CN108165514A - 一株芽孢杆菌及其发酵产物和应用 - Google Patents

一株芽孢杆菌及其发酵产物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株芽孢杆菌及其发酵产物和应用，涉及微生物技术领域，该菌命名为芽孢杆菌(Bacillus sp)IMDGX0108，保藏号为CCTCC NO：M 2018067；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年01月30日，该菌株的发酵产物富含二十四元大环内酯，且其发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌有很强的抑制作用，该发酵产物可应用于抑制甘蔗鞭黑粉菌以及用于制备可抑制甘蔗鞭黑粉菌的生物农药，在生物农药的开发研制方面具有良好的前景。

Description

一株芽孢杆菌及其发酵产物和应用
【技术领域】
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株芽孢杆菌及其发酵产物和应用。
【背景技术】
Macrolactions是一系列24元大环内酯类化合物，主要分离自Bacillus sp.和Actinomadura sp.，其中许多来源于海洋，迄今为止，已发现的macrolactins大约有30种。24元大环内酯类化合物作为一类结构新颖的抗生素，其应用前景备受关注。
甘蔗是世界性重要的糖料作物，也是我国的主要糖料作物，主要分布于广东、广西、云南、福建、海南和台湾等地区，此外，甘蔗还是潜在的可再生能源作物。中国是种植甘蔗较为古老的国家之一，早在公元前4世纪在我国秦岭至海南岛均有分布，是保障我国糖业安全的重要来源。
甘蔗黑穗病是一种由甘蔗鞭黑粉菌(sporisorium scitamineum)引起的世界性重要甘蔗病害。甘蔗鞭黑粉菌以冬孢子的形式落在甘蔗芽、宿根及土壤中，通过风、水、昆虫及人类活动等媒介途径快速传播至所有甘蔗种植地。嘧菌酯、啶酰菌胺等化学农药常被用于防治甘蔗黑穗病。虽然化学农药可用于防控甘蔗黑穗病，但会严重污染大气和水环境，同时增强甘蔗鞭黑粉菌抗药性。因此寻找防治甘蔗鞭黑粉菌的生物农药，对蔗种消毒、宿根及枝叶施药防治，降低初次侵染率和防止孢子传播，对甘蔗优化种植、提高产量等有着重要意义。生物防治作为植物病害防治的重要组成部分，越来越得到世界各国的重视并发挥着重要的作用。
目前，本发明所述芽孢杆菌所产的24元大环内酯在国内外都未见报道，而且利用该化合物应用于防治甘蔗鞭黑粉菌也未见报道。因此，分离具有知识产权的、能有效抑制甘蔗鞭黑粉菌的微生物对于我国研发此类生物农药具有十分重要的作用。
【发明内容】
有鉴于此，本发明的目的在于提供了一株芽孢杆菌及其发酵产物和应用，该菌株的发酵产物富含二十四元大环内酯，且其发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌有很强的抑制作用，该发酵产物可应用于抑制甘蔗鞭黑粉菌以及用于制备可抑制甘蔗鞭黑粉菌的生物农药。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：
一株芽孢杆菌，所述该菌命名为芽孢杆菌(Bacillus sp)IMDGX0108，保藏号为CCTCC NO：M 2018067；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年01月30日。
在本发明中，进一步说明，所述株菌属于革兰氏阳性菌，大小为0.3-0.6×1.5-3.5μm，呈棒状，有鞭毛。
在本发明中，进一步说明，所述菌种分离自海洋生物，具体的分离筛选方法包括梯度稀释筛选、纯培养纯化、16S rDNA鉴定及活性筛选。
本发明还提供一株芽孢杆菌的发酵产物，所述其发酵产物通过以下方法得到：
(1)将从海洋生物中分离得到的芽孢杆菌进行活化，待菌体生长到对数期时，于Isp2培养基中，于27-29℃、170-190r/min下振荡，发酵培养6-8d，得到发酵培养液；
(2)将发酵培养液用细胞破碎仪进行破碎，通过聚酰胺微孔滤膜进行离心过滤分离取发酵滤液，得到发酵液；
(3)将步骤(2)所得发酵液用乙酸乙酯等体积萃取3-5次，通过旋转蒸发仪浓缩，得到所述芽孢杆菌发酵产物，并置于干燥器中保存。
在本发明中，进一步说明，所述步骤(1)中的改良Isp2培养基的配方为：葡萄糖2g/L、酵母提取物2g/L、麦芽提取粉2g/L。
在本发明中，进一步说明，所述改良Isp2培养基的配制方法为：首先称取葡萄糖2g/L、酵母提取物2g/L、麦芽提取粉2g/L溶于蒸馏水中，并在120-122℃下高压灭菌18-22min。
本发明提供的芽孢杆菌发酵产物用于抑制甘蔗鞭黑粉菌或用于制备抑制甘蔗鞭黑粉菌的微生物制剂。
本发明提供的芽孢杆菌发酵产物用于提取24元大环内酯类化合物。
另外，包含上述芽孢杆菌(Bacillus sp)IMDGX0108为基础构建得到的高产大环内酯类化合物的工程菌，也在本发明的保护范围之内。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1.本发明提供的一株具备高产24元大环内酯的芽孢杆菌(Bacillus sp)IMDGX0108，该菌株是从海洋生物共附生微生物中分离筛选得到的，通过本发明研究表明，以甘蔗鞭黑粉菌的“+”型担孢子、“-”型担孢子和菌丝为靶标，抑菌圈直径分别为25.40±0.85mm、19.90±0.14mm和14.25±1.06mm，菌株IMDGX0108的发酵产物在PDA平板上能有效的抑制或推迟甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”担孢子已经菌丝的交配，从而能够达到对甘蔗鞭黑穗病的防治效果；该细菌能够在不杀死甘蔗鞭黑粉菌的基础上通过抑制或推迟甘蔗鞭黑粉菌的有性配合，从而达到防治甘蔗鞭黑穗病的目的；而且该菌株分离于海洋生物，对环境友好；且生产周期短，工艺简单，在植物病害的生物防治中具有十分广阔的应用前景。
2.本发明提供的芽孢杆菌活性稳定、代谢能力强，代谢温度和pH值范围广，其代谢产物具有强抑制甘蔗鞭黑粉菌的活性，且能显著改善甘蔗茎基部环境中微生物群落的合理结构，形成一个生物多样化的甘蔗根系土壤微生态环境，从而有效地、持久地控制甘蔗鞭黑粉菌引起的病害，可用于制备能高效防治甘蔗鞭黑粉菌的微生物制剂。
【附图说明】
图1为芽孢杆菌(Bacillus sp)IMDGX0108菌落形态；
图2为芽孢杆菌Bacillus sp.IMDGX0108发酵提取物的HPLC检测结果；
图3为以芽孢杆菌Bacillus sp.IMDGX0108为基础构建的工程菌发酵提取物的HPLC检测结果；
图4为芽孢杆菌(Bacillus sp)IMDGX0108的发酵产物抑制甘蔗鞭黑粉菌“+”担孢子萌发结果；
图5为芽孢杆菌(Bacillus sp)IMDGX0108的发酵产物抑制甘蔗鞭黑粉菌“-”担孢子萌发结果；
图6为芽孢杆菌(Bacillus sp)IMDGX0108的发酵产物抑制甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长结果。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
实施例1
本实施例提供一株芽孢杆菌(Bacillus sp)IMDGX0108
该菌株已做保藏，保藏信息如下：
保藏号：CCTCC NO：M 2018067；保藏地点：中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心；保藏日期：2018年01月30日。
菌株是从北部湾海域的海洋生物表面分离纯化得到的，分离纯化的具体过程如下：
(1)将采自北部湾海域的海洋生物表面用无菌水冲洗3遍，剪取1cm×1cm小块，分别加1mL无菌水研磨，研磨液保存于无菌离心管中，待用；
(2)将研磨液分别梯度稀释至10-1、10-2和10-3。将稀释液平板涂布至M1、M5、M7、M9、M10、AGG、Isp3、Isp7等8种分离培养基上，28℃恒温培养15d；
(3)利用Isp2培养基挑取出的不同形态单菌落，28℃恒温培养3d，并用三线法再次分纯，28℃恒温培养4d，纯化后菌株用冻存管-80℃保藏并编号。
菌株属于革兰氏阳性菌，大小为0.3-0.6×1.5-3.5μm，呈棒状，有鞭毛。
实施例2
本实施例提供一株芽孢杆菌(Bacillus sp)IMDGX0108发酵产物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将从海洋生物中分离得到的芽孢杆菌进行活化，待菌体生长到对数期时，于Isp2培养基中，于28℃、180r/min下振荡，发酵培养7d，得到发酵培养液；其中，改良Isp2培养基的配制方法为：首先称取葡萄糖2g/L、酵母提取物2g/L、麦芽提取粉2g/L溶于蒸馏水中，并在121℃下高压灭菌20min；
(2)将发酵培养液用细胞破碎仪进行破碎，通过聚酰胺微孔滤膜进行离心过滤分离取发酵滤液，得到发酵液；
(3)将步骤(2)所得发酵液用乙酸乙酯等体积萃取4次，通过旋转蒸发仪浓缩，得到所述芽孢杆菌发酵产物，并置于干燥器中保存。
实施例3
本实施例提供一株芽孢杆菌(Bacillus sp)IMDGX0108发酵产物的应用。
该发酵产物主要应用于甘蔗鞭黑粉菌的抑制中。
以下为发酵产物抑制甘蔗鞭黑粉菌活性分析：
(一)供试菌采集及保存
甘蔗鞭黑粉菌冬孢子采集自发病甘蔗植株，轻轻敲打新鲜黑穗病鞭子上的冬孢子，装于封口袋中，40℃烘干并保存于4℃冰箱备用。
(二)甘蔗鞭黑粉菌担孢子与菌丝的制备
(1)取少量冬孢子与无菌水混匀，稀释涂布多个浓度(10-3最佳，最佳浓度选取依据为涂布后菌落呈单个分布，且稀疏程度适中)；
(2)待其萌发后，挑取单菌落与1mL无菌水混匀，稀释至10-5，取200μL涂布于PDA培养基，于28℃培养3-5d；
(3)待其长出酵母形态菌落后，随机选取5个分别接种于YEPS液体培养基中，180r/min，28℃培养24h；
(4)各取1μL菌液于PDA上进行随机交叉配型，若菌落为白色绒毛状，则两菌株为异型(+、-)交配型单倍体担孢子。若菌落为酵母形态，则两菌株为同型交配型单倍体担孢子。
(三)抑制甘蔗鞭黑粉菌担孢子及菌丝生长活性鉴定
(1)利用生物级DMSO将细菌发酵产物浓度调至10mg/mL。
(2)分别挑取已验证的两种异型(+、-)单倍体担孢子接种于50mL YEPS液体培养基中，置于28℃、180r/min的摇床中培养36h；
(3)取两种异型担孢子悬浮液1:1(v/v)均匀混合，制成能产生菌丝的初始菌悬液，待灭菌后的PDA固体培养基冷却至55℃左右，按1％(v/v)的菌液量加入PDA固体培养基中，充分摇匀，倒入平板后待其凝固，将灭菌的牛津杯固定在平板中，抑制担孢子萌发实验的待试菌板制备同上，只是将担孢子悬浮液更换为其中一种，体积不变；
(4)空白对照为DMSO，阳性对照为5μg/mL啶酰菌胺，每个牛津杯中加入的样液量为100μL，置于28℃培养箱培养，培养5d后，利用垂直十字交叉法测量各抑菌圈的直径。
(四)结果分析
IMDGX0108发酵产物分别以甘蔗鞭黑粉菌的“+”型担孢子、“-”型担孢子和菌丝作为评价IMDGX0108发酵产物抑制甘蔗鞭黑粉菌抑菌效果的指标，实验结果显示抑菌圈直径分别为25.40±0.85mm、19.90±0.14mm和14.25±1.06mm，说明有较好的抑菌效果。
实施例4
本实施例提供一株以芽孢杆菌(Bacillus sp)IMDGX0108为基础构建的高产24元大环内酯工程菌。
该工程菌通过以下方式筛选获得：
a.芽孢杆菌(Bacillus sp)IMDGX0108生长曲线的测定，确定菌株的对数生长期，制备OD600为0.7的菌悬液；
b.利用常压室温等离子体(ARTP)诱变育种仪在功率120W，间距2mm，气量10SLM下处理175s，诱变后菌体稀释到10-2、10-3，并涂布于Isp2固体培养基上，28℃培养箱培养3-5天；
c.观察菌落形态，挑选出与芽孢杆菌(Bacillus sp)IMDGX0108形态不同的细菌，并接种到Isp2固体培养基，纯化该菌种；
d.将纯化后的菌种培养至生长对数期，并接种于Isp2液体培养基中180r/min，28℃培养，利用生物量筛除劣于IMDGX0108的菌种，生物量测定包括细胞光密度、比生长速率和稳定期菌体干重；
e.将筛选后得到的菌种培养至生长对数期，并接种于Isp2液体培养基中180r/min，28℃培养7天，收集发酵液，用细胞破碎仪进行破碎、乙酸乙酯萃取、旋转蒸发仪浓缩，收集其发酵产物；
f.对粗提物进行HPLC分析，并与IMDGX0108的HPLC图谱比较，最终筛选出以芽孢杆菌(Bacillus sp)IMDGX0108为基础构建高产24元大环内酯工程菌。
根据将工程菌发酵提取物提取物与IMDGX0108发酵提取物进行HPLC分析对比，IMDGX0108发酵提取物检测中，其24元大环内酯主要出现在28-38分钟之间，由图2可以看出24元大环内酯在该菌株的发酵产物中占比较大，且化合物类型多而杂；而对工程菌发酵提取物检测发现，其24元大环内酯也主要出现在28-38分钟之间，但与图2对比可以看出24元大环内酯在该菌株的发酵产物中占比明显增大，且化合物类型集中，产量提高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一株芽孢杆菌，其特征在于，所述该菌命名为芽孢杆菌(Bacillus sp)IMDGX0108，保藏号为CCTCC NO：M 2018067；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年01月30日。
2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌，其特征在于，所述株菌属于革兰氏阳性菌，大小为0.3-0.6×1.5-3.5μm，呈棒状，有鞭毛。
3.根据权利要求1所述的芽孢杆菌，其特征在于，所述菌种分离自海洋生物，具体的分离筛选方法包括梯度稀释筛选、纯培养纯化、16S rDNA鉴定及活性筛选。
4.根据权利要求1所述的一株芽孢杆菌的发酵产物，其特征在于，所述其发酵产物通过以下方法得到：
(1)将从海洋生物中分离得到的芽孢杆菌进行活化，待菌体生长到对数期时，于Isp2培养基中，于27-29℃、170-190r/min下振荡，发酵培养6-8d，得到发酵培养液；
(2)将发酵培养液用细胞破碎仪进行破碎，通过聚酰胺微孔滤膜进行离心过滤分离取发酵滤液，得到发酵液；
(3)将步骤(2)所得发酵液用乙酸乙酯等体积萃取3-5次，通过旋转蒸发仪浓缩，得到所述芽孢杆菌发酵产物，并置于干燥器中保存。
5.根据权利要求4所述的一株芽孢杆菌的发酵产物，其特征在于，所述步骤(1)中的改良Isp2培养基的配方为：葡萄糖2g/L、酵母提取物2g/L、麦芽提取粉2g/L。
6.根据权利要求5所述的一株芽孢杆菌的发酵产物，其特征在于，所述改良Isp2培养基的配制方法为：首先称取葡萄糖2g/L、酵母提取物2g/L、麦芽提取粉2g/L溶于蒸馏水中，并在120-122℃下高压灭菌18-22min。
7.根据权利要求4-6任一项所述的芽孢杆菌发酵产物的应用，其特征在于，该发酵产物用于抑制甘蔗鞭黑粉菌或用于制备抑制甘蔗鞭黑粉菌的微生物制剂。
8.根据权利要求7所述的芽孢杆菌发酵产物的应用，其特征在于，该发酵产物用于提取24元大环内酯类化合物。
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