CN113278657B - 一种制备1′，4′-反式-aba-二醇的发酵方法 - Google Patents

一种制备1′，4′-反式-aba-二醇的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种制备1',4'‑反式‑ABA‑二醇的发酵方法。采用灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)遗传改良菌株ZX2，通过二级发酵培养及培养基流加补料方法，可以维持菌株生长和合成产物需求的较好的碳氮比，获得较高产量的1',4'‑反式‑ABA‑二醇。本方法工艺简单易行，易于操作，适合工业化生产。本发明还提供了1',4'‑反式‑ABA‑二醇在作物栽培上的应用方法。

Description

一种制备1′，4′-反式-ABA-二醇的发酵方法
技术领域
本发明涉及微生物药物生物技术领域，具体涉及1′，4′-反式-ABA-二醇的发酵制备方法。
背景技术
1′，4′-反式-ABA-二醇是真菌脱落酸(Abscisic acid，ABA)合成途径中的一种ABA的前体类似物，其化学式是C15H22O4。其化学结构见附图1。
1967年Cornfor等曾报道过用化学合成1′，4′-反式-ABA-二醇酯的方法，1972年Walton等用Cornfor报道的方法合成了1′，4′-反式-ABA-二醇，并测试了其对菜豆离体胚轴的生长抑制效果，结果发现具有明显的生长抑制作用。1986年Hirai等从1.1L灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea)培养基中分离到了6.0mg ABA和1′，4′-反式-ABA-二醇的混合物，发现1′，4′-反式-ABA-二醇在B.cinerea体内可以转化为ABA，因此认为它是ABA的前体。1987年Okamoto和Vaughan等均在豌豆和鳄梨中发现了1′，4′-反式-ABA-二醇，也能在体内转化为ABA。1988年Okamoto等通过2H标记实验发现赤松尾孢霉(Cercospora pini-densi florae)中1′，4′-反式-ABA-二醇可以合成ABA。而1989年Christopher等从氧标记的苹果果实中分离到ABA-醛和1′，4′-反式-ABA-二醇，认为1′，4′-反式-ABA-二醇可能是ABA的代谢产物。1995年Kettner等也发现灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)Bc6可以通过1′，4′-反式-ABA-二醇合成ABA。2004年Inomata也通过18O标记实验证实了1′，4′-反式-ABA-二醇是灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)ABA的合成前体。2006年王天山等也从灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)中分离出1′，4′-反式-ABA-二醇的无色晶体，并通过X射线衍射分析确定了其单晶结构，本实验室将其作为农药的名称自命名为芷香二醇。
由于ABA在植物生长调节中的重要作用，因此科学家也推测1′，4′-反式-ABA-二醇作为其前体类似物，可能也具有植物生长调节的功能。1972年，Walton等使用化学合成的14C标记的1′，4′-顺式-ABA-二醇和1′，4′-反式-ABA-二醇测试对菜豆离体胚轴的生长抑制效果：发现这两种物质均对菜豆离体胚轴的生长具有抑制作用，但效果稍低于ABA，推测这两种物质的生长抑制活性可能与其转化为ABA有关。2005年Asami等研究发现1′，4′-反式-ABA二醇的4′-甲氧基衍生物在水芹种子萌发和GA诱导的α-淀粉酶诱导试验中表现出与ABA相当水平的抑制活性，同时由于其结构特点使其不容易像ABA一样分解成红花菜豆酸类的物质而失活，因此具有成为植物生长调节剂的潜力。2005年，王天山等研究了灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)中1′，4′-反式-ABA二醇对稻谷种子的抑制活性，检测了其胚芽长抑制率、根长抑制率和根数抑制率，发现当浓度为0.5-5.0mg/L时，1′，4′-反式-ABA二醇具有明显的抑制种子萌发效果，，随着1′，4′-反式-ABA二醇浓度的增加，其抑制率也随之增强。
虽然1′，4′-反式-ABA二醇具有成为植物生长调节剂的潜力，但其合成方法十分有限，可将ABA通过重氮甲烷处理将其转化为脱落酸甲酯，再通过NaBH4依次还原合成，这种化学方法要通过ABA作为前体，且操作复杂。而文献报道的从灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)菌体或者植物中提取的1′，4′-反式-ABA二醇含量很低，例如1995年Kettner等报道灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)Bc6在合成ABA的同时伴随有1′，4′-反式-ABA二醇的合成，1′，4′-反式-ABA二醇最高含量不超过100μg/g DW菌体，同时灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)Bc6浸染的植物叶片中1′,4′-反式-ABA二醇含量大约4μg/g DW。以这样的产量来说要通过化学合成或生物中提取的方法实现1′,4′-反式-ABA二醇的低成本规模化生产有很大困难，因此也限制了1′,4′-反式-ABA二醇的农业应用与机理研究。
本实验室长期从事灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)代谢产物、发酵工艺技术研究。前期得到一株灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)TBC-10，已于2006年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1889。我们对该灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)TBC-10进行遗传改良，获得了高产1′,4′-反式-ABA二醇的菌株，并研究了该菌株发酵生产工艺；通过该发酵生产工艺，可以获得较高产量的1′,4′-反式-ABA二醇，实现1′,4′-反式-ABA二醇的低成本规模化生产；并获得了1′，4′-反式-ABA-二醇作为植物生长调节剂和植物抗逆诱导剂的应用方法。从而完成了本发明。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的之一，是提供一种用于生产1′，4′-反式-ABA-二醇(1′，4′-trans-diol-ABA)的新菌株；
本发明的目的之二，是提供一种“批次液体培养基流加补料发酵工艺”，发酵生产1′，4′-反式-ABA-二醇；
本发明的目的之三，是提供用于生产1′，4′-反式-ABA-二醇的培养基。
本发明的目的之四，是提供1′，4′-反式-ABA-二醇作为植物生长调节剂和抗逆诱导剂的应用方法。
更具体地说，是提供一种制备1′,4′-反式-ABA二醇的发酵方法，可大大提高合成1′,4′-反式-ABA二醇的效率，降低成本。包含以下步骤：
将能够产生1′，4′-反式-ABA-二醇的丝状真菌，例如：孢霉菌属(Botryotinia)的灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)，尾孢霉属(Cercospora)的赤松尾孢霉菌(C.pini-densiflorae)，或其它产生1′，4′-反式-ABA-二醇的真菌及其遗传改良菌株，在一级液体培养基(例如,下文所述的培养基A)中培养，作为种子液；将种子液接种到第二级液体培养基(例如，下文所述的培养基B)中培养；第二级液体培养基接种第一级种子液后培养一段合适的时间，开始进行流加补料液(例如，下文所述的补料液C)的补料发酵培养。
发酵结束后，从上述发酵培养液中收集1′，4′-反式-ABA-二醇，并进行提取和纯化。
本发明的具体实施方案是，采用已知的能够产生1′，4′-反式-ABA-二醇的丝状真菌，如：孢霉菌属(Botryotinia)的灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)，尾孢霉属(Cercospora)的赤松尾孢霉菌(C.pini-densi florae)，或其它产生1′，4′-反式-ABA-二醇的真菌及其遗传改良菌株，如灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)的遗传改良菌株等，在液体培养基中进行二级发酵培养，在每级发酵阶段选用不同的培养基，例如下文所述的培养基A、B。在第二级发酵中，接种第一级种子液后，在适合的温度下培养一段时间，例如，在23-26℃发酵培养12-72小时后，选用合适的补料液，例如下文所述的补料液C，进行流加补料发酵培养。
第二级液体培养流加补料(例如补料液C)的方式可以采用连续(匀速或非匀速)流加和/或间歇式流加方式，连续流加方式是优选的。
所述的连续(匀速或非匀速)流加方式，是以一定的流加速率，如0.01-10.0L/h，(匀速或非匀速)将适合的补料液(例如补料液C)连续流加入第二级发酵罐中，直至停止发酵(下罐)前大约10-48小时。
所述的间歇式流加方式，是以间隔一段时间加一次料的方式，间歇式将适合的补料液(例如补料液C)流加入第二级发酵罐中。间歇时间为每1-24小时补料1-8次，优选为间隔5-8小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.01-2.0％，优选0.05-0.5％。本领域技术人员也可以根据需要，采用其他的适合时间间隔补料。
发酵条件：温度23-26℃，pH：4-8。
发酵时间：5-10天。
发酵结束后，发酵液采用离心或者微滤除去菌丝等固体物得到发酵清液，发酵清液上大孔吸附树脂柱，进行吸附、解析；收集解析液，减压浓缩得到1′，4′-反式-ABA-二醇粗品；再经硅胶柱层析分离，以及结晶、重结晶纯化，得到1′，4′-反式-ABA-二醇结晶产物。
采用本发明工艺，在第二级发酵时，通过流加补料液发酵，可以为菌体持续提供合成1′，4′-反式-ABA-二醇需要的碳源、氮源，维持发酵工艺需求的较好的碳氮比，提高发酵体系中细胞浓度和产物合成效率，从而提高1′，4′-反式-ABA-二醇的产量。
在优选的具体实施方案中，本发明还采用例如新的遗传改良菌株等技术方案来进一步提高1′，4′-反式-ABA-二醇的产量。
在优选的本发明方法中，本发明特别提供一株灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)的遗传改良菌株灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)ZX2用于发酵制备1′，4′-反式-ABA-二醇；其已于2019年04月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.17678。地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明发酵所采用的培养基A、B及补料液C的具体组成质量百分比如下：
培养基A：
葡萄糖0.1-5.0％，牛肉膏0.1-1.0％，蔗糖0.1-5.0％，乳糖0.1-2.0％，KH2PO40.01-0.5％，MgSO4 0.01-0.2％，蛋白胨0.1-5.0％。
培养基B：
Figure BDA0002691658910000061
Figure BDA0002691658910000071
补料液C：
成分 一般范围 优选范围
葡萄糖 0.1-6.0％ 0.2-2.0％
蛋白胨 0.1-5.0％ 0.5-2.0％
MgSO4 0.001-1.0％ 0.005-0.1％
NaCl 0.001-1.0％ 0.005-0.5％
本发明优选实施方案的发酵工艺全过程为：
将活化后的灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)ZX2菌种/孢子液接种于灭菌培养基A中，装于三角瓶内23-26℃摇瓶培养20-50小时后，以1-25％的接种量接种于已加有灭菌培养基B的发酵罐中进行发酵生产。菌种接种于发酵罐后于23-26℃，发酵培养12-72小时后，开始补料液C的流加补料。补料液C流加补料方式有两种，一种是连续(匀速或非匀速)流加，一种是间歇式流加，连续流加方式是优选的。
采用连续流加方式时，以0.01-10.0L/h的速度连续(匀速或非匀速)流加补料液C，直至停止发酵(下罐)前约10-48小时。
采用间歇式流加方式时，间歇时间可为每1-24小时补料1-8次，优选为大约间隔5-8小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.01-2.0％，优选0.05-0.5％。
发酵条件：温度23-26℃，pH：4-8。
发酵时间：5-10天。
发酵结束后，发酵液采用离心或者微滤技术过滤除去菌丝等固体物得到发酵清液，发酵清液上大孔吸附树脂柱，进行吸附、解析；收集解析液，减压浓缩得到1′，4′-反式-ABA-二醇粗品；再经硅胶柱层析分离，以及结晶、重结晶纯化，得到1′，4′-反式-ABA-二醇结晶产物。
本发明的全工艺流程见附图2。
采用本发明工艺，菌株以较高的底物转化率和产物合成速率生产1′，4′-反式-ABA-二醇；采用高效液相色谱法检测1′，4′-反式-ABA-二醇含量〔检测条件：色谱柱为Agilent ZORBAX Ecilpse C18 5um 250×4.6mm；检测器为紫外VWD检测器；检测波长254nm；进样量5μl；流动相为A水，B甲醇；流速：0.8ml/min〕，其产量可达0.6g/L。
本发明还提供了1′，4′-反式-ABA-二醇作为植物生长调节剂和抗逆诱导剂的应用方法。具体为：(1)用1′，4′-反式-ABA-二醇处理植物种子，可以提高种子发芽率和生长素质，提高苗期的抗旱、抗寒、抗病和抗盐碱等综合抗逆能力；有效应用浓度范围为0.1-10.0ppm；可以采用浸种、或拌种、或作为种子包衣剂成分等处理方式，根据不同作物种类所用浓度可以不同。如水稻种子用0.1-0.5ppm的1′，4′-反式-ABA-二醇浸种或拌种处理后，发芽率提高3-10％，促进秧苗根系发达，并可提高产量。(2)在植物苗期，外源施用1′，4′-反式-ABA-二醇可以起到大幅提高植物生长素质和抗逆性的作用。一般情况下，从植物3叶期起即可采用叶面喷施的方式施用1′，4′-反式-ABA-二醇，喷施的浓度一般在0.1-20.0ppm。如，在番茄等蔬菜作物、烟草等经济作物上应用时，在苗期，喷施浓度为1.0-20.0ppm的1′，4′-反式-ABA-二醇2-5次，或用浓度为0.1-5.0ppm的1′，4′-反式-ABA-二醇灌根，能显著增强作物整个生育期对低温、干旱、水涝、病害等逆境的抗性，促进生根及根系对水肥的吸收利用，调节花期，提高产量和品质。
本发明具有以下优点：
1.本发明采用遗传改良菌株灰葡萄孢霉(B.cinerea)ZX2，其底物转化率和产物合成速率较高，1′，4′-反式-ABA-二醇的产量可达0.6g/L。
2.采用本发明发酵培养基及液体培养基流加补料发酵工艺，可以维持菌株生长和合成产物需求的较好的碳氮比，实现较高的1′，4′-反式-ABA-二醇的产量。
3,提取工艺流程简单，回收率高，操作方便。
4.提供了1′，4′-反式-ABA-二醇作为植物生长调节剂和抗逆诱导剂的应用方法。
附图说明
图1是1′，4′-反式-ABA-二醇化学结构图。
图2是本发明1′，4′-反式-ABA-二醇的发酵生产工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述。
实施例一
用1000mL三角瓶10个，每瓶装250mL培养基A(葡萄糖1.0％，牛肉膏0.5％，蔗糖1.0％，乳糖0.5％，KH2PO4 0.05％，MgSO4 0.02％，蛋白胨1.5％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)ZX2孢子液，于25℃摇瓶培养48小时。将培养好的菌种液按5％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B的100L发酵罐中(培养基B：葡萄糖0.5％，蔗糖0.2％，乳糖0.2％，麦麸4.0％，豆饼粉0.5％，玉米粉0.2％，酵母粉0.2％，KH2PO40.05％，MgSO4 0.01％，NaCl 0.05％，消泡剂0.01％)，进行发酵生产。菌种接种于发酵罐，于23-26℃发酵培养72小时后，开始进行以0.05L/h的速度连续流加补料液C的流加补料(补料液C：葡萄糖0.5％，蛋白胨0.5％，MgSO40.01％，NaCl 0.02％)，直至停止发酵(下罐)前约16小时。发酵pH 4-8，发酵周期8天。
发酵结束后，发酵液采用离心或者微滤除去菌丝等固体物得到发酵清液，发酵清液上大孔吸附树脂柱，进行吸附、解析；收集解析液，减压浓缩得到1′，4′-反式-ABA-二醇粗品；再经硅胶柱层析分离，以及结晶、重结晶纯化，得到1′，4′-反式-ABA-二醇结晶产物。
采用高效液相色谱法检测1′，4′-反式-ABA-二醇含量〔检测条件：色谱柱为Agilent ZORBAX Ecilpse C18 5um 250×4.6mm；检测器为紫外VWD检测器；检测波长254nm；进样量5μl；流动相为A水，B甲醇；流速：0.8ml/min〕，1′，4′-反式-ABA-二醇产量可达0.6g/L。
实施例二
用1000mL三角瓶10个，每瓶装250mL培养基A(葡萄糖0.5％，牛肉膏0.5％，蔗糖0.5％，乳糖0.4％，KH2PO4 0.05％，MgSO4 0.02％，蛋白胨0.5％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)ZX2孢子液，于25℃摇瓶培养48小时。将培养好的菌种液按5％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B的100L发酵罐中(培养基B：葡萄糖0.5％，蔗糖0.2％，乳糖0.2％，麦麸2.0％，豆饼粉0.5％，玉米粉0.5％，酵母粉0.2％，KH2PO40.05％，MgSO40.01％，NaCl 0.02％，消泡剂0.01％)，进行发酵生产。菌种接种于发酵罐后于23-26℃，发酵培养48小时后，采用间歇式流加方式流加补料液C的流加补料(补料液C：葡萄糖0.4％，蛋白胨0.5％，MgSO40.01％，NaCl0.01％)，采用间歇式流加方式，间歇时间为每5小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.25％，直至停止发酵(下罐)前约24小时停止补料。发酵pH 4-8，发酵周期8天。
发酵结束后，发酵液采用离心或者微滤除去菌丝等固体物得到发酵清液，发酵清液上大孔吸附树脂柱，进行吸附、解析；收集解析液，减压浓缩得到1′，4′-反式-ABA-二醇粗品；再经硅胶柱层析分离，以及结晶、重结晶纯化，得到1′，4′-反式-ABA-二醇结晶产物。
采用高效液相色谱法检测1′，4′-反式-ABA-二醇含量〔检测条件：色谱柱为Agilent ZORBAX Ecilpse C18 5um 250×4.6mm；检测器为紫外VWD检测器；检测波长254nm；进样量5μl；流动相为A水，B甲醇；流速：0.8ml/min〕，1′，4′-反式-ABA-二醇产量可达0.5g/L。
实施例三
用1000mL三角瓶10个，每瓶装250mL培养基A(葡萄糖1.0％，牛肉膏1.0％，蔗糖0.5％，乳糖1.0％，KH2PO4 0.06％，MgSO4 0.02％，蛋白胨0.6％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)ZX2孢子液，于25℃摇瓶培养48小时。将培养好的菌种液按5％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B的100L发酵罐中(培养基B：葡萄糖0.2％，蔗糖0.3％，乳糖0.2％，麦麸5.0％，豆饼粉1.0％，玉米粉0.2％，酵母粉0.5％，KH2PO40.02％，MgSO4 0.01％，NaCl 0.05％，消泡剂0.02％)，进行发酵生产。菌种接种于发酵罐后于23-26℃，发酵培养48小时后，开始进行以0.05L/h的速度连续流加补料液C的流加补料(补料液C：葡萄糖0.5％，蛋白胨0.5％，MgSO4 0.01％，NaCl 0.01％)，直至停止发酵(下罐)前约10小时。发酵pH 4-8，发酵周期6天。
发酵结束后，发酵液采用离心或者微滤除去菌丝等固体物得到发酵清液，发酵清液上大孔吸附树脂柱，进行吸附、解析；收集解析液，减压浓缩得到1′，4′-反式-ABA-二醇粗品；再经硅胶柱层析分离，以及结晶、重结晶纯化，得到1′，4′-反式-ABA-二醇结晶产物。
采用高效液相色谱法检测1′，4′-反式-ABA-二醇含量〔检测条件：色谱柱为Agilent ZORBAX Ecilpse C18 5um 250×4.6mm；检测器为紫外VWD检测器；检测波长254nm；进样量5μl；流动相为A水，B甲醇；流速：0.8ml/min〕，1′，4′-反式-ABA-二醇产量可达0.4g/L。
实施例四
用1000mL三角瓶10个，每瓶装250mL培养基A(葡萄糖0.6％，牛肉膏0.5％，蔗糖0.5％，乳糖0.4％，KH2PO4 0.05％，MgSO4 0.02％，蛋白胨0.6％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的灰葡萄孢霉菌(B.cinerea)TBC-10孢子液，于25℃摇瓶培养48小时。将培养好的菌种液按5％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B的100L发酵罐中(培养基B：葡萄糖0.5％，蔗糖0.2％，乳糖0.2％，麦麸1.0％，豆饼粉0.5％，玉米粉0.1％，酵母粉0.2％，KH2PO40.05％，MgSO4 0.01％，NaCl 0.01％，消泡剂0.01％)，进行发酵生产。菌种接种于发酵罐后于23-26℃，发酵培养48小时后，开始进行以0.08L/h的速度连续流加补料液C的流加补料(补料液C：葡萄糖0.6％，蛋白胨1.0％，MgSO4 0.01％，NaCl 0.02％)，直至停止发酵(下罐)前约16小时。发酵pH 4-8，发酵周期6天。
发酵结束后，发酵液采用离心或者微滤除去菌丝等固体物得到发酵清液，发酵清液上大孔吸附树脂柱，进行吸附、解析；收集解析液，减压浓缩得到1′，4′-反式-ABA-二醇粗品；再经硅胶柱层析分离，以及结晶、重结晶纯化，得到1′，4′-反式-ABA-二醇结晶产物。
采用高效液相色谱法检测1′，4′-反式-ABA-二醇含量〔检测条件：色谱柱为Agilent ZORBAX Ecilpse C18 5um 250×4.6mm；检测器为紫外VWD检测器；检测波长254nm；进样量5μl；流动相为A水，B甲醇；流速：0.8ml/min〕，1′，4′-反式-ABA-二醇产量可达0.02g/L。
实施例五
用1′，4′-反式-ABA-二醇浸种，提高发芽率，促进水稻幼苗的根系生长。具体做法：将水稻宜香优2115种子表面消毒后，用0.5ppm 1′，4′-反式-ABA-二醇水溶液常温浸种处理24h，温室(26℃，16h光照/8h暗培养)催芽，3天后计算发芽率，并选取发芽的种子置于种子培养袋中，清水培养：两周后取出，统计根长，根面积等指标，结果发现其对水稻幼苗的根系生长有一定促进作用，如下表。以清水、S-诱抗素(ABA)为对照处理。
Figure BDA0002691658910000131
实施例六
烤烟苗移栽期喷施1′，4′-反式-ABA-二醇，对烟草花叶病毒病、枯斑病的发生具有较好的诱抗效果，烟草花叶病毒病发病率减少10-30％，烟叶产量提高5-15％。以清水、S-诱抗素(ABA，市售，纯度90％)为对照处理。
Figure BDA0002691658910000141

Claims (9)

1.一种制备1'，4'-反式-ABA-二醇的发酵方法，其特征是：采用灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）遗传改良菌株ZX2，所述灰葡萄孢霉于2019年04月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17678，在一级液体培养基中培养，作为种子液；将培养好的种子液接种到二级液体培养基中培养，培养一段合适的时间后进行流加补料液的补料发酵培养；发酵结束后，从发酵培养液中分离纯化出1'，4'-反式-ABA-二醇。
2.根据权利要求1所述的制备1'，4'-反式-ABA-二醇的发酵方法，其特征是：所述一级液体培养基的组成质量百分比为：葡萄糖0.1%-5.0%，牛肉膏0.1%-1.0%，蔗糖0.1%-5.0%，乳糖0.1%-2.0%，KH2PO4 0.01%-0.5%，MgSO40.01%-0.2%，蛋白胨0.1%-5.0%。
3.根据权利要求1所述的制备1'，4'-反式-ABA-二醇的发酵方法，其特征是：所述二级液体培养基的组成质量百分比为：葡萄糖0.2%-2.0%，蔗糖0.2%-2.0%，乳糖0.2%-1.0%，麦麸0.5%-5.0%，豆饼粉0.5%-2.0%，玉米粉0.1%-1.0%，酵母粉0.1%-1.0%，KH2PO40.005%-0.5%，MgSO40.005%-0.1%，NaCl 0.005%-0.5%，消泡剂0.005%-0.1%。
4.根据权利要求1所述的制备1'，4'-反式-ABA-二醇的发酵方法，其特征是：所述补料液的组成质量百分比为：葡萄糖0.2%-2.0%，蛋白胨0.5%-2.0%，MgSO4 0.005%-0.1%，NaCl0.005%-0.5%。
5.根据权利要求1所述的制备1'，4'-反式-ABA-二醇的发酵方法，其特征是：所述的流加补料的方式为连续流加和/或间歇流加方式。
6.根据权利要求5所述的制备1'，4'-反式-ABA-二醇的发酵方法，其特征是：采用连续流加方式时，以0.01-10.0 L/h的速度连续流加补料液C，直至停止发酵前约10-48小时；采用间歇式流加补料液方式是每1-24小时补料1-8次。
7.根据权利要求6所述的制备1'，4'-反式-ABA-二醇的发酵方法，其特征是：所述采用间歇式流加补料液方式是间隔5-8小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.01%-2.0%。
8.根据权利要求7所述的制备1'，4'-反式-ABA-二醇的发酵方法，其特征是：每次补料量为发酵液总体积的0.05%-0.5%。
9.1'，4'-反式-ABA-二醇作为水稻种子生长调节剂、烟草苗期花叶病毒病和枯斑病诱抗剂的应用，其特征在于：作为水稻种子生长调节剂时，使用浓度为0.5ppm的1'，4'-反式-ABA-二醇溶液浸种处理水稻种子24h；作为烟草苗期花叶病毒病和枯斑病诱抗剂时，在移栽期对烟草苗喷施2ppm的1'，4'-反式-ABA-二醇溶液。
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