CN111205998A - 解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841及其应用 - Google Patents

解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。该解淀粉芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17841。所提供的解淀粉芽孢杆菌可以作为微生物菌剂，也可以和其他菌剂复配成复合菌剂，或者加入肥料中使用。所提供的解淀粉芽孢杆菌、微生物菌剂、复合菌剂、肥料等对草莓根腐病病原菌有较好的抑制作用，可用于草莓根腐病的预防。

Description

解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841及其应用
技术领域
本发明属于微生物和肥料领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841及其应用，尤其涉及一种解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17841)、微生物菌剂、复合菌剂、肥料及防治根腐病的方法。
背景技术
草莓根腐病是近些年来保护地栽培中的常见病害，也是一种土传病害，往往造成大棚草莓的连片死棵，给种植户带来重大的经济损失。在设施草莓种植地区连年发生，并呈加重的趋势。引起草莓根腐病的病原菌很多，其中危害较重的是由拟盘多毛孢引起的。针对草莓根腐病，尤其是设施栽培中的土传病害，目前生产上大多采用土壤消毒、高温闷棚的做法。即用具有广谱杀菌作用的土壤消毒剂(又称土壤处理剂)对整个大棚的土壤进行施用，这样的处理方法杀菌效果较好，但对土壤物理性质和微生态破坏严重，得不偿失。例如常用的溴甲烷处理剂，由于对土壤微生物的影响和臭氧层的威胁，2015年被农业部禁止使用。同时，多种杀菌剂类土壤操作出现处理不彻底，移栽后根腐病复发严重的问题，使得根腐病成为草莓种植的顽疾和恶性病害，亟需有好的方法解决。
因此针对根腐病的防治还需要进一步改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种解淀粉芽孢杆菌、微生物菌剂、复合菌剂、肥料以及防治根腐病的方法。
解淀粉芽孢杆菌具有抑制植物病害的能力，能够产生多种代谢产物，主要包括：抑菌蛋白类，脂肽类蛋白质，伊枯草菌素A，表面活性物质，芬芥素，芽孢菌素D，大环内酯类，寡肽酶，肽类，聚酮化合物等。解淀粉芽孢杆菌对多种作物的致病真菌有较好的抑制效果，可制成生物制剂应用于植物病害防治上，因此其生物学特性和生产工艺的研究具有非常重要的意义。本发明通过筛选获得对于病原菌抗性高的菌株，经鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌，并经验证该菌株表现为对根腐病的良好的防治效果，尤其是对拟盘多毛孢为主引起的草莓根腐病具有良好的防治效果。而且解淀粉芽孢杆菌对多种作物病害均具有很好的防治效果，例如对果蔬作物上的灰霉病菌、镰刀病菌、全蚀病菌、褐腐及炭疽病菌，对玉米大斑病又称条斑病、煤纹病、枯叶病、叶斑病等，对水稻稻曲病等均有很好的效果。所提供的解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17841)可制备微生物菌剂、复合菌剂、肥料等，用于植物的根腐病的预防和治疗。
具体而言，本发明提供了如下技术方案：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17841。本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌，从连续多年种植草莓的大棚土壤中筛选获得。经过实验室平皿拮抗实验、草莓盆栽试验、田间试验验证，通过形态学、生理生化特性及16S rRNA基因鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。其对拟盘多毛孢(P.clavispora)和镰刀菌均具有良好防治作用，对两种病原菌的抑制率均为80％以上。其能够防治因拟盘多毛孢、镰刀菌引发的根腐病，能够抑制病原微生物拟盘多毛孢和镰刀菌的菌丝生长，减少孢子产生，适应草莓种植过程中抗病需求。所提供的解淀粉芽孢杆菌使可以作为微生物菌剂，也可以和其他菌剂复配制备复合菌剂，微生物菌剂或者复合菌剂本身可以作为肥料或者加入肥料中使用，用来防治根腐病，使得作物的产量有了显著增加，品质有了明显提升、口感更佳。以草莓为例，这种作物的产量和品质的提升可以体现在单果重、亩产量和糖度等方面均有了很大提升。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括本发明第一方面所述的解淀粉芽孢杆菌。
在本发明的一些实施例中，所述微生物菌剂为干粉状，每克所述微生物菌剂中含有所述解淀粉芽孢杆菌的有效活菌数至少为7×1010CFU，优选为1×1011CFU。将微生物菌剂制备成干粉状，每克微生物菌剂中含有的有效活菌数在7×1010CFU以上，例如在1×1011CFU以上，优选为1.5×1011CFU，从而可以应用该微生物菌剂预防和治疗作物的根腐病，快速高效治疗作物的根腐病，提高作物品质。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种制备微生物菌剂的方法，所述微生物菌剂为本发明第二方面所述的微生物菌剂，所述方法包括：对所述解淀粉芽孢杆菌进行发酵处理；基于所述发酵处理的产物，获得所述微生物制剂。通过对上述解淀粉芽孢杆菌进行发酵处理，获得微生物菌剂，可以用于作物根腐病的防治，同时提高作物的品质和产量。
根据本发明的实施例，以上所述制备微生物菌剂的方法可以进一步包括如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述发酵处理包括：将所述解淀粉芽孢杆菌进行液体发酵培养，以便获得种子培养液；将所述种子培养液接种在固体发酵培养基中进行固体发酵培养，以便获得所述发酵处理的产物。
在本发明的一些实施例中，所述固体发酵培养基包括：3～10重量份的麦麸，0.5～5重量份的豆粕，0.5～5重量份的玉米粉，0.05～0.5重量份的硫酸镁，0.05～0.5重量份的氯化钠以及水。应用该固体发酵培养基可以快速发酵获得微生物菌剂。
在本发明的一些实施例中，所述方法进一步包括：将所述发酵处理的产物进行烘干粉碎处理，获得粉末状的微生物菌剂。通过烘干粉碎处理，可以获得粉末状的微生物菌剂，方便保存和使用。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包括第一微生物菌剂和不同于所述第一微生物菌剂的第二微生物菌剂，所述第一微生物菌剂为本发明第二方面所述的微生物菌剂。通过不同的微生物菌剂进行复配，不同的微生物菌剂可以具有发挥不同或者相同或者相似的功能，通过复配可以使得复合菌剂发挥多种作物疾病的预防和治疗目的，提高作物品质。
在本发明的一些实施例中，所述第二微生物菌剂包括选自胶质芽孢杆菌菌剂、绿色木霉菌剂、土曲霉菌剂、解淀粉芽孢杆菌菌剂中的至少一种。这些微生物菌剂对于植物生长有很大的促进作用，对于病原菌有较好的防治效果，因此与所提供的第一微生物菌剂复配，可以进一步提高作物品质。
在本发明的一些实施例中，所述复合菌剂包括1～3重量份的所述第一微生物菌剂，以及选自下列中的至少一种：0.2～3重量份的胶质芽孢杆菌菌剂；0.5～3重量份的绿色木霉菌剂；0.5～3重量份土曲霉菌剂。
在本发明的一些实施例中，所述复合菌剂包括1～1.5重量份的所述第一微生物菌剂，以及选自下列中的至少一种：0.2-2重量份的胶质芽孢杆菌菌剂，优选为0.5～1.5重量份的所述胶质芽孢杆菌，更优选为1～1.5重量份的所述胶质芽孢杆菌菌剂；0.5～3重量份的绿色木霉菌剂，优选为0.5～1.5重量份的绿色木霉菌剂，更优选为1～1.5重量份的绿色木霉菌剂； 0.5～2重量份的土曲霉菌剂，优选为0.5～1.5重量份的土曲霉菌剂。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种肥料，所述肥料包括本发明第二方面所述的微生物菌剂或者本发明第四方面所述的复合菌剂。
在本发明的一些实施例中，所述肥料进一步包括基础肥料，和所述基础肥料包括选自生物有机肥、无机复合肥、有机复合肥或者有机无机复混肥，所述微生物菌剂或者所述复合菌剂含量为所述基础肥料含量的1‰～5‰。
在本发明的一些实施例中，所述生物有机肥包括30～50重量份的发酵牛粪、20～40重量份的炭基肥、10～30重量份的小分子有机料和5～15重量份的硅酸钙。
在本发明的一些实施例中，所述生物有机肥包括40重量份的发酵牛粪、30重量份的炭基肥和20重量份的小分子有机料，和10重量份的硅酸钙。
在本发明的第六方面，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌在制备微生物菌剂、复合菌剂或者肥料中的应用，所述解淀粉芽孢杆菌为本发明第一方面所述的解淀粉芽孢杆菌。
在本发明的第七方面，本发明提供了一种防治根腐病的方法，包括：对植物施用有效量的解淀粉芽孢杆菌，微生物菌剂，复合菌剂或者肥料，其中所述解淀粉芽孢杆菌为本发明第一方面所述的解淀粉芽孢杆菌，所述微生物菌剂为本发明第二方面所述的微生物菌剂，所述复合菌剂为本发明第四方面所述的复合菌剂，所述肥料为本发明第五方面所述的肥料。
在本发明的一些实施例中所述植物为草莓，所述根腐病为拟盘多毛孢和/或镰刀菌引起的根腐病。
菌种保藏说明
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.17841，保藏日期为2019年05月22日。
附图说明
图1是根据本发明的实施例提供的解淀粉芽孢杆菌的菌落形态图片。
图2是根据本发明的实施例提供的解淀粉芽孢杆菌拮抗草莓根腐病菌的效果图片。
图3是根据本发明的实施例提供的解淀粉芽孢杆菌的16SrRNA测序后构建系统进化树的结果图。
具体实施方式
下面将结合附图详细描述本发明的实施例，需要说明的是，所描述的各实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本文中，如无特殊说明，当表述某种物质的含量时，是指的该物质的质量占总物质含量的百分比。
本发明通过大量筛选工作得到一株能够防治多种植物病害的解淀粉芽孢杆菌菌株。该解淀粉芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.17841。经验证，该解淀粉芽抱杆菌在防治草莓根腐病中显示出非常高效的防治效果，使得草莓产量显著增加。发明的解淀粉芽抱杆菌菌株，可以用于制备防治多种植物病害的微生物肥料中。因而，本发明的解淀粉芽抱杆菌是具有广泛应用前景。
所提供的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841可以制备成微生物菌剂，作为单一菌剂使用。为此，在本发明的一个方面，本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841。所提供的微生物菌剂可以作为肥料或者治病药物应用于根腐病的防治中，能够防治病虫害，提高作物产量。
所提供的微生物菌剂可以通过发酵获得。为此，在本发明的另一个方面，本发明提供了一种制备上述微生物菌剂的方法，包括：对解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841进行发酵处理；基于所述发酵处理的产物，获得所述微生物菌剂。在本发明的至少一些实施方式中，所述发酵处理包括：将所述解淀粉芽孢杆菌进行液体发酵培养，以便获得发酵培养液；将所述发酵培养液接种在固体发酵培养基中进行固体发酵培养，以便获得所述发酵处理的产物。在至少一些实施方式中，可以利用LB培养液进行所述液体发酵培养，所述液体发酵培养的时间为10小时以上，优选为10～16小时。
在本发明至少一些实施方式中，将所述发酵培养液按照接种量(发酵培养液占固体发酵培养基的质量百分比)为5％～10％接种在固体发酵培养基中进行发酵培养。所用到的固体发酵培养基包括3～10重量份的麦麸，0.5～5重量份的豆粕，0.5～5重量份的玉米粉，0.05～0.5 重量份的硫酸镁，0.05～0.5重量份的氯化钠和水，其中所述固体发酵培养基中水的含量为 50％～60％。
在一些优选实施方式中，所述固体发酵培养基包括4重量份的麦麸，1重量份的豆粕， 1重量份的玉米粉，0.1重量份的硫酸镁，0.1重量份的氯化钠和水，其中固体发酵培养基中水的含量为60％。
将获得的发酵产物烘干粉碎，所获得的每克微生物菌剂中含有的解淀粉芽孢杆菌活菌数至少为7×1010CFU，优选为1×1011CFU以上，例如可以为2×1011CFU，3×1011CFU。
所提供的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841不仅可以制备成微生物菌剂，作为单一菌剂使用，还可以同其他微生物菌剂进行复配，制备成复合菌剂。为此，在本发明的另一方面，本发明提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包括第一微生物菌剂和第二微生物菌剂，其中第一微生物菌剂为上述微生物菌剂(即包含有解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841的微生物菌剂)，第二微生物菌剂不同于第一微生物菌剂。可用的第二微生物菌剂可以是其他的解淀粉芽孢杆菌菌剂，也可以是胶质芽孢杆菌菌剂，绿色木霉菌剂，土曲霉菌剂等等，只要能够起到防治病虫害或者疾病的目的即可。这里的胶质芽孢杆菌菌剂是指包含有胶质芽孢杆菌的微生物菌剂，绿色木霉菌剂是指包含有绿色木霉的微生物菌剂，相似地，其他菌剂也做类似理解。
在制备这些复合菌剂的过程中，可以将各微生物在适合条件下制备成相应微生物菌剂，然后再进行复配。例如，胶质芽孢杆菌可以按照与解淀粉芽孢杆菌相似的条件进行发酵，制备胶质芽孢杆菌菌剂。在至少一些实施方式中，胶质芽孢杆菌菌剂通过下述方法发酵获得：将胶质芽孢杆菌进行液体发酵培养，获得种子发酵液，然后将所述种子培养液接种到第一固体发酵培养基上，获得发酵产物。在至少一些实施方式中，该第一固体发酵培养基包括：3～10重量份的麦麸，0.5～5重量份的豆粕，0.5～5重量份的玉米粉，0.05～0.5重量份的硫酸镁，0.05～0.5重量份的氯化钠以及水，其中所述固体发酵培养基中水的含量为50％～60％。在一些优选实施方式中，所述固体发酵培养基包括4重量份的麦麸，1重量份的豆粕，0.1重量份的玉米粉，0.1重量份的硫酸镁，0.1重量份的氯化钠和水，其中固体发酵培养基中水的含量为60％。在一些实施方式中，可以将种子发酵液按照5％～10％接种量进行接种。所获得的发酵产物进行烘干粉末，获得粉末状的胶质芽孢杆菌菌剂，其中每克胶质芽孢杆菌菌剂中含有胶质芽孢杆菌的有效活菌数至少为5×109，例如可以为 1×1010～5×1010。
利用绿色木霉和土曲霉制备绿色木霉菌剂或者制备土曲霉菌剂的条件相似。在本发明的至少一些实施方式中，可以将绿色木霉和土曲霉分别在PDA液体培养液中发酵，获得种子培养液，然后将种子培养液接种到第二固体发酵培养基上，分别得到土曲霉和绿色木霉的发酵产物。其中，可用的第二固体发酵培养基包括：2～5重量份的麦麸，1～5重量份的玉米淀粉，0.5～3重量份的大米碎渣，0.5～3重量份的小米，0.3～1.5重量份的秸秆渣和水，其中该固体发酵培养基中水的含量为55％～65％。在一些优选实施方式中，第二固体发酵培养基包括：2重量份的麦麸，1.5重量份的玉米淀粉，1重量份的大米碎渣，1重量份的小米， 0.5重量份的秸秆渣和水，其中该固体发酵培养基中水的含量为60％。将得到土曲霉和绿色木霉的发酵产物分别进行烘干粉碎，获得粉末状的土曲霉菌剂和绿色木霉菌剂，其中每克土曲霉菌剂含有土曲霉的有效活菌数为3×109以上，优选为3×109～5×1010；每克绿色木霉菌剂含有绿色木霉的有效活菌数为5×109，优选为3×109～5×1010。
在本发明的至少一些实施方式中，本发明提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包括上述第一微生物菌剂以及上述胶质芽孢杆菌菌剂、绿色木霉菌剂、土曲霉菌剂中至少一种。在一些实施例中，上述第一微生物菌剂在与胶质芽孢杆菌菌剂、绿色木霉菌剂、土曲霉菌剂中的任意一种或者任意几种复配时，可以按照1～3:1～3的比例进行掺混。所得到的复合菌剂每克含有活菌数为1000亿以上，优选为2000亿以上，例如为3000亿。
在本发明的至少一些实施方式中，复合菌剂包括1～1.5重量份的解淀粉芽孢杆菌、1～1.5 重量份的胶质芽孢杆菌、0.5～1.5重量份的绿色木霉和0.5～1.5重量份的土曲霉。在本发明的至少一些实施方式中，复合菌剂包括1～1.5重量份的解淀粉芽孢杆菌、1～3重量份的绿色木霉和0.5～1.5重量份的土曲霉。在本发明的至少一些实施方式中，复合菌剂包括1～1.5重量份的解淀粉芽孢杆菌和1～3重量份的绿色木霉。在本发明的另一些实施方式中，复合菌剂包括1～1.5重量份的解淀粉芽孢杆菌、0.2～2重量份的胶质芽孢杆菌。在本发明的又一些实施方式中，复合菌剂包括1～1.5重量份的解淀粉芽孢杆菌、0.5～1.5重量份的胶质芽孢杆菌和1～3重量份的绿色木霉。在本发明的再一些实施方式中，复合菌剂包括1～1.5重量份的解淀粉芽孢杆菌、0.5～1.5重量份的胶质芽孢杆菌和0.5～2重量份的土曲霉。
上述提供的微生物菌剂或者复合菌剂可以单独作为肥料或者治病药物使用，也可以添加到肥料中使用。例如可以将上述微生物菌剂或者复合菌剂添加到有机复合肥、有机无机复混肥、无机复合肥中，添加量可以为千分之一以上，获得的肥料可以用作植物促生或者根腐病防治。为此，在本发明的又一方面，本发明提供了一种肥料，所述肥料包括上述微生物菌剂或者复合菌剂。在至少一些实施方式中，所制备的每克肥料中含有的有效活菌数为1亿以上，例如为1.2亿。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17841)的分离、筛选及鉴定
1、分离与筛选
从山东省临沂市河东区观塘镇种植草莓的地区收集100份健康土壤样品，从土壤样品中分离拮抗草莓根腐病的土壤微生物。将采集到的土壤样品称取1g左右装于250mL三角瓶中，加入少量玻璃珠，三角瓶中预先装入100mL的无菌蒸馏水。将三角瓶放入摇床内震荡培养过夜，取出静止后吸取上层液1ml打入装有9ml无菌水的试管中，以此10倍逐级稀释，稀释至103-106倍。取100μl各级稀释液均匀涂布在固体平板上，分别以高氏1号培养基、LB培养基作为基质。每处理3次重复，培养条件为28℃。培养2-5d后挑取代表性菌株，进行平皿拮抗筛选，通过与草莓根腐病菌拮抗，筛选出拮抗效果明显的菌株。
所筛选得到的一株抗菌效果好的菌株命名为J1，其在LB培养基作为基质的平皿上的菌株的菌落形态图片如图1所示，其拮抗草莓根腐病菌的效果图片如图2所示。
2、鉴定
(1)提取菌株的总DNA
将上述筛选获得的J1菌株接种于营养液体培养基中培养1d，取1.0-2.0mL发酵液离心后，取菌体，使用细菌基因组DNA提取试剂盒-离心柱型(北京天根生物公司)进行菌株总DNA的提取，将DNA产物保存在-20℃，以防降解。若菌株为较难破壁的革兰氏阳性菌，则先加入溶菌酶，37℃处理30min以上。
(2)16S rRNA基因的PCR扩增及回收
采用扩增细菌16S rRNA的通用引物(即SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，由宝生物工程(大连)技术有限公司合成)，采用下述PCR反应体系以及下述PCR反应条件扩增该菌株16SrRNA。
上游引物：5’一AGAGTTTGATCCTGGCTCAG一3’(SEQ ID NO:1)；
下游引物：5’一GGCTACCTTGTTACGACT一3’(SEQ ID NO:2)。
PCR反应体系如下：
Figure RE-GDA0002450596910000081
PCR反应条件
Figure RE-GDA0002450596910000082
所获得PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测片段长度和纯度后，送至宝生物工程(大连) 有限公司进行测序，结果经NCBI网站对比分析，构建系统发育树，鉴定菌株种类。所构建的系统发育树如图3所示，该菌株为解淀粉芽孢杆菌。
将该菌株进行保藏，保藏编号为CGMCC No.17841，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例2解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17841)的抗病效果
1、草莓根腐病病原菌的平皿拮抗效果
将市场上购买的解淀粉芽孢杆菌(w1，w2，w3)和3种其他菌(w4，w5，w6)以及解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841(编号为J1)分别在30℃，180rpm培养条件下于液体LB 培养基培养24小时，获得相应的发酵液。
设置对照组以及各实验组，各实验组分别采用上述制备的不同的发酵液。取各处理的发酵菌液1ml注入培养皿中，将融化好的PDA培养基导入平皿中，快速混匀后静置冷却。然后接入草莓根腐病菌(分别为拟盘多毛孢和镰刀菌)于培养基中央。对照组中平皿中用无菌水与培养基混合，待对照平皿长满菌落后测量菌落直径，计算各处理组的拮抗率。
表1菌液平皿拮抗效果
Figure RE-GDA0002450596910000091
注：拮抗率计算公式如下，其中公式中对照菌落是指以无菌水处理，对应的病原菌的菌落直径。
拮抗率(％)＝(对照菌落直径–处理菌落直径)/对照菌落直径*100
从表1给出的结果可以看出本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841相较于其他处理组，对拟盘多毛孢菌的拮抗效果好15-30％，而对镰刀菌的抑制效果与其他处理组无明显差异。
2、菌剂对草莓根腐病的盆栽防治效果
试验于试验大棚内进行，试验分为对照组和实验组，实验组分别采用解淀粉芽孢杆菌 CGMCC No.17841以及其他外采菌剂(编号为W1-W5)的发酵液；对照组用清水进行防治。
每组20盆，每盆种植一株长势一致、无叶斑的健康草莓植株，盆为30cm×20cm×30cm (盆口直径×盆底直径×盆高)，盆中装3.5kg灭菌土壤。在缓苗后15天后将各发酵液或者清水加入各盆植株根部土壤中，48h后接入病原菌(拟盘多毛孢孢子悬液，浓度为106cfu/ml)， 14天后开始调查，统一田间管理，按照下述方法计算发病率，具体实验结果见表2。
发病率的计算方法如下：
叶子发黄或干枯后，拔出检查根部，统计根部的发病情况，将根腐病病害分为6级：0 级为根系未发病；1级为根系发病率≤30％，叶片正常；2级为30％<根系发病率≤60％，叶片正常；3级为60％<根系发病率≤80％，叶片变黄；4级为根系发病率80％以上，叶片枯萎；5级为整株死亡，叶片干枯。
发病率(％)＝∑(病害级别×该级别植株数)/(总株数×病害最高级值)×100
表2菌剂盆栽拮抗效果
编号 处理 发病率
T1 解淀粉芽孢杆菌(J1)发酵液 5％
T2 解淀粉芽孢杆菌(W1)发酵液 27％
T3 解淀粉芽孢杆菌(W2)发酵液 45％
T4 解淀粉芽孢杆菌(W3)发酵液 40％
T5 胶质芽孢杆菌(W4) 36％
T6 枯草芽孢杆菌(W5) 65％
对照 清水 85％
从表2中可以看出本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841的发病率较清水差异明显，较其他解淀粉菌株发病率减少23-40％，较胶质芽孢杆菌或者枯草芽孢杆菌发病率减少了60％。
实施例3解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17841)菌剂
按照下述方法制备解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841菌剂：
将解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841接种至100ml LB液体摇瓶中单独发酵，温度为30℃，pH7，转速180rpm，培养24小时。随后转接到固体发酵培养基A上，接种量为8％，在30℃发酵2天，得到发酵处理后的产物，其中固体发酵培养基A包括麦麸、豆粕、玉米粉、硫酸镁和氯化钠，其中按重量组分计，麦麸：豆粕：玉米粉：硫酸镁：氯化钠＝4:1:1:0.1:0.1，该固体发酵培养基A的含水量为60％。
将发酵处理后的产物在60℃条件下烘干12小时得到成粉末状的菌粉，其中每克菌剂中含有解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841的活菌数为7×1010。
对该解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17841)菌剂进行田间抗病效果的验证，试验于山东省临沂市进行，包括：
选取2个草莓大棚，即草莓大棚A和草莓大棚B，每个大棚1亩，分别利用解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841、市场购买菌剂进行处理，同时设置空白对照组(不使用菌剂)，每个处理10垄，垄宽80cm，长10m。具体实验结果见表3和表4。其中鲜重(g/株)代表草莓植株的重量；结果数(个/株)代表每株植株上所结的草莓的个数；产量(g/株)代表草莓果实的重量；甜度(％)通过糖度仪检测获得。需要说明的是，以下各实施例中鲜重、结果数、产量、甜度等均与该实施例具有相同的含义以及相同的计算方式其中甜度利用糖度仪进行检测。
表3草莓大棚A试验结果
Figure RE-GDA0002450596910000111
表4草莓大棚B试验结果
Figure RE-GDA0002450596910000112
从表3和表4给出的实验结果可以看出，本发明所提供的微生物菌剂能够有效降低草莓根腐病的发病率，且有促根壮苗、增产、促进果实糖分的累积，提高品质。具体表现为：与对照相比，草莓植株生理指标均有提升，果实饱满，畸形果少，味甜、口感好，相较于市场上购买菌剂发病率减少21％-34％。
实施例4复合菌剂
实施例4提供了复合菌剂，所提供的复合菌剂通过将不同的菌剂按照一定的比例混合获得的。可将解淀粉芽孢杆菌GGMC No.17841菌剂与胶质芽孢杆菌菌剂、绿色木霉菌剂、土曲霉菌剂至少之一按照1～1.5：0.2-2：0.5～3：0.5～2质量比例进行掺混，优选地，可将解淀粉芽孢杆菌GGMC No.17841菌剂与胶质芽孢杆菌菌剂、绿色木霉菌剂、土曲霉菌剂至少之一按照1～1.5：0.2-2：0.5～3：0.5～2质量比例进行掺混。具体的复合菌剂如下，其中所用到的胶质芽孢杆菌、绿色木霉、土曲霉均通过商购获得。
包括如下步骤：
1、制备解淀粉芽孢杆菌菌剂。
将解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841参照实施例3所列出的方法制备解淀粉芽孢杆菌菌剂，每克所制备得到的解淀粉芽孢杆菌菌剂中含有解淀粉芽孢杆菌的有效活菌数为 7×1010。
2、制备胶质芽孢杆菌菌剂。
胶质芽孢杆菌参照与解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17841相同的方法制备胶质芽孢杆菌菌剂，每克所制备得到的胶质芽孢杆菌菌剂中含有胶质芽孢杆菌的有效活菌数为2×1010。
3、制备绿色木霉、土曲霉菌剂
将土曲霉、绿色木霉分别在100ml PDA液体摇瓶中单独发酵，温度为27℃，转速120rpm，培养28小时得到菌丝球。随后将菌丝球分别接种到固体发酵培养基B上，接种量为8％，30℃发酵，光照24小时后黑暗培养24小时，连续发酵9天，分别得到土曲霉和绿色木霉的发酵产物。其中固体发酵培养基B的配方按重量组分计为麦麸：玉米淀粉：大米碎渣：小米：秸秆渣＝2:1.5:1:1:0.5，含水量60％。
将所获得的发酵产物烘干并粉碎，获得粉末状的绿色木霉菌剂和土曲霉菌剂，其中每克绿色木霉菌剂中含有绿色木霉的有效活菌数为5×109，每克土曲霉菌剂中含有土曲霉的有效活菌数为5×109。
将解淀粉芽孢杆菌菌剂、胶质芽孢杆菌菌剂、绿色木霉菌剂、土曲霉菌剂按照下表5 所示出的比例进行掺混，获得相应的复合菌剂，每克复合菌剂中含有的其有效活菌数为4×1010。
表5菌剂复配实例
Figure RE-GDA0002450596910000121
Figure RE-GDA0002450596910000131
将所制备的复合菌剂进行田间抗病效果验证，试验于山东省临沂市进行，包括：
选取1个草莓大棚，面积1亩，分别设置市场购买复合菌剂、上述制备的复合菌剂处理、CK处理(不使用菌剂)，每个处理10垄，垄宽80cm，长10m。实验结果如下表6所示：
表6草莓大棚试验结果
Figure RE-GDA0002450596910000132
从表6可以看出，使用本发明所提供的复合菌剂与对照相比，草莓植株生理指标均有提升，果实饱满，畸形果少，味甜、口感好。而且本发明复合菌剂发病率比市场购买的复合菌剂发病率减少22％～31％。
实施例5肥料
实施例5提供了一种肥料，该肥料通过将解淀粉芽孢杆菌与发酵牛粪、炭基肥、小分子有机料、硅酸钙掺混获得。包括如下步骤：
1、提供复合菌剂，该复合菌剂分别为上述实施例4中的复合菌剂1、复合菌剂7、复合菌剂10和复合菌剂18。
2、按照发酵牛粪40％，炭基肥30％，小分子有机料20％，硅酸钙10％称取不同物料，掺混后获得相应的生物有机肥。然后均匀加入占生物有机肥含量1-5‰的上述复合菌剂，获得相应的肥料。同时为了便于与后续实施例制备的肥料相区分，所制备的肥料以相应的基础肥料，即生物有机肥命名。
表7肥料添加实例
Figure RE-GDA0002450596910000141
将所制备的微生物肥料进行田间抗病效果的验证，包括：
本发明所述的解淀粉芽孢杆菌菌剂，上述制备的肥料应用于草莓田间试验。试验地点在中化农业(临沂)研发中心有限公司试验大棚，结果见表8。
表8草莓大棚田间试验结果
Figure RE-GDA0002450596910000142
Figure RE-GDA0002450596910000151
从表8可以看出，与对照相比，草莓产量提升20％～26.8％，发病率降低14％～30％，甜度增加10％。
实施例6
实施例6提供了肥料，所提供的肥料分别通过将解淀粉芽孢杆菌菌剂或者复合菌剂添加到有机复合肥、或者添加到无机复合肥中制备而成。所添加的比例如下表9所示，其中所用到的有机复合肥为70-10(70代表有机质含量，10代表氮磷钾含量)，所用到的无机复合肥为15-15-15(指氮磷钾的含量分别为15％，15％，15％)。
可以将微生物菌剂或者复合菌剂在有机复合肥、无机复合肥包膜工段与防结粉混合均匀后添加，待稳定生产后得到相应的颗粒状肥料。所制备的肥料为了便于区分，以基础肥料命名。
表9菌剂与不同肥料混合实例
Figure RE-GDA0002450596910000152
对所制备的肥料进行田间抗病效果的验证，试验地点在山东省临沂市河东区观塘镇薛家店子村，包括：
其中对照组为施用70-10底肥，实验组1为添加J1菌剂的生物有机肥。实验组2、实验组3为添加市场购买菌剂的生物有机肥，实验组4为实施例6制备的有机无机复混肥2，实验组5为实施例6制备的有机无机复混肥4，实验组6为实施例6制备的有机无机复混肥5，实验组7为无机复合肥2制备的肥料。
表10草莓大棚田间试验结果
处理 产量(kg/亩) 发病率 甜度(％)
对照 2208 62％ 15.26
实验组1 2760 41％ 17.24
实验组2 2700 55％ 16.8％
实验组3 2680 58％ 17％
实验组4(有机复合肥2) 2865 40％ 18％
实验组5(有机复合肥4) 2906 47％ 17％
实验组6(有机复合肥5) 2900 44％ 17.2％
实验组7(无机复合肥2) 3000 42％ 16.5％
从表10给出的结果可以看出，与对照组相比，实验组1、4、5、6和7的草莓产量分别提升25％～35％以上，甜度增加8％～17.9％。与其他试验组对比，发病率减少15％以上。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 中化农业（临沂）研发中心有限公司
<120> 解淀粉芽孢杆菌CGMCC No. 17841及其应用
<130> PIDC3194247
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 上游引物
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 下游引物
<400> 2
ggctaccttg ttacgact 18

Claims (10)

1.一种解淀粉芽孢杆菌，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17841。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包括权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为干粉状，每克所述微生物菌剂中含有所述解淀粉芽孢杆菌的有效活菌数至少为7×1010CFU，优选为1×1011CFU。
4.一种复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括第一微生物菌剂和不同于所述第一微生物菌剂的第二微生物菌剂，所述第一微生物菌剂为权利要求2或3所述的微生物菌剂；
任选地，所述第二微生物菌剂包括选自胶质芽孢杆菌菌剂、绿色木霉菌剂、土曲霉菌剂菌剂中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括1～3重量份的所述第一微生物菌剂，以及选自下列中的至少一种：
0.2-3重量份的所述胶质芽孢杆菌菌剂；
0.5～3重量份的所述绿色木霉菌剂；
0.5～3重量份的所述土曲霉菌剂；
优选地，所述复合菌剂包括1～1.5重量份的所述第一微生物菌剂，以及选自下列中的至少一种：
0.2-2重量份的胶质芽孢杆菌菌剂，优选为0.5～1.5重量份的所述胶质芽孢杆菌，更优选为1～1.5重量份的所述胶质芽孢杆菌菌剂；
0.5～3重量份的绿色木霉菌剂，优选为0.5～1.5重量份的绿色木霉菌剂，更优选为1～1.5重量份的绿色木霉菌剂；
0.5～2重量份的土曲霉菌剂，优选为0.5～1.5重量份的土曲霉菌剂。
6.一种肥料，其特征在于，所述肥料包括权利要求2或3所述的微生物菌剂或者权利要求4或5所述的复合菌剂。
7.根据权利要求6所述肥料，其特征在于，所述肥料进一步包括基础肥料，所述基础肥料包括选自生物有机肥、无机复合肥、有机复合肥或者有机无机复混肥中的至少之一，所述微生物菌剂或者所述复合菌剂含量为所述基础肥料含量的1‰～5‰。
8.根据权利要求7所述的肥料，其特征在于，所述生物有机肥包括30～50重量份的发酵牛粪、20～40重量份的炭基肥、10～30重量份的小分子有机料和5～15重量份的硅酸钙。
9.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在制备微生物菌剂、复合菌剂或者肥料中的应用。
10.一种防治根腐病的方法，其特征在于，包括：
对植物施用有效量的解淀粉芽孢杆菌，微生物菌剂，复合菌剂或者肥料，其中所述解淀粉芽孢杆菌为权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，所述微生物菌剂为权利要求2或3所述的微生物菌剂，所述复合菌剂为权利要求4或5所述的复合菌剂，所述肥料为权利要求6～8中任一项所述的肥料；
优选地，所述植物为草莓，所述根腐病为拟盘多毛孢和/或镰刀菌引起的根腐病。
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