培养基上培养，菌落圆形，菌丝为白色，稠密的细绒毛状，生长旺盛，后期中央菌丝由白色转为黑色。有性世代产生子囊孢子，子囊壳呈椭球状，黑色，大小为10～25.5×10.2～19.6μm。无性世代产生分生孢子，白色，孢子镰刀型，有隔膜。赤霉菌菌丝生长和子囊孢子萌发都要合适条件：最适温度28℃，相对湿度70％，喜偏酸性近中性，ph6.0～7.0，最适pH6.8。
2.生理生化特性:
赤霉菌CGMCC NO.5588的主要生理生化特征见表1：
表1菌株的生理生化特征
注：+：阳性或生长；－：阴性或不生长
有益效果：
本发明菌株能够在较短时间内生产较高产量GA1和GA4,得到的赤霉素混合物，发酵生产出的GA1效价可高达2950mg/L，发酵生产出的GA4效价可高达1441mg/L。
保藏信息
上述赤霉菌Gibberella fujikuroi CGMCC No.5588是由本实验室选育并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC No.5588，保藏日期是：2011.12.14。
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1：
(1)将赤霉菌(CGMCC NO.5588)接1菌环至活化培养基，双阶段活化培养步骤包括活化前期和后期：在活化前期，培养温度为27℃，摇床转速为200rpm，控制菌液pH为4.0，培养时间为12h；在活化后期，培养温度为30℃，摇床转速为300rpm，控制菌液pH为6.5，培养时间为3天得活化菌液。其中活化培养体积装液量为10％，成分为：葡萄糖70g/L，小麦蛋白3g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，KH2PO41.0g/L，NaMoO4·2H2O 0.03g/L，pH为4.0；微量元素：H3BO3290mg/L，MnCl2·4H2O 90mg/L，ZnSO4·7H2O 90mg/L，FeCl3·6H2O 190mg/L，CuCl2·2H2O 480mg/L。
(2)将活化菌液10％的体积量接种到高碳源和相对低氮源的灭菌后的复合发酵培养基中，发酵温度温度为28℃；发酵pH值为5.5。发酵4天后得赤霉素GA1和GA4发酵液。其中发酵培养基体积装液量为10％，碳源成分为葡萄糖，碳源的量为培养基总重量的30％(w/w)；氮源成分为硫酸铵，氮源的量为培养基总重量的10％(w/w)；微量元素为氯化钠，总量为培养基总重量的1％(w/w)，去离子水定容。
(3)发酵液用大孔吸附树脂柱吸附，用丙酮洗脱吸附树脂柱，树脂投加量体积占6.0％，吸附时间1.0h，吸附流速0.1ml/min，pH调整为4.0，得吸附液。加乙酸乙酯萃取，直到得到GA4结晶和母液，测得效价为1100mg/L。向母液中加丙酮萃取，sevage法洗脱得到GA1结晶，测得效价为2750mg/L。
实施例2：
(1)将赤霉菌(CGMCC NO.5588)接2菌环至活化培养基，双阶段活化培养步骤包括活化前期和后期：在活化前期，培养温度为28℃，摇床转速为225rpm，控制菌液pH为4.5，培养时间为30h；在活化后期，培养温度为31℃，摇床转速为350rpm，控制菌液pH为7.0，培养时间为4天得活化菌液。其中活化培养体积装液量为12％，成分为：葡萄糖80g/L，小麦蛋白4.0g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，KH2PO41.5g/L，NaMoO4·2H2O 0.05g/L，pH为4.5；微量元素：H3BO3300mg/L，MnCl2·4H2O 100mg/L，ZnSO4·7H2O 100mg/L，FeCl3·6H2O 200mg/L，CuCl2·2H2O 500mg/L。
(2)将活化菌液12％的体积量接种到高碳源和相对低氮源的灭菌后的复合发酵培养基中，发酵温度为35℃；发酵pH值为6.0。发酵9天后得赤霉素GA1和GA4发酵液。其中发酵培养基体积装液量为12％，碳源成分为葡萄糖、葡聚糖、蔗糖，比例为1:1:1，碳源的量为培养基总重量的40％(w/w)；氮源成分为硫酸铵、氯化铵、酒石酸铵，比例为1:1:1，氮源的量为培养基总重量的15％(w/w)；微量元素为氯化钾、硫酸镁、硫酸锌、磷酸氢二钾，比例为1:1:1:1，总量为培养基总重量的3.0％(w/w)，去离子水定容。
(3)发酵液用大孔吸附树脂柱吸附，用丙酮洗脱吸附树脂柱，树脂投加量体积占7.0％，吸附时间1.5h，吸附流速0.2ml/min，pH调整为5.0，得吸附液。加乙酸乙酯萃取，直到得到GA4结晶和母液，测得效价为1441mg/L。再向母液加丙酮萃取，sevage法洗脱得到GA1结晶，测得效价为2950mg/L。
实施例3：
(1)将赤霉菌(CGMCC NO.5588)接3菌环至活化培养基，双阶段活化培养步骤包括活化前期和后期：在活化前期，培养温度为29℃，摇床转速为250rpm，控制菌液pH为5.0，培养时间为48h；在活化后期，培养温度为32℃，摇床转速为400rpm，控制菌液pH为7.5，培养时间为5天得活化菌液。其中活化培养体积装液量为15％，成分为：葡萄糖85g/L，小麦蛋白4.5g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，KH2PO4 2.0g/L，NaMoO4·2H2O 0.06g/L，pH为5.0；微量元素：H3BO3 310mg/L，MnCl2·4H2O 110mg/L，ZnSO4·7H2O 110mg/L，FeCl3·6H2O 210mg/L，CuCl2·2H2O 520mg/L。
(2)将活化菌液15％的体积量接种到高碳源和相对低氮源的灭菌后的复合发酵培养基中，发酵温度为32℃；发酵pH值为7.0。发酵15天后得赤霉素GA1和GA4发酵液。其中发酵培养基体积装液量为15％，碳源成分为麦芽糖，碳源的量为培养基总重量的50％(w/w)；氮源成分为棉籽饼粉，氮源的量为培养基总重量的20％(w/w)；微量元素为氯化锌、硫酸锰，比例为1:1，总量为培养基总重量的5.0％(w/w)，去离子水定容。
(3)发酵液用大孔吸附树脂柱吸附，用丙酮洗脱吸附树脂柱，树脂投加量体积占8.0％，吸附时间2h，吸附流速0.3ml/min，pH调整为6.0，得吸附液。加乙酸乙酯萃取，直到得到GA4结晶和母液，测得效价为1200mg/L。再向母液中加丙酮萃取，sevage法洗脱得到GA1结晶，测得效价为2700mg/L。

Claims (7)

1.一种赤霉菌发酵生产的赤霉素GA1和GA4的工艺，其具体步骤如下：
A、将赤霉菌CGMCC NO.5588 1～3菌环接至活化培养基，进行双阶段活化培养：在活化前期，培养温度为27～29℃，摇床转速为200～250rpm，控制菌液pH为4.0～5.0，培养时间为12～48h；在活化后期，培养温度为30～32℃，摇床转速为300～400rpm，控制菌液pH为6.5～7.5，培养时间为3～5天得活化菌液；
B、将活化菌液接种到复合发酵培养基中，控制发酵温度为25～34℃；发酵时pH值为5.0～7.0，发酵4～15天后得赤霉素GA1和GA4发酵液；
C、发酵液用大孔吸附树脂柱吸附，用丙酮洗脱吸附树脂柱，树脂体积投加量为6～8％，吸附时间1.0～2.0h，吸附流速0.1～0.3ml/min，pH调整为4.0～6.0，得吸附液；加乙酸乙酯萃取，得到GA4结晶和母液；向母液中加丙酮萃取，sevage法洗脱得到GA1。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于活化培养基的体积装液量为10～15％。
3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于活化培养基的成分为：葡萄糖70～85g/L，小麦蛋白3～4.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1～0.4g/L，KH2PO4 1.0～2.0g/L，NaMoO4·2H2O 0.03～0.06g/L；微量元素：H3BO3 290～310mg/L，MnCl2·4H2O 90～110mg/L，ZnSO4·7H2O 90～110mg/L，FeCl3·6H2O 190～210mg/L，CuCl2·2H2O 480～520mg/L；pH为4.0～5.0。
4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于活化菌液按复合发酵培养基体积的10～15％接种到复合发酵培养基中。
5.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于发酵培养基体积装液量为10～15％。
6.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于发酵培养基的组分及各组分占发酵培养基总量的质量百分比为碳源30～50％，氮源10～20％，微量元素1～5％，其余为水。
7.根据权利要求6所述的工艺，其特征在于所述的碳源为葡萄糖、葡聚糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、糊精、玉米粉、燕麦粉、淀粉、植物油、糖蜜或脱脂乳中的一种或几种；氮源为硫酸铵、氯化铵、赖氨酸、酒石酸铵、酵母水解物、酵母自水解物、酵母提取物、酵母细胞、酪蛋白水解物、黄豆粉、花生粉或者棉籽饼粉中的一种或几种；微量元素为金属的氯化盐、硫酸盐、硝酸盐或磷酸盐，其中金属为钠、钾、钙、镁、锌、锰、钴或磷中的一种或几种。
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