CN101041837B - 一种新的天然脱落酸制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种采用葡萄孢霉属(Botrytis)真菌的遗传改良菌TBC-10，在发酵过程中流加肌醇解除葡萄糖阻遏的工艺来制备天然脱落酸的方法。该方法包括下列步骤：将葡萄孢霉TBC-10菌在第一级液体培养基中培养；将培养好的第一级种子液接种于第二级液体培养基上培养；在第三级液体培养基中流加补料，并同时流加肌醇进行发酵培养；以及从发酵培养液中收集所得的脱落酸。本发明采用基因工程获得的遗传改良菌，并配合流加肌醇进行发酵的方法，可人为调控发酵体系中碳、氮比例，解除了葡萄糖阻遏，提高了菌体对培养基中其他糖类的利用率，使菌株以较高的底物转化率和产物合成速率生产脱落酸，提高了产量和生产效率，大大节约了能耗和原材料，降低了生产成本，简化了生产工艺。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种通过在发酵过程中流加肌醇解除葡萄糖阻遏的工艺来制备天然脱落酸的方法，以及在这种方法中所采用的新菌种，其中该菌种是通过基因定向诱变技术改良天然脱落酸产生菌种而获得的。
二、背景技术
脱落酸(ABA)是目前世界上已发现的五大植物激素之一。天然型的脱落酸由于对农作物的生长发育具有很强的调节活性，能促进果实类、谷类、豆类的成熟发育，能大幅度提高其产量和质量，又能大大增强其耐寒、抗旱和抗盐碱能力，因而具有广阔的应用前景。目前，脱落酸在基础领域的研究已深入到植物细胞与基因工程水平。然而，由于存在于植物体内的天然脱落酸的光学构型仅为(S)-(+)-脱落酸，单纯的(S)-(+)-脱落酸的生产成本极高，售价昂贵，而人工合成的脱落酸是外消旋体，活性远小于天然型的脱落酸。因此，脱落酸应用于农业生产几乎是空谈。
为了解决和满足脱落酸应用于农业生产的需要，近二十年来，国外(特别是日本)一直在研究利用微生物发酵法来生产天然脱落酸。例如，已知可用真菌灰葡萄孢(Botrytisc inerea)来生产天然脱落酸，并公开了例如采用纤维素泡沫作载体的液体发酵，发酵产量有所提高，最高的产量达300毫克/升发酵量(参见，例如JP-A-6-247927、JP-A-6-197775、Jp-A-6-1 33786、JP-A-6-7180、JP-A-2-10988、JP-A-2-60590、JP-A-63-296696、JP-A-58-51895)；另外，CN1182798A公开了一种通过真菌发酵 生产天然脱落酸的方法，该方法采用三级发酵，在第三级发酵中采用连续流加补料出料以及菌种固定化，并添加关键底物，使产酸量稳定，脱落酸的最高产量达到1.2克/升发酵液。专利ZL00132024.6公开了制备天然脱落酸的方法，该方法是通过采用真菌批次液体培养基流加补料工艺来制备天然脱落酸的方法。
但现有技术中的微生物菌种是属于细胞水平的诱变改良的产物，脱落酸产量有一定局限性；发酵工艺(固体发酵、液体批次发酵和连续流加补料出料工艺、批次液体培养基流加补料工艺等)仍然受到葡萄糖阻遏的限制，当底物糖浓度较高时，产生细胞代谢抑制作用，菌体对其他糖的利用率降低，甚至不再分泌产物，造成产量低，成本高的后果。
三、发明内容
针对现有技术中已知的用微生物发酵生产天然脱落酸工艺中所存在的葡萄糖阻遏现象、发酵产量较低，生产成本高等的不足，本发明者进行了深入的研究，寻找出了一种更简便易行，脱落酸产量更高，生产成本更低的改进工艺，从而完成了本发明。
本发明的目的是提供一种通过流加肌醇解除葡萄糖阻遏的发酵工艺，发酵生产天然脱落酸的方法。
本发明的另一目的是提供一种用于产生天然脱落酸的新菌株。
更具体地说，本发明提供一种制备天然脱落酸的新方法，它包含如下步骤：
将能够产生天然脱落酸的真菌在一级液体培养基(例如，下文所述的培养基A)中培养，所述的真菌选自：葡萄孢霉属(Botrytis)(例如， Botrytis cinerea)、尾孢霉属(Cercospora)(例如，Cercosporarosicola)、青霉菌属(Penicillium)，曲霉属(Aspergillus)及上述菌株的遗传改良菌等；
将在上述第一级液体培养基中培养好的第一级种子液接种到第二级液体培养基(例如，下文所述的培养基B)中培养；
将在上述第二液体培养基中培养得到的第二级种子液接种到第三级液体培养基(例如，下文中所述的培养基C)中培养一段合适的时间后，开始进行第三级液体培养基流加补料发酵培养，同时流加一定浓度的肌醇，以解除葡萄糖阻遏，提高菌体对第三级液体培养基中其他糖类的利用率；
从上述发酵培养液中收集所得的脱落酸。
本发明的具体实施方案是，采用产生天然脱落酸的葡萄孢霉菌(例如，Botrytis cinerea)、尾孢霉菌(例如，Cercospora rosicola)、曲霉菌(Aspergillus)或其它产生天然脱落酸的真菌及其遗传改良菌，在液体培养基上进行三级发酵培养，在每级发酵阶段选用不同的培养基。在第三级发酵中，以适合于第三级发酵的液体培养基，例如下文中描述的培养基C，作为发酵培养基，适合的温度下培养一段时间后，例如，在大约26℃发酵培养12-72小时后，开始液体培养基流加补料，并同时流加一定浓度的肌醇。
第三级液体培养基(例如培养基C)流加补料方式可以采用连续(匀速或非匀速)流加和/或间歇式流加方式，间歇流加方式是优选的，该方法是已知的(专利ZL00132024.6中公开)。
肌醇流加方式可以采用连续(匀速或非匀速)流加和/或间歇式流加方式，连续(匀速或非匀速)流加方式是优选的。
所述的连续(匀速或非匀速)流加方式，是以一定的流加速率(匀速或非匀速)将一定浓度的肌醇，连续流加入第三级发酵罐，直至停止发酵(下罐)前例如大约10小时。
所述的间歇式流加方式，是以间隔一段时间加一次料的方式，间歇式将一定浓度的肌醇，流加入第三级发酵罐。间歇时间优选为每隔8-30小时补料1-5次，更优选为大约间隔10小时补料1次。本领域技术人员也可根据需要，采用其它的适合时间间隔补料流加。
发酵条件：温度23℃-29℃，pH：4-7
发酵时间：8-9天。
采用本发明工艺，在第三级发酵时，液体培养基只流加补料而不出料。通过流加一定浓度的肌醇，解除葡萄糖阻遏，提高菌体对培养基中其他糖类，如蔗糖、糖蜜、乳糖、糊精及其他淀粉水解物等的利用率，提高产酸率，降低生产成本。发酵培养液中的脱落酸用常规方式回收，例如采用有机溶剂萃取法、离子交换树脂法、大孔吸附树脂法、硅胶柱层析法及活性碳吸附法等提取后，即得白色结晶脱落酸。
在优选的具体实施方案中，本发明还采用例如新菌株等技术方案来进一步提高天然落脱酸的产量。
本发明方法可以采用已知的产生天然脱落酸的菌株，例如，已知的、或由遗传工程或基因工程学方法获得的产生天然脱落酸的葡萄孢霉属菌(例如，Bot rytis cinerea)、尾孢霉属菌(例如，Cercosporarosicola)、曲霉属菌(Aspergillus)，或其它产生天然脱落酸的真菌及其遗传改良菌。在优选的本发明方法中，使用已知的产生脱落酸的高产菌种，例如Botrytis cinerea TB-3-H8、TBI-9(CGMCC No.0500，已在专利ZL-00132024.6中公开)、TBC-10、Ferm P-6156，B.C.FD338等。在最优选的本发明方法中使用新菌株：脱落酸高产菌株灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)TBC-10，其已在2006年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市海淀区中关村北一条13号，保藏号为CGMCC No.1889，分类命名为：灰葡萄孢霉，Botrytis cinerea。该菌株是将灰葡萄孢霉菌(Botrytiscinerea)TB-3-A3采用基因定向诱变技术，获得了24个碱基的改变，并导致对应编码的五个氨基酸的改变，从而获得新菌种TBC-10，(基因序列和氨基酸序列的对比序列来自菌株灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)3.3790，中国科学院微生物研究所菌种保藏中心购买，或Genebank上其它同源性较高的物种的FPPS)。
TBC-10菌株的基因序列具有如下特征：
该菌株与菌株灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)3.3790的法尼基焦磷酸酯合成酶(FPPS：Farnesyl diphosphate/pyphosphate synthase)的基因序列比对，有24个碱基的改变。
FPPS序列比对：
上行：灰葡萄孢霉3.3790的FPPS基因序列，2627bp片段，从1到2627
下行：TBC-10菌株的FPPS基因序列，2627bp片段，从1到2627
二者各编码347个氨基酸，共有24处碱基差异，差异处用“|”表示，其中编码区域差异为5处，编码区用粗体标注。
1 TTTCTAGTATGTAACTCTATAATCCTTAAATTCCTTTCTATAGGATTATAGTTCTCTACC
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起始密码
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|
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| 终止密码
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2581 ACTGAAACTTTTACTCTCGTCTGCTTGAGATTTAACTCATCGAATAG 2627
2581 ACTGAAACTTTTACTCTCGTCTGCTTGAGATTTAACTCATCGAATAG 2627
TBC-10菌株的氨基酸序列具有如下特征：
该菌株与菌株灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)3.3790的法尼基焦磷酸酯合成酶(FPPS：Farnesyl diphosphate/pyphosphate synthase)的氨基酸序列比对，有五个氨基酸的改变(①-⑤位点)；与Genebank上其它同源性较高的物种的的法尼基焦磷酸酯合成酶(FPPS：Farnesyldiphosphate/pyphosphate synthase)的氨基酸序列比对，有四个氨基酸的改变(①、③、④、⑤位点)
FPPS氨基酸序列比对：
上行：灰葡萄孢霉3.3790的FPPS氨基酸序列
下行：TBC-10菌株的FPPS氨基酸序列
共有5个氨基酸的差异，差异处用“|”表示。
1 MAKATTLKEFESVFPKLVDDLLAHAQKYNLPQQGQDWLKASLNANTIGGKCNRGMSVPDS
|① |② |③
1 MAKATTLKEFESVFPKLVDDLLAHAQKYNLPQQGQDWPKASLSANTVGGKCNRGMSVPDS
61 VSLLLEAPLSEEQYFESATLGWMTELLQAFFLVSDDIMDSSITRRGQPCWYRQPGVGMIA
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121 INDAFLLEAAIYSLLKKYFRSHPSYLDLIELFHEVTYQTELGQLCDLLTAPEDKVDLDNF
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181 SMTKYDFIVTYKTAYYSFYLPVALALHHQKIATPKNLKQVEDILIPLGQYFQIQDDYLDN
|④
181 STTKYDFIVTYKTAYYSFYLPVALALHHQKIATPKNLKQVEDILIPLGQYFQIQDDYLDN
241 FGLPEHIGKIGTDIMDNKCSWLVNKALAIATPEQRQILEENYGHKDKTKEAAVKKLFDEL
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301 NLKQIYEDYEEKRVGEIREMISQVDESEGLKKTVFESFLSKIYKRSK 347
|⑤
301 NLKQIYEDYEEKRVGEIREMISQVDESEGLRKTVFESFLSKIYKRSK 347
本发明工艺过程采用三级发酵技术，采用三级发酵来制备脱落酸是已知的(参见，例如，CN1182798A)。根据三级发酵的不同要求，分别选择三种不同的培养基来进行发酵，这些培养基可以是本领域技术人员已知的适合于此目的的培养基或是发明专利ZL001 32024.6中公开的培养基。使用发明专利ZL001 32024.6中公开培养基是优选的。发明专利ZL00132024.6中公开了培养基A、B、C，其具体组成如下：
培养基C
| 成分 | 一般范围 | 优选范围 | 最优选范围 |
| 糊精 | 1.0％-30.0％ | 5.0％-20.0％ | 5.0％-10.0％ |
| 麦麸 | 0.1％-20.0％ | 0.1％-5.0％ | 0.3％-2.0％ |
| 乙二醇 | 0.01％-10.0％ | 0.01％-5.0％ | 0.02％-0.5％ |
| 甘油 | 0.1％-20.0％ | 0.1％-3.0％ | 0.1％-0.3％ |
| 脂肪酸 | 0.1％-10.0％ | 0.1％-5.0％ | 0.1％-2.0％ |
| 葡萄糖 | 0.1％-25.0％ | 0.1％-5.0％ | 0.5％-2.0％ |
| 麦芽糖 | 0.1％-20.0％ | 0.1％-7.0％ | 0.5％-3.0％ |
| 蔗糖 | 0.1％-30.0％ | 0.5％-30.0％ | 1.0％-5.0％ |
| 废糖蜜 | 0.1％-50.0％ | 0.1％-20.0％ | 1.0％-10.0％ |
| 乳糖 | 0.1％-50.0％ | 0.1％-20.0％ | 0.1％-1.0％ |
| 豆饼粉 | 0.01％-20.0％ | 0.01％-2.0％ | 0.01％-1.0％ |
| 硫胺素 | 0.0001％-5.0％ | 0.0001％-5.0％ | 0.0001％-0.5％ |
| 磷酸氢钾 | 0.001％-10.0％ | 0.01％-1.0％ | 0.01％-0.1％ |
| 磷酸二氢钾 | 0.001％-10.0％ | 0.01％-1.0％ | 0.01％-0.1％ |
| 硫酸镁 | 0.01％-2.0％ | 0.03％-0.2％ | 0.03％-0.1％ |
| 硫酸锰 | 0.01％-2.0％ | 0.03％-0.2％ | 0.03％-0.1％ |
| 硫酸镍 | 0.001％-2.0％ | 0.003％-0.2％ | 0.003％-0.1％ |
本发明优选实施方案是在已知的发酵工艺过程(发明专利ZL00132024.6中公开)基础上，在第三级发酵培养中流加一定浓度的肌醇。即：将活化的菌种接种于培养基A中，固体培养或三角瓶内23℃-29℃下摇瓶培养24-76小时后，以10％-50％的接种量接种于已加有灭菌培 养基B的种子罐中，在23℃-29℃下发酵培养24-60小时，然后按优选10％-40％的接种量接种于第三级发酵罐中进行发酵生产。第三级发酵以培养基C作为发酵培养基，在大约26℃发酵培养12-72小时后，开始将培养基C和一定浓度的肌醇的流加补料。
肌醇流加方式有两种：一种是连续(匀速或非匀速)流加，一种是间歇式流加，前者是优选的。
采用前一种方式时，以0.01-10μg/L·h的速度连续(匀速或非匀速)流加肌醇，直至停止发酵(下罐)前约10小时。
采用后一种方式时，则间歇式流加肌醇，间歇时间为每隔8-30小时补料1-5次，优选为大约间隔10小时补料1次，每次补加量为0.05-50mg/L发酵液，优选0.1-10 mg/L发酵液。
采用本发明工艺时，底物流加补料不用出料。在调节(升高或降低)发酵液溶解氧浓度，控制温度、泡沫等手段降低菌的新陈代谢等基础上，通过流加一定浓度的肌醇，能够解除葡萄糖阻遏，提高菌体对培养基中其他糖类，如蔗糖、糖蜜、乳糖、糊精及其他淀粉水解物等的利用率，提高产酸率，降低生产成本。发酵结束后将发酵液用有机溶剂萃取法、离子交换树脂法、大孔吸附树脂法、硅胶柱层析法及活性碳吸附法等提取后，即得白色结晶脱落酸。
发酵条件：温度：23℃-29℃，pH：4-7
发酵时间：8-9天。本发明的全工艺流程见附图1。
在最优选的本发明方法中，通过使用产生天然脱落酸高产菌株，促进了产物的生成，大幅度提高了脱落酸产量。
采用本发明方法发酵生产天然脱落酸可人为调控发酵体系中碳、氮比例，解除了葡萄糖阻遏，提高了菌体对培养基中其他糖类的利用率，使菌株以较高的底物转化率和产物合成速率生产脱落酸，从而提高了产量，大大节约了能耗和原材料，提高了生产效率，降低了生产成本，简化了微生物生产脱落酸的发酵生产工艺。
采用现有工艺与本发明工艺生产脱落酸的比较结果见下文表1
| 工艺 | 菌种 | 脱落酸产 量(g/L) | 发酵周期 (天) | 杂菌污染 率(％) | (葡萄糖除外的) 其他糖类利用率(％) |
| 液体批次发酵 | TB-3-H8 | 1.0 | 10-30 | 30 | 30％ |
| 连续流加补料 出料 | TB-3-H8 | 1.2 | 10-30 | 50 | 40％ |
| 批次底物流加 补料 | TB-3-H8 | 1.6 | 8-9 | 10 | 50％ |
| 批次底物流加 补料及流加肌 醇(本发明) | TB-3-H8 | 2.0 | 8-9 | 8 | 80％ |
*TB-3-H8(灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea))(谭红等，利用原生质体诱变技术筛选脱落酸高产菌株，应用与环境生物学报1998，4(3)：281-285)，(开放证明后附)。
四、附图说明：
图1为本发明的工艺流程图。
五、具体实施方式
本发明方法采用下文的非限定性实施例作进一步说明。
实施例1
用1000ml三角瓶25个，每瓶装300ml培养基A于120℃灭菌，冷却后接种活化后的脱落酸高产菌株灰葡萄孢霉TBC-10 CGMCC No.1889孢子悬液，置于25℃温度下，摇瓶培养24-46小时。将培养好的一级种子液按13％-15％接种量接种于内装50升培养基B的100立升发酵罐中(二级种子罐)，在26℃-28℃温度下通气搅拌培养24-40小时。
用1吨发酵罐做三级罐发酵，罐内装培养基C约500L，用常规高压热蒸汽灭菌法灭菌后，按10％-15％接种量接种二级罐种子液，通气搅拌发酵20-40小时后，间歇式流加补料液培养基C，间歇时间为每隔10-15小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.1％-0.5％。间歇式流加肌醇，间歇时间为每隔12小时补料2次，每次补加量为0.5-3.0 mg/L发酵液。
实施过程中所用培养基组合如下：
发酵温度为27℃，发酵pH 4-7。发酵时间达到9天时下罐。
下罐发酵液以离子交换树脂法回收产品，并用乙醇洗脱，经重结晶，得白色结晶状脱落酸产品。经检测：发酵系统经过9天的稳定发酵，杂菌污染率为5.0％，产物产量达2.1克脱落酸/升发酵液。经离子交换法及重结晶回收，产品回收率达85％。
实施例2
用1000ml三角瓶50个，每瓶装300ml培养基A于120℃灭菌，冷却后接种活化后的脱落酸高产菌株灰葡萄孢霉TBC-10 CGMCC No.1889孢子悬液，置于25℃温度下，摇瓶培养24-33小时。将培养好的一级种子液按15％-18％接种量接种于内装100升培养基B的200立升发酵罐中(二级种子罐)，在约26℃温度下通气搅拌培养24-30小时。
用1吨发酵罐做三级罐发酵，罐内装培养基C约500L，用常规高压热蒸汽灭菌法灭菌后，按20％-25％接种量接种二级罐种子液，通气搅拌发酵15-24小时后，间歇式流加补料液培养基C，间歇时间为每隔20-28小时补料1-3次，每次补料量为发酵液总体积的0.05％-0.3％。以0.1- 1.0μg/L·h的速度连续(匀速或非匀速)流加肌醇，直至停止发酵(下罐)前约10小时。
实施过程中所用培养基组合如下：
发酵温度为约27℃，发酵pH 4-7，发酵时间达到9天时下罐。
下罐发酵液以离子交换树脂法回收产品，并用乙醇洗脱，经重结晶，得白色结晶状脱落酸产品。经检测：发酵系统经过9天的稳定发酵，杂菌 污染率为5.0％，产物产量达2.4克脱落酸/升发酵液。经离子交换法及重结晶回收，产品回收率达8 5％。
实施例3
用1000ml三角瓶30个，每瓶装300ml培养基A于120℃灭菌，冷却后接种活化后的脱落酸高产菌株灰葡萄孢TBI-9 CGMCC No.0500孢子悬液，置于27℃温度下，摇瓶培养24-33小时。将培养好的一级种子液按15％-20％接种量接种于内装50升培养基B的100立升发酵罐中(二级种子罐)，在约26℃温度下通气搅拌培养24-30小时。
用1吨发酵罐做三级罐发酵，罐内装培养基C约500L，用常规高压热蒸汽灭菌法灭菌后，按10％-15％接种量接种二级罐种子液，通气搅拌发酵15-24小时后，以0.1-5L/h的速度连续流加培养基C，直至停止发酵(下罐)前10小时。以0.1-5.0μg/L·h的速度连续(匀速或非匀速)流加肌醇，直至停止发酵(下罐)前约10小时。
实施过程中所用培养基组合如下：
发酵温度为约26℃，发酵pH 4-7，发酵时间达到9天时下罐。
下罐发酵液以离子交换树脂法回收产品，并用乙醇洗脱，经重结晶，得白色结晶状脱落酸产品。经检测：发酵系统经过9天的稳定发酵，杂菌污染率为8.0％，产物产量达2.1克脱落酸/升发酵液。经离子交换法及重结晶回收，产品回收率达84％。
实施例4
用1000ml三角瓶25个，每瓶装300ml培养基A于120℃灭菌，冷却后接种活化后的脱落酸高产菌株TB-3-H8孢子悬液，置于约26℃温度下，摇瓶培养40-56小时。将培养好的一级种子液按15％-20％接种量接种于内装50升培养基B的100立升发酵罐中(二级种子罐)，在26℃-27℃温度下通气搅拌培养24-26小时。
用1吨发酵罐做三级罐发酵，罐内装培养基C约500L，用常规高压热蒸汽灭菌法灭菌后，按10％-15％接种量接种二级罐种子液，通气搅拌发酵 20-48小时后，间歇式流加补料液培养基C，间歇时间为每隔15-28小时补料1-2次，每次补料量为发酵液总体积的0.1％-0.5％。以0.1-3.0μg/L·h的速度连续(匀速或非匀速)流加肌醇，直至停止发酵(下罐)前约10小时。
实施过程中所用培养基组合如下：
发酵温度为约27℃，发酵pH 4-7。发酵时间达到9天时下罐。
下罐发酵液以离子交换树脂法回收产品，并用乙醇洗脱，经重结晶，得白色结晶状脱落酸产品。经检测：发酵系统经过9天的稳定发酵，杂菌污染率8.0％，产物产量达2.0克脱落酸/升发酵液。经离子交换法及重结晶回收，产品回收率达82％。
对比实施例5
采用连续流加补料出料工艺。
用1000ml三角瓶30个，每瓶装300ml培养基A于120℃灭菌，冷却后接种活化后的脱落酸高产菌株TB-3-H8，孢子悬液，置于约26℃温度下，摇瓶培养40-56小时。将培养好的一级种子液按15％-20％接种量接种于内装50升培养基B的100立升发酵罐中(二级种子罐)，在26℃-27℃温度下通气搅拌培养24-26小时。
用1吨发酵罐做三级罐发酵，罐内装培养基C约500L及微孔陶瓷珠(粒径0.9-160mm3，1.0-5g/L，购自江西景德镇特种陶瓷研究所)，用常规高压热蒸汽灭菌法灭菌后，按10％-15％接种量接种二级罐种子液，通气搅拌发酵20-48小时后，然后通入氨将pH控制在3-8，降低发酵温度至10℃-2 5℃，以0.01-5 L/h的速度连续流加培养基C，以0.5-1.0μg/L·h的速度连续(匀速或非匀速)流加肌醇。每隔10小时出料一次。发酵温度为约27℃，发酵pH 4-7。
实施过程中所用培养基组合，与对比实施例4相同。
发酵时间达到25天时下罐。
下罐发酵液以离子交换树脂法回收产品，并用乙醇洗脱，经重结晶，得白色结晶状脱落酸产品。经检测：发酵系统经过25天的稳定发酵，杂 菌污染率为30.0％，产物产量达1.6克脱落酸/升发酵液。经离子交换法及重结晶回收，产品回收率达82％。
实施例6
用1000ml三角瓶50个，每瓶装300ml培养基A于120℃灭菌，冷却后接种活化后的脱落酸高产菌株灰葡萄孢霉TBC-10 CGMCC No.1889孢子悬液，置于25℃温度下，摇瓶培养24-33小时。将培养好的一级种子液按15％-18％接种量接种于内装100升培养基B的200立升发酵罐中(二级种子罐)，在约26℃温度下通气搅拌培养24-30小时。
用1吨发酵罐做三级罐发酵，罐内装培养基C约500L，用常规高压热蒸汽灭菌法灭菌后，按20％-25％接种量接种二级罐种子液，通气搅拌发酵15-24小时后，间歇式流加补料液培养基C，间歇时间为每隔20-28小时补料1-3次，每次补料量为发酵液总体积的0.05％-0.3％。直至停止发酵(下罐)前约10小时。
实施过程中所用培养基组合如下：
发酵温度为约27℃，发酵pH 4-7。发酵时间达到9天时下罐。
下罐发酵液以离子交换树脂法回收产品，并用乙醇洗脱，经重结晶，得白色结晶状脱落酸产品。经检测：发酵系统经过9天的稳定发酵，杂菌污染率为5.0％，产物产量达2.0克脱落酸/升发酵液。经离子交换法及重结晶回收，产品回收率达85％。
序列表
<110>中国科学院成都生物研究所
<120>一种新的天然脱落酸制备方法
<140>200710002609.2
<141>2007.01.24
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>2627
<212>DNA
<213>灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)3.3790菌株
<220>
<221>exon
<222>(331)..(450)
<220>
<221>exon
<222>(514)..(1434)
<400>1
tttctagtat gtaactctat aatccttaaa ttcctttcta taggattata gttctctacc 60
actctaaatc aaacctataa atcattctaa acacgaattc ccaaattatc taaactataa 120
atcttttgtc acattgggat tcacccgtct tatcggtcgc cgagaaatta tactttcttc 180
atgaatgtcc tatgagtccg tgcacccact tagtgcaccc ttcacctctc tacaagtact 240
ggtaaccata ctcttcattc tctagccatc aatacttttc gtcctatcct aagtaaccga 300
cttctatcaa tcatcacata cgcaatagca atg gcg aag gct acc act ctc aag 354
Met Ala Lys Ala Thr Thr Leu Lys
1 5
gag ttc gaa tcc gtc ttc cca aaa ttg gtt gat gat tta ctc gcc cat 402
Glu Phe Glu Ser Val Phe Pro Lys Leu Val Asp Asp Leu Leu Ala His
10 15 20
gcc caa aag tac aac ctc cct caa cag ggt caa gat tgg ctc aag gct 450
Ala Gln Lys Tyr Asn Leu Pro Gln Gln Gly Gln Asp Trp Leu Lys Ala
25 30 35 40
gtgagtgact tttcagaaga atcattggaa atggcatgta ctgatctgac ttccttcgta 510
tag tcc cta aat gcc aac acg att ggc gga aaa tgc aat cgt gga atg 558
Ser Leu Asn Ala Asn Thr Ile Gly Gly Lys Cys Asn Arg Gly Met
45 50 55
tct gtt ccc gac tca gta tct ctc ctc ctc gaa gct cca cta tct gaa 606
Ser Val Pro Asp Ser Val Ser Leu Leu Leu Glu Ala Pro Leu Ser Glu
60 65 70
gaa caa tac ttc gaa tct gcc aca tta gga tgg atg act gag ctc ctc 654
Glu Gln Tyr Phe Glu Ser Ala Thr Leu Gly Trp Met Thr Glu Leu Leu
75 80 85
caa gct ttc ttc ctt gta tca gac gat atc atg gac agc agc atc act 702
Gln Ala Phe Phe Leu Val Ser Asp Asp Ile Met Asp Ser Ser Ile Thr
90 95 100
cgt cgt ggt caa cct tgt tgg tac aga cag cca ggt gtt ggt atg atc 750
Arg Arg Gly Gln Pro Cys Trp Tyr Arg Gln Pro Gly Val Gly Met Ile
105 110 115
gct atc aac gac gct ttc ctc ctc gaa gcc gcg atc tac tct tta ttg 798
Ala Ile Asn Asp Ala Phe Leu Leu Glu Ala Ala Ile Tyr Ser Leu Leu
120 125 130 135
aag aaa tat ttc cgc tct cac cct tcc tac ctt gat ctc atc gaa ctc 846
Lys Lys Tyr Phe Arg Ser His Pro Ser Tyr Leu Asp Leu Ile Glu Leu
140 145 150
ttc cac gaa gtt aca tac cag aca gaa ctt ggt caa ttg tgc gat ttg 894
Phe His Glu Val Thr Tyr Gln Thr Glu Leu Gly Gln Leu Cys Asp Leu
155 160 165
ttg aca gca cca gag gac aag gtc gac ttg gac aac ttt tct atg acc 942
Leu Thr Ala Pro Glu Asp Lys Val Asp Leu Asp Asn Phe Ser Met Thr
170 175 180
aag tat gac ttc att gtc aca tac aag act gct tat tat tcc ttc tac 990
Lys Tyr Asp Phe Ile Val Thr Tyr Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr
185 190 195
ctt cct gtc gcc ctc gca ctt cac cac cag aag atc gcg act cca aag 1038
Leu Pro Val Ala Leu Ala Leu His His Gln Lys Ile Ala Thr Pro Lys
200 205 210 215
aat ctt aag caa gtc gaa gat atc ttg att ccg ctt ggc caa tat ttc 1086
Asn Leu Lys Gln Val Glu Asp Ile Leu Ile Pro Leu Gly Gln Tyr Phe
220 225 230
caa atc caa gat gat tat ctt gac aac ttt ggt cta cca gag cac att 1134
Gln Ile Gln Asp Asp Tyr Leu Asp Asn Phe Gly Leu Pro Glu His Ile
235 240 245
ggc aag att gga act gat atc atg gac aac aag tgc tct tgg ctc gta 1182
Gly Lys Ile Gly Thr Asp Ile Met Asp Asn Lys Cys Ser Trp Leu Val
250 255 260
aac aaa gca ttg gct att gca aca ccc gag caa cgt caa ata ctc gag 1230
Asn Lys Ala Leu Ala Ile Ala Thr Pro Glu Gln Arg Gln Ile Leu Glu
265 270 275
gag aac tat ggt cac aaa gac aag act aag gaa gcc gct gtg aag aag 1278
Glu Asn Tyr Gly His Lys Asp Lys Thr Lys Glu Ala Ala Val Lys Lys
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cta ttc gat gag tta aat ctc aag cag atc tac gag gac tat gaa gag 1326
Leu Phe Asp Glu Leu Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Glu Asp Tyr Glu Glu
300 305 310
aag agg gtt ggt gaa ata aga gaa atg att tca caa gtt gat gag tct 1374
Lys Arg Val Gly Glu Ile Arg Glu Met Ile Ser Gln Val Asp Glu Ser
315 320 325
gaa ggt tta aag aag act gtg ttt gag agc ttc ttg agc aag att tac 1422
Glu Gly Leu Lys Lys Thr Val Phe Glu Ser Phe Leu Ser Lys Ile Tyr
330 335 340
aag aga agc aag taaacggaca ggatccttgt ttgtcgcgcg tacttttttg 1474
Lys Arg Ser Lys
345
caccaacgaa cagcgagcta tgcttcttct aaaagttgtt ggaatttata gagctgagtt 1534
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gcgccagtga ttttctcttt gccgcttttt tattttattt tctcatggtc cataaatctt 1654
aatgtcctag atgcaaaaca ctttcgtttc tttttggagc gaggggtatt ttgtgcttcc 1714
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cgacgtcgcc cacacaattc tgtctcttgc gcccagtatg tctagtagtt catactgtta 1894
gactgaatat cagttctgag tattcagaaa aaccttgatt ttcgaagtaa tttaacattt 1954
taaaatttaa actacttgaa tgttcctgtt gaattcggat ttcggaagct tctgattgat 2014
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<211>2627
<212>DNA
<213>灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)TBC-10菌株
<220>
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<222>(331)..(450)
<220>
<221>exon
<222>(514)..(1434)
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Claims (8)
1.一种制备天然脱落酸的方法，它包含如下步骤：
将能够产生天然脱落酸的真菌在第一级液体培养基中培养，所述的真菌是灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)TBC-10，其保藏号为CGMCC No.1889；
将在上述第一级液体培养基中培养好的第一级种子液接种到第二级液体培养基上进行培养；
将在上述第二级液体培养基中培养得到的第二级种子液接种到第三级液体培养基中，在26℃发酵培养12-72小时后，开始进行第三级液体培养基流加补料，并同时流加肌醇发酵培养；
从上述发酵培养液中收集所得的脱落酸。
2.根据权利要求1的方法，其中，肌醇流加补料为连续流加或间歇式流加方式。
3.根据权利要求2的方法，其中连续流加为匀速或非匀速流加。
4.根据权利要求2的方法，其中所述的连续流加方式，是以0.01-10μg/L·h的流加速率将肌醇连续流加入第三级发酵罐，直至停止发酵前10小时。
5.根据权利要求2的方法，其中所述的间歇式流加肌醇方式，是每间歇8-30小时补料1-5次。
6.根据权利要求5的方法，其中每间隔10小时补料1次，每次补加量为0.05-50mg/L发酵液。
7.根据权利要求6的方法，其中每次补加量为0.1-10mg/L发酵液。
8.灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)TBC-10，其特征在于所述菌株的保藏号为CGMCC No.1889。
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| 张厚程等.INO1基因在粟酒裂殖酵母中的表达及对蔗糖酶分泌和磷脂合成的影响.山东大学学报（理学版）37 6.2002,37(6),摘要，第545页左栏第1-2段. |
| 张厚程等.INO1基因在粟酒裂殖酵母中的表达及对蔗糖酶分泌和磷脂合成的影响.山东大学学报(理学版)37 6.2002,37(6),摘要,第545页左栏第1-2段. * |
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