CN113215061A - 一种枯草芽孢杆菌scau-z8及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌SCAU‑Z8及其应用，本发明公开的一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SCAU‑Z8，其保藏编号为CCTCC NO：M2020836，其16SrRNA序列为SEQ ID NO.1。该菌株不仅可以明显抑制植物病原真菌的生长，降解作物秸秆，还能促进植物生长，提高玉米的叶片数、茎粗、株高、最大叶宽、最大叶长，提高土壤不同形态无机磷含量，具有很好的应用前景。

Description

一种枯草芽孢杆菌SCAU-Z8及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种枯草芽孢杆菌菌株，特别为一种促进植物生长的枯草芽孢杆菌SCAU-Z8及其应用。

背景技术

青稞是禾本科大麦属作物，裸大麦的一种。西藏是种植青稞的主要地区，也是该区最具优势的粮食作物。目前，在青稞种植生产中，产量低、病害多已经成为了制约青稞产业发展的主要因素。传统的化肥及农药虽然能在短期内提高青稞产量，但长期使用会对生态环境造成一定的破坏。因此开发高效环保的菌剂肥料，能在生态友好的基础上促进青稞生产以及解决目前的青稞供需矛盾。

长期以来，防治植物病害以及促进植物生长的主要方式是农药和肥料，虽然这种方法在防治疾病和促进生长的上效果显著，但是与此同时也引起了植物病原抗药性、农药残留等问题，造成了一定的环境污染和生态破坏。因此，改进现有种植方式，加强青稞自身微生物资源挖掘与应用，对于提高青稞产量和品质、保护生态环境、增加藏区人民经济收入提高生活水平具有重要的意义。

植物内生菌是指存在于植物组织中的细菌、放线菌和真菌等，在与植物长期的共存过程中，构建了和谐共处生存关系，并进化出了多种人类可以利用的有益功能，包括促进植物生长、抵抗植物病虫害、提高植物适应环境的能力。使用植物内生菌制备的微生物制剂可以降低农药、化肥施用给人类健康和生态环境带来的隐患，保护植物根际微生态平衡。因此，植物内生细菌在当前的微生物学领域研究有重大的研究价值。本专利以青稞籽粒为分离材料，进行内生细菌的分离筛选和鉴定，对于研发新型生物菌剂并进一步开发具备田间应用价值的新型生物有机肥具有重要应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一株促进植物生长的枯草芽孢杆菌SCAU-Z8，以及该菌株的用途，该菌株可以促进植物的生长，抑制植物病原真菌。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明西藏青稞(藏青2000)根际土中分离得到一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SCAU-Z8，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期：2020年12月3日；保藏编号为CCTCC NO：M2020836。

所述的枯草芽孢杆菌SCAU-Z8的16SrRNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了所述的枯草芽孢杆菌SCAU-Z8在植物病害生物防治中的应用，所述的植物病害为青稞白粉菌(Blumeria graminis f.sp.Hordei)、青稞根腐病菌(Bipolarissorokiniana)引起的植物病害，所述的植物为禾本科作物。

本发明还提供了所述的枯草芽孢杆菌SCAU-Z8在作为制备防治禾本科作物病害药物中的应用，其可以通过常规的液体或固体培养，获得包括细菌菌体培养物，通过常规的液体发酵生产，然后加入表面活性剂如分散剂、稳定剂、湿润剂、粘结剂、消泡剂、崩解剂、抗冻剂等中的一种或几种，或吸附载体按一定比例混合后，制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂或微乳剂；所述的禾本科作物为水稻、玉米、甘蔗、小麦、大麦或牧草。

本发明所述的枯草芽孢杆菌SCAU-Z8防治植物病害的方法也属于本发明的保护范围，该方法是在植物生长过程中进行喷雾处理；所述喷雾为枯草芽孢杆菌SCAU-Z8的菌悬液或发酵液或代谢产物制备的农药制剂。

本发明还提供了所述的枯草芽孢杆菌SCAU-Z8在促进植物生长方面的应用，同时枯草芽孢杆菌SCAU-Z8在作为制备植物生长调节剂的应用也在本发明的保护范围内。

本发明还提供了所述的枯草芽孢杆菌SCAU-Z8在降解纤维素和无机磷中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明提供的枯草芽孢杆菌SCAU-Z8可以促进植物的生长，其IAA产量为300.67±4.53m g/L，同时对青稞白粉菌(Blumeria graminis f.sp.Hordei)和青稞根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)有拮抗效果。该菌株作为禾本科植物的生物制剂材料，无论开发新的生物防治菌剂还是生长调节剂，都具有很好的市场前景。

附图说明

图1本发明菌株SCAU-Z8在盆栽试验中对玉米苗期素质的影响；其中CK为不接种本菌株的玉米，SCAU-Z8为接种本菌株的玉米。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1枯草芽孢杆菌SCAU-Z8的分离与鉴定

1.1菌株来源

本实施例样品取于西藏自治区隆子县隆子镇叶巴村的青稞藏青2000。随机采集青稞，装入灭菌密封塑料袋，贴上标签，带回实验室保存。

1.2内生细菌的分离

将青稞样品研磨后进行10倍系列稀释后接种于牛肉干蛋白胨培养基平板中，在37℃倒置培养3d，根据菌落大小、形态和色泽等表观特征挑取单菌落并进行纯化，通过分离获得68株菌落形态各不相同的菌株。

1.3芽孢杆菌SCAU-Z8的鉴定

用细菌基因组提取试剂盒进行细菌DNA提取，稀释10倍作为PCR反应的模板进行细菌16S扩增，扩增引物为27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')，然后将扩增产物回收并进行测序，测得的序列为SEQ ID NO.1，16SrRNA基因的NCBI基因登录号为MW346180。

基于以上特征，将菌株SCAU-Z8鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株已于2020年12月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏号为CCTCC NO：M2020836。

实施例2产吲哚乙酸(IAA)测定

将实施例1分离得到68株菌株接种到金氏培养基中培养到对数期，37℃140r/min振荡培养3天，取50μl于洗净的白瓷板中，加50μL显色剂，37℃下避光30min，如果出现粉红色，表明产生IAA，以没有接菌的金氏培养基为对照。

将金氏培养基中培养的菌株，8000r/min离心5min，取上清液5ml加入5mlSalkowski显色剂，37℃下避光30min后，530nm下测定吸光度值。以空白培养基作对照，并以IAA的标准样品对应的光密度做标准曲线，计算IAA的产量(mg/L)，不同菌株的IAA产生量见表1。

表1青稞内生细菌产IAA能力

结果显示，68株菌中有68株菌能产IAA，IAA产量高于100mg/L的菌株有17株，占分离总菌株的25％。其中SCAU-Z8菌株IAA产量为300.67±4.53mg/L。

实施例3抗菌活性测定

采用平板对峙法测定了分离菌株对青稞白粉菌(Blumeria graminisf.sp.Hordei)、青稞根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)以及小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum NRRL 5883)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)和稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)等5种指示菌的拮抗效果。测定抑菌圈直径(HD)与菌落直径(CD)，通过计算HD/CD的比值来筛选出有抑菌效果的菌株，具体如表2。

表2青稞内生细菌抑菌能力

表2中，1.青稞白粉菌(Blumeria graminis f.sp.Hordei)，2.青稞根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)，3.小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum NRRL 5883)，4.西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)，5.稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)。图中+++：HD/CD值介于3-4；++：HD/CD值介于2-3；+：HD/CD值介于1–2；-：HD/CD值小于1。

由表2可知，9株对小麦赤霉病菌有拮抗效果，6株对西瓜枯萎病菌有拮抗作用，21株对稻瘟病菌有拮抗效果，其中SCAU-Z8菌株能够同时抑制青稞白粉菌和青稞根腐病菌2种病原菌，且对青稞白粉菌有较好的效果。

实施例4纤维素降解能力

将分离得到菌株接种到CMC培养基上，28℃培养3天，测定纤维素溶解圈的大小。不同菌株的溶解圈大小见表3。

表3青稞籽粒内生细菌纤维素酶活能力

由表3可知，68株菌中有23株具有纤维素降解酶活，纤维素降解圈大于2cm的菌株有12株，占分离总菌株的17.65％。其中菌株SCAU-Z8溶解圈为2.3±0.22cm。nd：notdetected，为该活性未检测到。

实施例5秸秆降解能力

基于实施例4中的结果，将具有纤维素降解酶活的菌株接种于装有15克水稻、玉米和青稞秸秆的250ml三角瓶中(内含150ml无机盐培养液)，28℃摇床培养3天(转速80r/min)，秸秆残渣于80℃烘干至恒重后称重，计算秸秆降解率，结果见表4。

表4青稞籽粒内生细菌秸秆降解率(％)

由表4可知，23株菌中有19株具有具有水稻秸秆降解能力，15株对玉米秸秆有降解能力，20株对青稞秸秆有降解能力。对3种秸秆均具有降级能力的菌株有11株。菌株SCAU-Z8对3种秸秆都表现出了降解效果。nd：not detected，为该活性未检测到。

实施例6无机磷降解能力

将分离得到菌株接种到PVK液体培养基中，28℃培养3天，测定无机磷溶解圈的大小。不同菌株的溶解圈大小见表5。

表5青稞根际土可培养真菌无机磷降解能力

由表5可知，68株菌中有14株具有降解无机磷的能力，占分离总菌株的20.59％。其中菌株SCAU-Z8溶解圈为2.7cm。nd：not detected，为该活性未检测到。

实施例7PGPR性能的盆栽验证

基于上述实例测定结果，将具有抗病促生功能的细菌SCAU-Z8和活化后接种于LB液体培养基中，37℃，160r/min的恒温摇床中培养，培养72h后，作为种子液以1:1比例接种LB液体培养基，然后于37℃，160r/min的恒温摇床中震荡培养108h，使活菌数达到10亿以上，取出备用。

将长势一致的玉米种植于花盆中，每个花盆中的土样为2.5kg，土壤为采集自拉萨市区的潮土。采用浇灌的方式将菌株SCAU-Z8菌剂接种于玉米根部。每一个星期重复加一次菌悬液，每次40ml，总共浇灌2次，以无菌水作对照(CK)。测定植株生长情况(如叶片数、茎粗、株高、最大叶宽、最大叶长、)，结果见表6和附图1。

表6菌株SCAU-Z8对玉米种子生长的影响

从表6和附图1，可以看出，根据IAA产量选择了SCAU-Z8做了盆栽实验(地点四川农业大学教学农场)，用菌处理的植株较CK有明显效果，具体各方面数据见表6。SCAU-Z8的叶片数与CK相比增加了26.6％；SCAU-Z8的茎粗与CK相比增加了77.14％；SCAU-Z8的株高与CK相比增加了26.60％；SCAU-Z8的最大叶长与CK相比分增加了19.78％；SCAU-Z8的最大叶宽与CK相比增加了45.78％。

实施例8盆栽验证菌株SCAU-Z8对土壤磷素形态的影响

基于上述实施例6的盆栽试验，在观察植株农艺性状数据的基础上，采集玉米根围土壤，分级测定土壤不同形态无机磷含量，结果见表7。

表7菌株SCAU-Z8对土壤无机磷形态的影响(mg/kg)

注：Al-P：铝磷；Fe-P：铁磷；Ca-P：钙磷；O-P：闭蓄态磷。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

从表7可以看出，添加菌株SCAU-Z8对土壤不同形态无机磷含量均产生明显影响，SCAU-Z8可以明显活化土壤无机磷，增加土壤有效磷含量，其中对Fe-P和O-P活化效果最好，Ca-P的活化效果最弱。

综上所述，本发明综合评价青稞根际土真菌的产IAA能力、抗植物病原真菌特性、加速作物秸秆降解、促进植物生长以及活化土壤无机磷，选择出了菌株SCAU-Z8来申请菌株专利。SCAU-Z8菌株可以促进植物的生长，抑制植物病原真菌，降解作物秸秆，提高玉米的叶片数、茎粗、株高、最大叶宽和最大叶长，活化土壤不同形态无机磷。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种枯草芽孢杆菌SCAU-Z8及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1449

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

gatgcgagtg ctataatgca agtcgagcgg acagatggga gcttgctccc tgatgttagc 60

ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa ctccgggaaa 120

ccggggctaa taccggatgc ttgtttgaac cgcatggttc aaacataaaa ggtggcttcg 180

gctaccactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca 240

aggcaacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc 300

ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga 360

gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac 420

aagtaccgtt cgaatagggc ggtaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact 480

acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta 540

aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg 600

tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt 660

gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg 720

acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 780

taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt 840

aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900

cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct 960

tgacatcctc tgacaatcct agagatagga cgtccccttc gggggcagag tgacaggtgg 1020

tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080

cccttgatct tagttgccag cattcagttg ggcactctaa ggtgactgcc ggtgacaaac 1140

cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt 1200

gctacaatgg acagaacaaa gggcagcgaa accgcgaggt taagccaatc ccacaaatct 1260

gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agctggaatc gctagtaatc 1320

gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1380

acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt taggagccag ccgccgaagg 1440

tgacagagg 1449

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (6)

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SCAU-Z8，其特征在于，该菌株已于2020年12月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020836。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌SCAU-Z8在防治青稞白粉菌(Blumeria graminisf.sp.Hordei)和青稞根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)引起的植物病害中的应用。

3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌SCAU-Z8在制备防治作物病害的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，防治青稞白粉菌(Blumeria graminisf.sp.Hordei)和青稞根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)引起的植物病害。

5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌SCAU-Z8在作为制备植物生长调节剂中的应用。

6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌SCAU-Z8在降解纤维素和无机磷中的应用。

Images