CN108070541A - 一种促进植物生长的枯草芽孢杆菌sicau-pv1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进植物生长的枯草芽孢杆菌SICAU‑PV1及其应用。本发明公开的一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SICAU‑PV1，其保藏编号为CCTCC NO：M2017513，其16S rRNA基因序列为：SEQ ID NO:1。该菌株可以促进植物的生长，提高蜈蚣草的根数、根长、株高、叶片数量和叶面积，抑制植物病原真菌，降低土壤中的砷含量，在修复砷污染土壤方面具有良好的应用前景。

Description

一种促进植物生长的枯草芽孢杆菌SICAU-PV1及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种枯草芽孢杆菌菌株，具体具有根际促生特性、可用于修复砷污染土壤的枯草芽孢杆菌SICAU-PV1以及其用途。

背景技术

随着金属矿的开采和冶炼，砷产品的加工和使用，煤的燃烧，大量的砷排放到环境中，加重了土壤和水体中的砷污染。蜈蚣草(Pterisvittata)属凤尾蕨科孢子植物，是砷超富集植物。因其生长快、分布广、适应性强，且价格低廉，在砷污染土壤的植物修复中具有重要价值。

植物内生细菌是指定殖在植物体内但又不危害植物生长的细菌的统称。大量研究表明，抗重金属的内生细菌在超富集植物中普遍存在，这些内生菌不仅能促进植物生长，提高植物的生物量，还能促进超富集植物吸收积累重金属。因此，从内生菌中筛选活性高的重金属耐受内生菌株对于开展植物—微生物联合修复重金属污染具有重要意义。

发明内容

本发明针对有限技术提供一株分离自蜈蚣草植株的内生枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，该菌株可以促进植物的生长，抑制植物病原真菌，降低土壤中的砷含量，同时本发明还提供了该菌株在生物生长和降低土壤中的砷含量方面的应用。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明提供的一种促进植物生长的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SICAU-PV1，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期：2017年9月14日；保藏编号：CCTCC NO：M2017513。

本发明枯草芽孢杆菌SICAU-PV1的16S rRNA序列为：SEQ IDNO:1。

本发明从蜈蚣草根部分离得到的内生菌SICAU-PV1，菌落形状不规则，有皱褶，边缘波纹状，灰白色，革兰氏染色阳性，接触酶试验阳性，VP试验阳性，淀粉水解阳性，能在7％NaCl中生长，兼性厌氧。

本发明所述的枯草芽孢杆菌SICAU-PV1在生物有机肥料、与宿主植物联动修复砷污染土壤方面的应用，宿主植物为蕨类植物蜈蚣草。

本发明所述的枯草芽孢杆菌SICAU-PV1在植物病害生物防治中的应用，所述的植物病害为炭疽病菌和枯萎病菌引起的普遍性植物病害，所述的植物大田农作物包括水稻和小麦等。本发明还提供了所述的枯草芽孢杆菌在抑制大肠杆菌方面的应用。

本发明枯草芽孢杆菌SICAU-PV1作为制备防治大田作物病害的生物制剂方面的应用，通过常规的液体或固体培养，获得包括细菌培养物，通过常规的液体发酵生产，然后加入表面活性剂如分散剂、稳定剂、湿润剂、粘结剂、消泡剂、崩解剂、抗冻剂等中的一种或几种，或吸附载体按一定比例混合后，制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂或微乳剂；所述作物为水稻和玉米、小麦等。

本发明枯草芽孢杆菌SICAU-PV1防治农作物病害的方法也属于本发明的保护范围，该方法是在植物生长过程中进行灌根处理；所述灌根为该枯草芽孢杆菌SICAU-PV1的菌悬液或发酵液或代谢产物或制备的农药制剂。

本发明还提供了枯草芽孢杆菌SICAU-PV1在作为制备生物有机肥及土壤砷污染微生物修复菌剂中的应用，其中土壤修复剂为修复土壤中的砷污染。

本发明的有益效果为：

本发明提供的枯草芽孢杆菌SICAU-PV1具有较高的As(III)抗性，可以促进植物的生长，其IAA产量最高为103.3mg/L，同时对作物炭疽病菌、枯萎病菌和大肠杆菌有拮抗效果。该菌株作为作物的生物制剂材料，无论开发新的生物防治菌剂或者生长调节剂，或者在蜈蚣草修复砷污染土壤过程中作为配套菌剂方面，都具有很好的应用价值。

附图说明

图1是本发明基于蜈蚣草内生菌SICAU-PV1 16S rRNA基因的系统发育树；

图2是本发明菌株SICAU-PV1对蜈蚣草的影响其中；其中CK为不接种的蜈蚣草，PV1为接种的蜈蚣草；

图3是本发明蜈蚣草根系扫描图片；其中CK为不接种的蜈蚣草，SICAU-PV1为接种的蜈蚣草。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明技术方案作进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本发明的保护范围内。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1枯草芽孢杆菌SICAU-PV1的分离与鉴定

1.1蜈蚣草植株选择

本实施例蜈蚣草采自四川省汉源县富泉乡万顺铅锌矿区。随机采集多株生长良好的蜈蚣草，装入灭菌密封塑料袋，贴上标签，于冰盒中及时带回实验室，置于4℃冰箱保存。

1.2蜈蚣草耐砷内生细菌的分离

配置LB培养基、NA培养基。添加NaAsO₂使培养基中As含量为5mM。将5g蜈蚣草根系样品表面灭菌后转移至无菌研钵中充分辗碎后，研磨液涂抹于LB平板和NA平板上，30℃恒温培养4-5天。选取生长丰满形态不同的菌落进行划线纯化，从蜈蚣草样品中共分离得到47株耐砷细菌，如表1。

表1 47株分离菌株的编号

1.3枯草芽孢杆菌SICAU-PV1的鉴定

从蜈蚣草根部分离得到的内生菌SICAU-PV1，菌落形状不规则，有皱褶，边缘波纹状，灰白色，革兰氏染色阳性，接触酶试验阳性，VP试验阳性，淀粉水解阳性，能在7％NaCl中生长，兼性厌氧。琼脂糖凝胶电泳结果显示，该菌株16S rRNA基因扩增片段大小约为1300bp，测得的序列如SEQ ID No.1所示，16S rRNA基因的NCBI基因登录号为KY490124。

系统发育分析显示菌株SICAU-PV1与NCBI已收录的枯草芽孢杆菌MF062630和MF187639同源性均为100％(图1)，基于该菌的理化性质和16S rRNA基因系统发育树，可以确定该菌为枯草芽孢杆菌。

基于以上特征，将菌株SICAU-PV1鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株已于2017年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内)，保藏号为CCTCC NO：M2017513。

实施例2耐砷细菌的重金属抗性测定

分别配置终浓度为20mM的NaAsO₂、Pb(NO₃)₂、ZnSO₄·7H₂O、CdCl₂母液，灭菌后备用。添加母液至LB培养基中，调节为不同浓度梯度的As³⁺(6、8、10、15、20、25、30、36、42、48mM)，Pb²⁺(1、2、4、6、8、10、12mM)，Zn²⁺(1、2、4、6、8、10、12mM)，Cd²⁺(1、2、4、6、8、10、12mM)含量。将已分离菌株分别接于LB平板上，30℃培养24h，与菌株在不加重金属的LB固体培养基上的生长情况作对比，确定显著抑制细菌生长的重金属浓度。能够明显抑制细菌生长的最低重金属浓度为该菌株的MIC(minimal inhibitory concentration)值，具体结果见表2。

表2蜈蚣草根际可培养内生细菌的重金属最低抑制浓度(MIC)

结果显示，大部分菌株都具有较高的As(III)抗性，分布在MIC≥15mM、20mM、30mM、36mM、42mM、48mM的菌株数目依次为6、5、1、19、12、9，其中SICAU-PV1菌株的MIC值为48mM。

实施例3内生细菌产吲哚乙酸(IAA)测定

将上述分离得到的47株菌培养到对数期，取菌液50μl于含0.5g/L色氨酸的牛肉膏液体培养基中(约3mL)中，重复3次，28℃140r/min振荡培养1.5天，取50μl于洗净的白瓷板中，加100μL显色剂，25℃下避光30min，如果出现粉红色，表明产生IAA，以没有接菌的含0.5g/L色氨酸的牛肉膏液体培养基为对照。

将产吲哚乙酸的内生细菌继续在含0.5g/L色氨酸的牛肉膏液体培养基中培养24-48h后，8000r/min离心5min，取上清液2ml加入4mlSalkowski显色剂，25℃下避光30min后，530nm下测定吸光度值。以空白培养基作对照，并以IAA的标准样品对应的光密度做标准曲线，计算IAA的产量(mg/L)，不同菌株的IAA产生量见表3。

表3蜈蚣草根际可培养内生细菌产IAA能力

结果显示，分离的47株蜈蚣草内生菌的IAA产量在100mg/L及以上的有8株，其中SICAU-PV1菌株IAA产量最高，为103.3mg/L。

实施例4抗菌活性测定

采用平板对峙法测定分离菌株对黄瓜炭疽、西瓜枯萎和大肠杆菌3种指示菌的抑菌作用。测定抑菌圈直径(HD)与菌落直径(CD)，通过计算HD/CD的比值来筛选出有抑菌效果的菌株，具体如表4。

表4蜈蚣草根部内生细菌产IAA及抗病原菌能力

注：指示菌株：1：黄瓜炭疽病菌；2：西瓜枯萎病菌；3：大肠杆菌.+++：HD/CD值介于3-4；++：HD/CD值介于2-3；+：HD/CD值介于1–2；-：HD/CD值小于1.

结果显示，28株对黄瓜炭疽病菌有拮抗效果，32株对西瓜枯萎病菌，5株对大肠杆菌有拮抗效果，有四株菌能同时抑制上诉三种病原菌，其中SICAU-PV1菌株能够同时抑制3种病原菌。

实施例5蜈蚣草盆栽应用

利用本实验前期从蜈蚣草根部分离筛选获得的具有抗病促生功能的耐砷内生细菌SICAU-PV1活化后接种于LB肉汤培养液中，30℃，120r/min的恒温摇床中培养，培养36h后，作为种子液以1:1比例加入含有葡萄糖的LB肉汤培养基，30℃，120r/min的恒温摇床中培养36h使其活菌数达到10亿以上，取出备用。

将长势一致的蜈蚣草种植于花盆中，每个花盆中的土样为2.2kg。每一个花盆中加入亚砷酸钠，使土壤中砷含量为150mg/kg。采用浇灌的方式将SICAU-PV1菌剂接种于蜈蚣草根部。每一个月重复加一次菌悬液，总共浇灌4次，以无菌水作对照，测定植株生长情况(如蜈蚣草株高、蜈蚣草叶片总数、茎粗、鲜重、干重)，结果见图2和表5。

表5蜈蚣草生物量参数

从图1和表5可以看出，接种SICAU-PV1菌剂的蜈蚣草与空白对照相比，蜈蚣草的植株高度、茎粗、干鲜重、叶片数都出现了一定程度的增加。根系的总根长、根表面积、根平均直径都有一定程度的增加。说明本专利所得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SICAU-PV1对蜈蚣草有明显促生作用。

将蜈蚣草地上部与根系分离，用LA-S植物图像分析仪对根系进行洗根分析，得到扫描分析后的根系数据与图片(图3)。与对照组相比，添加SICAU-PV1菌剂处理组对蜈蚣草根系的总根长、根表面积、根平均直径都有一定程度的增加。

实施例6叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性测定

在实施例5的基础上，进行SOD活性测定和POD活性测定。

SOD酶液提取：称取蜈蚣草叶片0.25g放入研钵中，加入适量4℃pH 8.2的50mmol/L磷酸缓冲溶液，在冰浴中研磨成浆，过滤后将滤液在4000r/min下离心20min，取上清液为待测液。

POD酶液提取：称取蜈蚣草叶片0.2g，加5ml 20mmol/L的磷酸缓冲液，在研钵中研磨成匀浆，转入至试管中并以磷酸缓冲液定容到10mL，4000r/min离心10min，上清液为待测酶液。

SOD活性测定：将50mmol/L pH8.2的Tris-HCl-EDTA缓冲溶液、50mmol/L邻苯三酚溶液放在恒温水浴锅中(25℃)。待温度保持稳定后取3ml Tris-HCl-EDTA缓冲溶液，邻苯三酚溶液5μL加入试管中，摇匀后迅速测定其吸光度，波长325nm，每间隔30s测定一次吸光度。

POD活性测定：取200ml 0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)加入0.076ml愈创木酚搅拌溶解，冷却后加入0.112mL 30％的H₂O₂，混匀后保存于冰箱中备用。取3ml反应混合液并加入30μl酶液，以0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)为对照调零，波长470nm测定其OD值，每30s读取一次。蜈蚣草抗氧化酶活性测定结果如表6：

表6蜈蚣草抗氧化酶活性

分析的数据如表6所示，接种枯草芽孢杆菌SICAU-PV1菌剂处理组，蜈蚣草叶片抗氧化酶活性显著提高。

实施例7土壤理化分析

土壤理化性质如表7所示。使用菌株SICAU-PV1会改变土壤的理化性质。增加土壤的有机质、速效氮、有效磷、速效钾含量，降低土壤总砷含量。说明施加SICAU-PV1菌剂可以提高蜈蚣草对土壤砷污染的修复效果。

表7土壤理化性质分析

采用SPSS中的双变量相关性分析方法，结果如表8所示。其中蜈蚣草株高、叶片数、鲜重、干重、根平均直径与土壤中总砷显著负相关，即与蜈蚣草对砷的吸收量显著正相关。

表8土壤总砷与蜈蚣草各项生理指标相关性分析

注：*表示在5％的水平上差异显著。

综上所述，本发明综合评价了本株蜈蚣草中耐砷内生细菌的产IAA能力、重金属耐受能力、抗植物病原真菌特性、植物促生特点以及对土壤砷污染的修复效果。本发明显示菌株SICAU-PV1可以促进植物的生长，抑制植物病原真菌，提高蜈蚣草的根数、根长、株高、叶片数量和叶面积，降低土壤中的砷含量。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种促进植物生长的枯草芽孢杆菌SICAU-PV1及其应用

<141> 2017-12-05

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1035

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

atgacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcga actgattaga agcttgcttc 60

tatgacgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggcaa cctgcctgta agactgggat 120

aacttcggga aaccgaagct aataccggat aggatcttct ccttcatggg agatgattga 180

aagatggttt cggctatcac ttacagatgg gcccgcggtg cattagctag ttggtgaggt 240

aacggctcac caaggcaacg atgcatagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300

ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360

aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggcttt cgggtcgtaa aactctgttg 420

ttagggaaga acaagtacga gagtaactgc tcgtaccttg acggtaccta accagaaagc 480

cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tatccggaat 540

tattgggcgt aaagcgcgcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccacggctca 600

accgtggagg gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagagaaaag cggaattcca 660

cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cggctttttg 720

gtctgtaact gacgctgagg cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt 780

agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagagggt ttccgccctt tagtgctgca 840

gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat 900

tgacgggggc ccgcacaagc ggtggaacat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc 960

ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaactc tagagataga gcgttcccct tcgggggaca 1020

aagtgacggg tggtg 1035

Claims (10)

1.一种促进植物生长的枯草芽孢杆菌SICAU-PV1，其特征在于，该菌株已于2017年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017513。

2.根据权利要求1所述的一种促进植物生长的枯草芽孢杆菌SICAU-PV1，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌SICAU-PV1的16SrRNA序列为：SEQ ID NO:1。

3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌SICAU-PV1在生物有机肥料或与宿主植物联合修复砷污染土壤方面的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的宿主植物为蜈蚣草。

5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌SICAU-PV1在植物病害生物防治中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的植物物病害为炭疽病菌和枯萎病菌引起的植物病害。

7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌SICAU-PV1在作为制备防治作物病害的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的药物制成可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂或微乳剂。

9.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌SICAU-PV1在作为制备生物有机肥及土壤砷污染微生物修复菌剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的土壤污染修复为土壤砷污染修复。