CN114107070A

CN114107070A - 一种印度梨形孢菌剂及其制备方法

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Publication number: CN114107070A
Application number: CN202111472859.9A
Authority: CN
Inventors: 杨秀荣; 李亮; 孙淑琴; 李月娇; 李广胜
Original assignee: Tianjin Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Tianjin Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-12-03
Filing date: 2021-12-03
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2041-12-03
Also published as: CN114107070B

Abstract

本发明公开了一种印度梨形孢菌剂及其制备方法，包括含有活性成分印度梨形孢菌体的发酵载体，以及孢子保护剂、分散剂和展布剂，所述发酵载体中印度梨形孢厚垣孢子的含量为1.0～20.0×10⁶个孢子/克，所述分散剂和展布剂的重量百分比均为1％～5％，所述孢子保护剂的重量百分比为0.05～0.1％。本发明成功解决了印度梨形孢产孢困难、难于规模应用和长期保存的问题，在制备种子液时，采用可溶性淀粉作为碳源，相比其它碳源能显著提高印度梨形孢菌丝生长速度，并显著提前产孢时间、增加产孢量，通过采用高粱、蔗糖作为发酵载体的固体培养，增加了耐储性，制备得到的菌剂能长时间保存并保持孢子活性，为大面积生产应用提供了可能。

Description

一种印度梨形孢菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物农药技术领域，具体涉及一种印度梨形孢菌剂及其制备方法。

背景技术

在农业上，农药的使用对生态环境造成极大的污染，不仅是对其他生物也对人类自身造成了相当大的危害。所以人们开始不断探索可持续发展的绿色农业体系，逐渐利用农业益生菌、抗生素等进行植物病害的防治技术代替过去农药的使用。

印度梨形孢(P.indica)由印度科学家于1998年首次在印度西北地区的塔尔沙漠中发现的，P.indica是植物根部内生真菌，属担子菌门，层菌纲，蜡壳耳目，梨形孢属。其优点是可以在人工培养基上生长并能顺利完成其生活史，无性繁殖形成包含8-25个核的厚垣孢子，厚垣孢子以单独或成簇的形式存在，由于其梨形形状固而得名。该真菌能在200多种植物上定殖，定殖后能引发一系列的生物学效应，经研究表明P.indica定殖在植物根部会引起相关基因表达发生改变，激素水平发生变化以及一些信号通路的改变，从而起到促进植物生长、促进植物营养物质吸收和诱导植物产生抗逆性等作用。植物内生菌的生态和生理作用及其作为潜在的生防资源和外源基因载体，在农业和医药领域中的巨大应用潜力，已成为国内外研究的热点。研究表明印度梨形孢用在大田作物大面积应用后，可有效帮助作物生长，提高作物耐受干旱和盐碱地区，增强作物的抗疾病能力等，并提高作物产量。还能在丛枝菌根真菌不能定殖的十字花科植物上定殖，并显著提高大麦、拟南芥、菜豆、龙葵、烟草等植物根、茎的生物产量。研究还发现，P.indica体内包含一种磷转运蛋白，可促进植物根部对磷元素的吸收，并提高硝酸还原酶活性，能固定土壤中的氮元素。

针对小麦出现的土传病原菌侵染问题，一般采用化学药剂浸种、拌种等措施。然而药剂都具有不同程度的毒性，在植物体内积累及残留，对环境及人类身体健康十分不利。而植物内生菌可诱导植物产生系统抗性，抵御病害的发生，减少化学农药的使用。因此研究印度梨形孢的发酵培养条件及应用技术，并将其进行产业化生产，能有效地促进作物的生长，提高了作物在某些恶劣逆境的忍耐力，增强了作物的抗病性，提高作物的生长率和产量，在农业生产上具有广阔的应用前景。

目前，将印度梨形孢制备为菌剂在农业中规模推广应用的报道较少，因为印度梨形孢菌体本身生长缓慢，生长过程中容易被杂菌污染，这给扩大培养造成障碍，另外印度梨形孢在普通培养基上产生厚垣孢子的数量较少，而印度梨形孢作为植物内生菌主要靠厚垣孢子在植物根际定殖，进入植株体内发挥其诱导抗性的作用。因此寻找适合其大量产生厚垣孢子的培养基是限制印度梨形孢应用的关键因子。

发明内容

本发明在大量实验的基础上，筛选出适合印度梨形孢产生大量厚垣孢子的培养基和培养条件，田间应用后对小麦的促生和病害防控有明显的作用。基于此，本发明保护如下技术方案：

一种印度梨形孢菌剂，包括含有活性成分印度梨形孢菌体的发酵载体，以及孢子保护剂、分散剂和展布剂，所述发酵载体中印度梨形孢厚垣孢子的含量为1.0～20.0×10⁶个孢子/克，所述分散剂和展布剂在所述印度梨形孢菌剂中的重量百分比均为1％～5％，所述孢子保护剂在所述印度梨形孢菌剂中的重量百分比为0.05～0.1％。

所述印度梨形孢菌体为印度梨形孢菌丝及厚垣孢子混合物；所述发酵载体为固体发酵载体，由高粱、水、蔗糖制备得到；所述孢子保护剂为黄原胶，所述分散剂为NNO，所述展布剂为十二烷基磺酸钠；所述印度梨形孢菌剂为粉尘剂或者可湿性粉剂或者颗粒剂。

所述发酵载体是按照如下方法制备得到：高粱粒中加入蔗糖，加水煮沸，加水量为直到高粱粒吸满水份为止，搅拌均匀，灭菌备用，其中，高粱粒、水、蔗糖的质量比为100﹕20～40﹕1～5。

上述的印度梨形孢菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1)取印度梨形孢菌种进行活化；

2)种子液制备：活化后的印度梨形孢菌株在可溶性淀粉作为碳源的改良CM培养基中在25～28℃、140～180r/min震荡培养8～12天，培养后得到印度梨形孢种子液；

3)固体发酵培养：先制备固体培养基：高粱粒中加入蔗糖，加水煮沸，加水量为直到高粱粒吸满水份为止，然后装瓶灭菌备用；在固体培养基中加入骤2)得到的种子液，种子液﹕固体培养基的体积比为1﹕50～70，23～27℃培养6～8天；

4)测定固体发酵培养基中菌体的数量，待发酵基质中孢子量达到1.0～20×10⁶个/克时，将培养基料倒出晾晒，充分干燥后粉碎过筛得到固体发酵粉；

5)制备印度梨形孢菌剂：以孢子含量为1.0～20×10⁶个孢子/克的固体发酵粉为母粉，加入孢子保护剂、分散剂、展布剂，混合均匀，制备为粉尘剂或者可湿性粉剂或者颗粒剂。

在上述技术方案中，所述步骤1)中印度梨形孢菌种在PDA培养基中24～26℃培养15天；

所述印度梨形孢菌种采用保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心的CGMCC NO.10325印度梨形孢。

优选地，所述改良CM培养基的组成为：可溶性淀粉20g、20×盐溶液50mL、鱼粉或牛肉膏2g、微量元素溶液1mL，1000毫升自来水；

所述20×盐溶液的组成为：NaNO₃ 120g、KCl 10.4g、MgSO₄×7H₂O 10.4g、KH₂PO₄30.4g，加蒸馏水定容1L；

所述微量元素溶液的组成为：MnCl₂×4H₂O 6g、H₃BO₃ 1.5g、ZnSO₄×7H₂O 2.65g、KI750mg、Na₂MO₄×2H₂O 2.4mg、CuSO₄×5H₂O 130mg，加蒸馏水定容1L。

优选地，活化后的印度梨形孢菌株在可溶性淀粉作为碳源的改良CM培养基中在28℃、150～170r/min震荡培养10天，培养后得到印度梨形孢种子液。

优选地，所述步骤3)中在固体培养基中加入骤2)得到的种子液，种子液﹕固体培养基的体积比为1﹕60，25℃培养7天；所述步骤4)中将培养基料倒出晾晒2～3天；所述步骤5)中，加入的孢子保护剂、分散剂、展布剂的重量百分比依次为0.08％、3％、2.5％。

本发明还保护印度梨形孢在防治小麦土传病害中的应用，所述小麦土传病害为小麦茎基腐病或纹枯病或根腐病。

本发明还保护前述任一的印度梨形孢菌剂在促进小麦生长及增产中的应用，或者在防治小麦茎基腐病或纹枯病或根腐病中的应用。

本发明的有益效果是：本发明成功解决了印度梨形孢产孢困难、难于规模应用和长期保存的问题，在制备种子液时，采用可溶性淀粉作为碳源，相比其它碳源能显著提高印度梨形孢菌丝生长速度，并显著提前产孢时间、增加产孢量，通过采用高粱、蔗糖作为发酵载体的固体培养，增加了耐储性，制备得到的菌剂能长时间保存并保持孢子活性，为大面积生产应用提供了可能。本发明公开的印度梨形孢菌剂对小麦植株有明显的促进生长作用，能够明显的提高小麦产量，有明显的诱导抗性作用，对小麦土传真菌病害有较好的效果，与现有技术相比防效明显提高，可用于防治小麦纹枯病、根腐病、茎基腐病等。本发明解决了印度梨形孢难于在大田生产中规模应用的问题，为小麦生产提供了一种制备容易、使用方便、效果显著、高效、稳定、可规模化生产的印度梨形孢菌剂，可以用于防治小麦根部真菌病害，解决化学农药防治带来的农药残留、抗药性增加及环境污染等问题。

附图说明

图1是印度梨形孢在PDA培养基培养7天时的菌落情况、培养15天时的菌落情况和厚垣孢子形态图。

图2是印度梨形孢在不同液体培养基中培养10d时的形态。

图3是印度梨形孢在以可溶性淀粉为碳源的培养基中培养的产孢动态。

图4是印度梨形孢菌剂对小麦生长的影响对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；各个实施例中所用的生物、化学试剂如果没有特殊说明，均为本领域常规试剂实验室纯级，均可通过商购活得。

实施例1

一、菌种活化

本发明使用的印度梨形孢菌种采用已于2015年1月保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)的印度梨形孢菌株L-L-109：

保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2015年01月26日；

保藏编号为：CGMCC NO.10325，

分类名为：印度梨形孢(Piriformospora indica)。

该印度梨形孢菌株L-L-109已在中国专利申请CN201610540885.3中公开。

将印度梨形孢菌种L-L-109放置在PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)培养基中24～26℃培养15天。PDA培养基组成为：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15-20克、自来水1000毫升，自然PH。

培养7天(图1a)和15天时菌落(图1b)、厚垣孢子(图1c)形态如图1所示：印度梨形孢的幼嫩菌丝颜色为白色，几乎呈现透明状，直径大小为0.7-3.5um，初生的菌丝不形成气生菌丝。可以快速的形成菌丝融合，成熟后的菌丝产生的厚垣孢子，形状成梨形，厚垣孢子的细胞质内充满颗粒状物质，含有细胞核的个数一般为8-25个，这些厚垣孢子单个或成串存在，孢子壁的厚度为0.7um左右，幼嫩的孢子壁厚度很薄，成熟之后孢子壁达到1.5um，厚垣孢子有两层膜，外壁颜色呈淡黄色，质地很光滑。

二、种子液的筛选

种子液采用改良的CM液体培养基，培养基组成为：碳源20g、20×盐溶液50mL、鱼粉或牛肉膏2g、微量元素1mL，1000毫升自来水。其中，20×盐溶液：NaNO₃ 120g、KCl 10.4g、MgSO₄×7H₂O 10.4g、KH₂PO₄ 30.4g，加蒸馏水定容1L；微量元素：MnCl₂×4H₂O 6g、H₃BO₃1.5g、ZnSO₄×7H₂O 2.65g、KI 750mg、Na₂MO₄×2H₂O 2.4mg、CuSO₄×5H₂O 130g，加蒸馏水定容1L。

改良的CM液体培养基是在原有CM液体培养基的基础上，将蔗糖(碳源)作为变量，分别替换成葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉(浙江菱湖淀粉厂，(C₆H₁₀O₅)n，分析纯)，玉米粉、全麦粉、甘油、不加碳源为对照，用打孔器将印度梨形孢菌落打成0.5mm菌饼，每100mL液体培养基中加入5个菌饼，置于28℃摇床，转速为160rpm，观测印度梨形孢在含不同碳源的液体培养基中的生长速度。结果表明(如图2所示)，印度梨形孢在不同的液体培养基中的生长速率大不相同，当在8种培养基中培养至10天时，其在玉米粉和全麦粉为碳源的培养基中生物量最大，形成大量菌丝；在含可溶性淀粉的培养基中生长速率相对较慢，可见形成小菌丝团；而在其他5种培养基中生长速率较慢。

此外，检测8种液体培养基中印度梨形孢产孢量的差异，分别在培养5、7、10天时镜检检测产孢量。结果表明，印度梨形孢产孢较慢，培养第一周后，仅部分培养基中检测到零星的厚垣孢子；当以可溶性淀粉为唯一碳源培养(结果如图3所示)，在摇培至7天时，可检测到大量聚集的孢子，其他7种培养基可检测到少量孢子；当培养至第10天时，以甘油、可溶性淀粉、蔗糖为碳源以及不加碳源的液体培养基中可检测到大量的厚垣孢子，且聚集在新形成的小菌丝团的内部，其中可溶性淀粉培养基中的厚垣孢子数量最多(由于孢子数量太多，已经不便于数出具体数量)。在8种培养基中产孢情况统计结果如表1所示。

表1.印度梨形孢液体培养产孢结果

三、固体培养基的筛选

为了筛选适合印度梨形孢产生厚垣孢子的最佳培养基，我们选择了小麦粒、玉米粒、高粱粒、玉米粉、小麦粉、高粱粉分别作为基质原料进行筛选，不同基质原料中分别加入5％(蔗糖/基质原料)蔗糖，然后加水煮沸，加水量为20％-40％(w/w，水/基质原料的重量比)，直到吸满水份为止，然后装入三角瓶，每个三角瓶(规格是500ml的三角瓶)装300ml，121℃高压灭菌1小时，晾凉后接入5％的种子液(前述采用可溶性淀粉作为碳源28℃培养10天得到的种子液)，25℃静置培养，7天后调查厚垣孢子的数量，结果见表2，可见，颗粒状固体基质优于粉末状固体基质，分析其原因可能是粉末状固体基质透气性较差，影响印度梨形孢的生长，而颗粒状固体基质中，高粱粒又优于小麦粒和玉米粒，产孢量高出10倍-100倍。

表2不同类型培养基对印度梨形孢产生厚垣孢子影响

培养基类型

高粱粒

小麦粒

玉米粒

高粱粉

小麦粉

玉米粉

孢子数量/克

15*106

1.6*105

2.4*104

≤102

实施例2、制备印度梨形孢菌剂

按照如下步骤操作：

1)菌种活化：同实施例1中的菌种活化方法。

2)种子液制备：采用实施例1中的改良的CM液体培养基，碳源为可溶性淀粉，采用实施例1中的种子液制备方法步骤，28℃震荡培养(160r/min)10天，培养后得到印度梨形孢种子液。

3)固体发酵培养：300毫升固体培养基中加入5毫升步骤2)得到的种子液，24-26℃(本实施例具体采用25℃)培养7天。所述的固体培养基为：高粱粒中加入5％(蔗糖/高粱粒的质量百分比)的蔗糖，加水煮沸，加水量为20％-40％(w/w，水/高粱粒的重量比)，直到吸满水份为止，然后装入500ml三角瓶，每瓶装300毫升，灭菌(121℃,1小时)备用。

4)测定固体发酵培养基中菌体的数量，待发酵基质中孢子量达到1.0～20×10⁶个/克时，将培养基料倒出晾晒2-3天，充分干燥后粉碎过筛得到固体发酵粉，粉碎后颗粒大小为0.15mm。

5)制备印度梨形孢菌剂：以孢子含量为1.0～20×10⁶个孢子/克的固体发酵粉为母粉，加入0.05％～0.1％(w/w，黄原胶/整个菌剂)的黄原胶(本实施例具体采用0.08％)、1％～5％(w/w，分散剂/整个菌剂)(本实施例具体采用3％)的分散剂(95％NNO，分散剂NNO的CAS登录号为36290-04-7)、1％～5％(w/w，展布剂/整个菌剂)(本实施例具体采用2.5％)的展布剂十二烷基磺酸钠(CAS登录号2386-53-0)，混合均匀即得粉剂。也可以制备成其它各种剂型，如通过研磨过300目筛加入助剂等制备为可湿性粉剂，或者通过造粒制备为颗粒剂。

实施例3、印度梨形孢菌剂对小麦的影响

小麦品种选择中麦100，2020年10月9日在天津农科院现代农业创新基地播种，采用条播，试验设三个处理，

处理1：用实施例2制备的印度梨形孢菌剂配制药剂浸种，药剂配比为1克菌剂加100ml自来水混匀，浸泡小麦种子1h，捞出控水后播种覆土；

处理2：用印度梨形孢菌液(用实施例2制备的印度梨形孢菌剂加水配成悬浮液，1克菌剂加100ml自来水混匀得到，简称菌液)浇灌在播种沟内，播种沟长1m、宽5cm，每米长浇灌50ml菌液，然后播种覆土；处理3：不经任何处理的小麦播种后覆土，作为对照。

一、印度梨形孢菌剂对小麦生长的影响

第二年小麦拔节期3月23日调查，调查结果如表3所示。

表3印度梨形孢菌剂处理对小麦生长的影响

调查结果表明，印度梨形孢菌剂处理小麦后，浸种和灌根两种处理方式都不同程度的提高小麦株高、根长、叶绿素含量、分蘖数、地上鲜重、干重、地下鲜重干重，其中根长、叶绿素含量、分蘖数、地上鲜重、地下鲜重干重明显高于清水对照(生长情况对比如图4)，因此印度梨形孢菌剂处理小麦后具有明显的促进小麦生长的作用。

二、印度梨形孢菌剂对小麦产量的作用

小麦收获后于6月28日进行考种，调查产量，结果如表4所示。

表4印度梨形孢菌剂对小麦产量的影响

从表4的结果可以看出，印度梨形孢菌剂浸种处理小麦后，小麦植株的穗粒数、穗粒重及产量都显著高于清水对照，而灌根处理不明显，因此印度梨形孢菌剂对小麦浸种后能够明显增加小麦的产量的作用。

三、印度梨形孢菌剂对小麦土传病害的防控作用

对前述处理1、2、3的小麦，田间用部分试验小区的小麦苗做病害防控实验。

小麦长至3叶一心时，将小麦茎基腐病、小麦纹枯病、小麦根腐病的病原菌菌片分别放置于小麦茎基部，均匀分布，每米行长放置20片，用土覆盖，浇水，30天后调查结果，结果如表5所示。

表5印度梨形孢处理对小麦病害的防控作用

通过表5可以看出，采用印度梨形孢菌剂对小麦浸种，对小麦茎基腐病、小麦纹枯病、小麦根腐病防效分别为81.6％、76.0％、82.3％，印度梨形孢菌剂灌根处理小麦，对对小麦茎基腐病、小麦纹枯病、小麦根腐病防效分别为64.6％、62.4％、61.5％，因此，从试验结果可以看出，印度梨形孢菌剂对小麦浸种对病害的防效更好。

实施例4、印度梨形孢菌剂的耐储性实验

将按照实施例2的方法制备得到的印度梨形孢菌剂常温下储藏2年，每隔6个月进行厚垣孢子活性(厚垣孢子萌发率)的检测，检测方法：称取定量的菌剂于1％蔗糖水溶液中，25℃下放置48小时，显微镜下观察印度梨形孢厚垣孢子萌发情况，检测结果如表6中所示：

表6印度梨形孢菌剂储藏后活性检测结果

检测时间	2019年3月	2019年9月	2020年3月	2020年9月	2021年3月	2021年9月
							萌发率％	100	100	100	100	99	98

从实验可知，经过2.5年的储藏，菌剂的活性仍然保持很高，本发明的印度梨形孢菌剂具有很好的耐储性，制备得到的菌剂能长时间保存并保持孢子活性，为大面积田间生产应用提供了可能。

Claims

1.一种印度梨形孢菌剂，其特征在于：包括含有活性成分印度梨形孢菌体的发酵载体，以及孢子保护剂、分散剂和展布剂，所述发酵载体中印度梨形孢厚垣孢子的含量为1.0～20.0×10⁶个孢子/克，所述分散剂和展布剂在所述印度梨形孢菌剂中的重量百分比均为1％～5％，所述孢子保护剂在所述印度梨形孢菌剂中的重量百分比为0.05～0.1％。

2.如权利要求1所述的印度梨形孢菌剂，其特征在于：所述印度梨形孢菌体为印度梨形孢菌丝及厚垣孢子混合物；所述发酵载体为固体发酵载体，由高粱、水、蔗糖制备得到；所述孢子保护剂为黄原胶，所述分散剂为NNO，所述展布剂为十二烷基磺酸钠；所述印度梨形孢菌剂为粉尘剂或者可湿性粉剂或者颗粒剂。

3.如权利要求2所述的印度梨形孢菌剂，其特征在于：所述发酵载体是按照如下方法制备得到：高粱粒中加入蔗糖，加水煮沸，加水量为直到高粱粒吸满水份为止，搅拌均匀，灭菌备用，其中，高粱粒、水、蔗糖的质量比为100﹕20～40﹕1～5。

4.权利要求1至3任一项所述的印度梨形孢菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取印度梨形孢菌种进行活化；

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中印度梨形孢菌种在PDA培养基中24～26℃培养15天；

所述印度梨形孢菌种采用保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心的CGMCCNO.10325印度梨形孢。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述改良CM培养基的组成为：可溶性淀粉20g、20×盐溶液50mL、鱼粉或牛肉膏2g、微量元素溶液1mL，1000毫升自来水；

所述20×盐溶液的组成为：NaNO₃ 120g、KCl 10.4g、MgSO₄×7H₂O 10.4g、KH₂PO₄ 30.4g，加蒸馏水定容1L；

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：活化后的印度梨形孢菌株在可溶性淀粉作为碳源的改良CM培养基中在28℃、150～170r/min震荡培养10天，培养后得到印度梨形孢种子液。

8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中在固体培养基中加入骤2)得到的种子液，种子液﹕固体培养基的体积比为1﹕60，25℃培养7天；所述步骤4)中将培养基料倒出晾晒2～3天；

所述步骤5)中，加入的孢子保护剂、分散剂、展布剂的重量百分比依次为0.08％、3％、2.5％。

9.印度梨形孢在防治小麦土传病害中的应用，其特征在于：所述小麦土传病害为小麦茎基腐病或纹枯病或根腐病。

10.权利要求1至3任一项所述的印度梨形孢菌剂在促进小麦生长及增产中的应用，或者在防治小麦茎基腐病或纹枯病或根腐病中的应用。