CN104560797B - 分离获得的放线菌属细菌wzw03菌株及其在缓解西瓜连作障碍方面的应用 - Google Patents

分离获得的放线菌属细菌wzw03菌株及其在缓解西瓜连作障碍方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株分离获得的放线菌属细菌WZW03菌株及其在缓解西瓜连作障碍方面的应用，属于微生物技术领域。本发明的一株经分离获得的放线菌属细菌，命名为Plantibacter sp.WZW03，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCCNO.M 2014569。研究结果表明：本发明分离到的放线菌属细菌WZW03具有较强的解钾能力，在植物根际的定殖能力较好，能够有效缓解西瓜的连作障碍，促进西瓜根系生长，优化西瓜根系结构，因此，本发明提出的一株放线菌属细菌WZW03将在制备生物菌肥和缓解西瓜连作障碍方面具有良好的应用前景。

Description

分离获得的放线菌属细菌WZW03菌株及其在缓解西瓜连作障 碍方面的应用
技术领域
本发明涉及一株放线菌属细菌(Actinobacteria)及其在缓解西瓜连作障碍方面的应用。本发明属于微生物技术领域。
背景技术
我国的农业生产正在面临着既要实现高产优质还要保障环境友好的挑战，因此，以植物根际促生菌为主开发生物肥料已经成为研究热点(王志刚,徐伟慧,莫继先.东北黑土区大豆根际促生菌群落组成研究[J].中国生态农业学报,2012,20(5):592-596；KavinoM,Harish S,Kumar N.Effect of chitinolytic PGPR on growth,yield andphysiological attributes of banana(Musa spp.)under field conditions[J].ApplSoil Ecol,2010,45(2):71-77；康贻军,程洁,梅丽娟.植物根际促生菌作用机制研究进展[J].应用生态学报,2010,21(1):232-238)。
西瓜[Citrulluslanatus(Thunb.)Matsum.&Nakai]作为设施园艺的主要栽培作物之一，栽培面积不断扩大，连作障碍问题突显，其中土壤菌群与养分失衡是重要原因(朱盼盼,张显,任自力.不同施肥处理对连作西瓜土壤微生物区系的影响[J].北方园艺,2013,11:171-174；郝鲜俊,洪坚平,乔志伟.沼液对甘蓝连作土壤生物学性质的影响[J].应用与环境生物学报,2011,17(3):384-387)。西瓜是一种典型的喜钾作物，钾的供应量不仅直接影响西瓜的产量而且对西瓜的品质也起一定作用。硅酸盐细菌能够分解钾长石，磷灰石等不溶的硅铝酸盐的无机矿物(李凤汀,郝正然,杨则瑗.硅酸盐细菌HM8841菌株解钾作用的研究[J]，微生物学报，1997，37(1):79-81)，增加土壤中速效养分含量，促进作物生长发育，提高产量与品质(刘晓光,高克祥,康振生.生防菌诱导植物系统抗性及其生化和细胞学机制[J].应用生态学报,2007,18(8):1861-1868)，在农业生产中具有广泛的应用前景。
近年来，对硅酸盐细菌在各方面的研究与应用受到广泛关注，硅酸盐细菌肥料的实际应用也得到了积极的推动。硅酸盐细菌能够合成细胞分裂素和赤霉素类物质，亦能产生多粘杆菌素一类物质，对病原菌有一定抑制作用(党雯,郜春花,张强.解钾菌的研究进展及其在农业生产中的应用[J].山西农业科学,2014,42(8):921-924)。大量的田间应用试验表明，硅酸盐细菌能提供作物钾、磷等营养元素，并具有增产增收，改善品质，提高作物抗逆性，降低作物疾病指数等作用(连宾,傅平秋,莫德明.硅酸盐细菌的解钾作用机理的综合效应[J].矿物学报,2002,22(2):179-183；Mel'nikova E O,Avakyan Z A,Karavaiko G I,etal.Microbiological destruction of silicate minerals containing beryllium[J].Microbiologiya,1990,59(1):63-69)，且硅酸盐细菌分布广泛，对营养条件要求不高，易于规模培养，因而是一类良好的功能菌。
李海龙(李海龙.硅酸盐细菌的筛选、鉴定及作用效果的分析[D].陕西:西北农林科技大学硕士学位论文,2011)和Lin等(LinQM,RaoZH,SunYX,YaoJun.Identification andpractical application of silicate-dissolving bacteria[J].Agricultural sciencein China,2002,1(1):81-85)分离获得的硅酸盐细菌对植物的叶绿素含量、株高、茎粗、生物量和磷钾吸收能力均有显著提高，常文智等(常文智,马鸣超,陈慧君,李俊.胶质类芽胞杆菌对花生生长和土壤微生物学性状的影响[J].应用与环境生物学报,2014,20(2):185-191)的研究结果表明硅酸盐细菌不仅能提高作物产量，而且改善了土壤的生物学性状。
本发明分离并鉴定得到了一株放线菌属细菌，并研究了其对西瓜的促生效应。研究结果表明：本发明的一株放线菌属细菌具有较好的从钾长石分解释放出钾离子的能力，同时发现随着培养基中的细菌增多，培养基中钾离子浓度逐渐降低，说明该菌在生长过程中能够吸收大量的钾，推测该菌株具有较强的储存钾的能力，从而防止环境中的钾离子流失，具有典型的硅酸盐细菌的特性。通过盆栽试验，研究了该放线菌属细菌对连作西瓜生长和根系形态的影响，结果表明该菌株对连作西瓜植株具有明显的促生效应，本发明的提出为提高西瓜的产量和减缓连作障碍提供了一种新的技术手段。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株经分离获得的放线菌属细菌(Actinobacteria)，该细菌具有分解、吸收钾离子的能力，对连作西瓜植株具有明显的促生效应；
本发明的目的之二是提供所述分离获得的放线菌属细菌(Actinobacteria)在促进连作西瓜植株生长中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一株经分离获得的放线菌属细菌(Actinobacteria)，命名为Plantibacter sp.WZW03，分类命名为放线菌属细菌(Actinobacteria)，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其微生物保藏号是CCTCC NO.M 2014569，保藏日期为2014年11月18日。
本发明发明人从齐齐哈尔市多种禾本科和豆科植物的根际土壤的混合样中分离纯化得到一株具有分解、吸收钾离子的能力细菌，命名为Plantibacter sp.WZW03，经鉴定该细菌属于放线菌属细菌(Actinobacteria)。实验表明：该细菌在硅酸盐液体培养基中培养96h生物量达到最大，最高释放钾离子浓度为1.41mg/l，具有硅酸盐细菌的典型特性。在连作灭菌土中，分别施用30ml浓度为OD600＝0.5和OD600＝1的该细菌悬液的西瓜植株，地下部分干重分别比对照提高了18.6％和28.0％；根系长度分别比对照提高了62.2％和34.8％；根尖数分别比对照提高了39.0％和32.9％；根系直径在0-0.5mm范围内根长所占总根长的比例分别比对照提高了59.7％和55.0％。在未灭菌连作土中，分别施用30ml浓度为OD600＝0.5和OD600＝1的该细菌悬液的西瓜植株，地下部鲜重分别比对照提高了22.0％和90.9％，西瓜植株地下部分干重分别比对照提高了99.3％和215.9％，株高分别比对照提高了41.0％和12.1％，根系长度分别比对照提高了111.8％和33.6％，根体积分别比对照提高了200.0％和52.9％，根系直径在0-0.5mm范围内根长所占总根长的比例分别比对照提高了23.6％和16.4％。在灭菌和未灭菌的连作土壤中，Plantibacter sp.WZW03对西瓜均具有较好的促生效应，说明该菌株能够有效缓解西瓜的连作障碍，同时在土壤中具有较好的定殖能力，能够有效地发挥作用。
对菌株WZW03产吲哚乙酸(IAA)能力进行测定，结果表明Plantibactersp.WZW03菌株具有吲哚乙酸的合成能力，且合成量量较高，在培养8天时，达到32.98±1.1mg/L。
因此，进一步的，本发明还提出了以上所述的放线菌属细菌在促进连作西瓜生长、缓解西瓜连作障碍中的应用。
其中，所述的促进连作西瓜生长以及缓解西瓜连作障碍主要包括促进幼苗生长、促进连作西瓜根系生长、提高根长和须根数量等等。
综上所述，本发明分离到的Plantibacter sp.WZW03具有较强的解钾能力，在植物根际的定殖能力较好，能够有效缓解西瓜的连作障碍，促进西瓜根系生长，优化西瓜根系结构，在制备生物菌肥和缓解西瓜连作障碍方面具有较好的应用前景。
附图说明
图1为WZW03菌株的进化树分析结果；
图2为WZW03菌株的生长曲线与解钾曲线；
图3为WZW03菌株对连作西瓜根系形态的影响；
图4为WZW03菌株产吲哚乙酸(IAA)能力的测定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1菌株WZW03的分离纯化和鉴定
1、供试材料
所用土壤为齐齐哈尔市多种禾本科和豆科植物的根际土壤混合样，取土后立即进行分离纯化。
2、细菌的分离
植物根际混合土样经梯度稀释后，采用亚历山大罗夫培养基分离硅酸盐细菌，通过透明圈大小选择优势菌株，进行形态学、生理生化和16S rDNA序列分析对菌株进行鉴定(林先贵，土壤微生物研究原理与方法[M]，北京:高等教育出版社，2010:123-186；唐亮,张进忠,于萍萍，硅酸盐细菌的分离、纯化、鉴定及生物学特性研究[J].山东农业科学,2008(1):71-73；Clarridge JE 3rd.Impact of 16S rRNA gene sequence analysis foridentification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases[J].ClinMicrobiol Rev,2004,17(4):840-862)。采用火焰原子吸收光谱法测量在不同时间内液体培养基上清液中钾离子浓度。分离纯化得到的菌株，命名为Plantibacter spWZW03，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其微生物保藏号是CCTCC NO.M2014569，保藏日期为2014年11月18日，其16S rDNA序列由上海美吉生物医药科技有限公司测序。
3、数据分析
WZW03菌株的DNA测序结果在NCBI的Gen Bank数据库中进行Blast比对，然后采用MEGA5.2软件进行多序列同源性分析，并构建系统发育树(Bootstrap＝1000)。
采用Microsoft Excel(Office 2007)软件整理原始数据，采用SAS 9.0软件处理数据，方差分析使用ANOVA过程。
4、结果与分析
WZW03菌株16SrDNA同源性分析结果如图1所示。由图1可见，WZW03菌株与放线菌属细菌(Actinobacteria)的遗传进化距离最近，与放线菌属细菌S58的16SrDNA序列同源性达到99％，结合其菌体形态和菌落特征，将WZW03菌株鉴定为放线菌属细菌(Actinobacteria)。
实施例2菌株WZW03在促进连作西瓜植株生长中的应用
1、供试材料
菌株对西瓜的促生效应试验，所用土壤取自东北农业大学香坊农场连作5年的西瓜连作土，土壤的基本性质为：有机质含量372.45mg·kg-1，速效磷372.45mg·kg-1，速效钾134.00mg·kg-1，可溶性盐0.53ms·cm-1，全氮374.65mg·kg-1，全钾894.00mg·kg-1，pH6.12。供试西瓜品种为‘京欣1号’种子购买于北京多又奇科贸有限公司。
2、试验方法
2.1菌株WZW03的培养
采用亚历山大罗夫液体培养基(蔗糖5.0g,Na2HPO4 2.0g,MgSO4·7H2O 0.5g,FeCl3·6H2O 0.005g,CaCO3 0.1g,钾长石粉1.0g,水1000mL,pH值7.2)37℃，120r·min-1震荡培养24h后，6000r·min-1离心，用0.9％的无菌生理盐水清洗三次，重悬于无菌生理盐水，OD600分别调整至0.5和0.1，放于4度冰箱中保存备用。
2.2菌株WZW03在促进连作西瓜植株生长中的作用
西瓜种子用0.1％升汞消毒10min，用无菌水清洗5次，置于30℃条件下进行催芽，待西瓜胚根长至0.5cm时在育苗盘中播种，播种后置于人工智能气候培养箱中培养，人工智能气候培养箱设置为28℃/光照12h，18℃/黑暗12h，湿度60％。
西瓜子叶展平时，选取长势一致的幼苗，分别移入装有西瓜连作土和灭菌土的营养钵中(250ml)，移苗时分别浇灌浓度为OD600＝0.5、OD600＝1菌株WZW03的菌悬液30ml，连作土以浇灌蒸馏水为对照，灭菌土以浇灌无菌水为对照，处理编号见表1。西瓜幼苗生长期间，放在28℃/12h光照，18℃/12h黑暗的人工智能气候箱中培养，试验期间采用称重法分别对连作土和灭菌土中的幼苗浇灌蒸馏水和无菌水，待移苗后30d测量西瓜幼苗株高、茎粗、地上部和地下部干鲜重，并采用根系分析仪(LA-S2400)分析根系形态，每个处理3个平行。
表1 供试菌悬液编号
3、测定项目
3.1生长曲线的测定
WZW03的生长曲线的测定采用称干重法，利用电子天平每隔24h测量液体培养基离心后的沉淀质量。
3.2解钾能力的测定
将新培养的硅酸盐细菌WZW03的液体培养液每隔24h进行离心(5000r/min)15min后提取10ml上清液，利用火焰原子吸收光谱仪测定上清液中钾离子的浓度，以无菌的培养基作对照，在测定数值中减掉空白对照的钾离子含量，计为菌株的解钾浓度。
3.3西瓜生长指标的测定
1)植株高度和茎粗(mm)：分别用游标卡尺和直尺测量西瓜植株的茎粗和株高。
2)鲜重测定(g)：迅速剪取植物材料，装入已知重量的容器(或塑料袋)中，用分析天平称取鲜重。
3)干重测定(g)：提前把烘箱打开，温度升至100～105℃。把称过鲜重的植物材料装入纸袋中，放入烘箱内，100～105℃杀青10min，然后把烘箱的温度降到70～80℃左右，烘至恒重。取出纸袋和材料，放入干燥器中冷却至室温，称干重。
4)根系形态：采用根系分析仪(LA-S2400)扫描根系并分析根长度、根体积、根面积、根尖数和根系平均直径。
4、结果与分析
4.1菌株WZW03的生长与解钾曲线
菌株的生长曲线与解钾曲线如图2所示，竖条表示标准偏差(N＝3)。由图2可见在0-72h内菌株的生物量增加处于对数期，72-96h生物量增加趋缓进入稳定期；0-48h内随着细菌生物量的逐渐增加，在细菌的作用下分解释放出了钾离子浓度迅速提升，钾离子浓度最高达到1.41mg/l，在48-96h内液体培养基中的钾离子浓度随着菌株生物量升高有降低的趋势，可能是由于随着生物量的提升菌株的需钾总量增加，导致培养基内钾离子浓度降低。
4.2菌株WZW03对连作西瓜的促生效应
4.2.1菌株WZW03对连作西瓜幼苗生长的影响
菌株WZW03对连作西瓜幼苗生长的影响如表2所示：
表2 菌株WZW03对连作西瓜幼苗生长的影响(N＝3)
同列不同小写字母表示在0.05水平显著差异，统计结果采用平均值±标准差表示。
由表2可知，用D2处理的西瓜植株的地下部分鲜重与CK1相比无显著差异(P＜0.05)。D3处理的西瓜植株的地下部分鲜重与CK1相比显著高于CK1(P＜0.05)，比CK1提高了24.0％。D2和D3处理的西瓜植株的地下部分干重与CK1相比显著高于CK1(P＜0.05)，分别比CK1提高了18.6％和28.0％。D2处理的西瓜植株的茎粗与CK1相比无显著差异(P＜0.05)。D3处理的西瓜植株的茎粗与CK1相比显著低于CK1(P＜0.05)。D2处理的西瓜植株的株高与CK1相比显著高于CK1(P＜0.05)，比CK1提高了20.0％；D3处理的西瓜植株的株高与CK1相比无显著差异(P＜0.05)。D2处理的西瓜植株的地上部分鲜重与CK1无显著差异(P＜0.05)。D3处理的西瓜植株的地上部分鲜重与CK1相比显著高于CK1(P＜0.05)，比CK1提高了35.7％。D2和D3处理的西瓜植株的地上部分干重与CK1相比无显著差异(P＜0.05)。用D4和D5处理的西瓜植株地下部分鲜重与CK2相比显著高于CK2(P＜0.05)，分别比CK2提高了22.0％和90.9％。D4和D5处理的西瓜植株的地下部分干重与CK2相比显著高于(P＜0.05)，分别比CK2提高了99.3％和215.9％。D4和D5处理的西瓜植株的地上部分的鲜重与CK2相比显著低于CK2(P＜0.05)。D4和D5处理的西瓜植株的株高与CK2相比显著高于CK2(P＜0.05)，分别比CK2提高了41.0％和12.1％。D4和D5处理的西瓜植株的茎粗、地上部分的干重与CK2相比无显著差异(P＜0.05)。
4.2.2菌株WZW03对连作西瓜根系形态的影响
浇菌悬液30天后将西瓜幼苗的根系取出，用根系分析仪对西瓜幼苗进行扫描和拍照，菌株WZW03对连作西瓜根系形态的影响如图3所示。由图3可见，硅酸盐细菌施用后对连作西瓜根系的形态改变较为明显，主要体现在根长和须根数量方面，D2和D3与CK1相比根长显著增长、须根数增多；D4和D5与CK2相比根长显著增长、须根数增多，且低浓度处理(OD600＝0.5)的根系形态均优于高浓度处理(OD600＝1)的根系形态，具体结果见表3。
表3 硅酸盐细菌对连作西瓜根系特征的影响(N＝3)
同列不同小写字母表示在0.05水平显著差异，统计结果采用平均值±标准差。
由表3可知，用D2和D3处理的西瓜植株的根长与CK1相比显著高于CK1(P＜0.05)，分别比CK1提高了62.2％和34.8％。用D2和D3处理的西瓜植株的根体积、根表面积和根直径与CK1相比无显著差异(P＜0.05)。用D2和D3处理的西瓜植株的根尖数显著高于CK1(P＜0.05)，分别比CK1提高了39.0％和32.9％。
用D4和D5处理的西瓜植株的根长与CK2相比显著高于CK2(P＜0.05)，分别比CK2提高了111.8％和33.6％。用D4和D5处理的西瓜植株的根体积、根直径与CK2相比无显著差异(P＜0.05)，D4处理的西瓜植株的根表面积与CK2相比显著高于CK2(P＜0.05)，比CK2提高了56.4％。D5处理的西瓜植株的根表面积与CK2相比无显著差异(P＜0.05)。D4处理的西瓜植株的根尖数与CK2相比显著高于CK2(P＜0.05)，与CK2相比提高了35.1％。D5处理的西瓜植株的根尖数与CK2相比无显著差异(P＜0.05)。
4.2.3菌株WZW03对连作西瓜根系直径分级内根长百分比的影响
各处理中连作西瓜不同根系直径分级内根长百分比如表4所示：
表4 各处理中连作西瓜不同根系直径分级内根长百分比(％，N＝3)
同列不同小写字母表示在0.05水平显著差异，统计结果采用平均值±标准差。
由表4可知，D2和D3处理的西瓜植株，根系直径在0-0.5mm范围内根长所占总根长的比例显著高于CK1(P＜0.05)，分别比CK1增高了59.7％和55.0％，在0.5-1.0mm根系直径范围内根长所占总根长的比例显著低于CK1(P＜0.05)，在1.0-1.5mm、1.5-2.0mm、2.0-2.5mm、2.5-3.0mm、3.0-3.5mm、3.5-4.0mm、4.0-4.5mm范围内根长所占总根长的比例与CK1相比无显著差异(P＜0.05)。用D2和D3处理的西瓜植株的根系直径在0.5-1.0mm范围内根长所占总根长的比例显著低于CK1(P＜0.05)。用D4和D5处理的西瓜植株的根系直径在各个范围内根长所占总根长的比例与CK2相比均无显著差异(P＜0.05)。
以上结果表明，Plantibacter sp.WZW03无论在灭菌的连作土壤中还是在未灭菌的连作土壤中，对西瓜均具有较好的促生效应，说明该菌株能够有效缓解西瓜的连作障碍，同时在土壤中具有较好的定殖能力。
实施例3菌株WZW03产吲哚乙酸(IAA)能力的测定
吲哚乙酸(IAA)是一种植物体内普遍存在的内源生长素，属吲哚类化合物。双名茁长素、生长素、异生长素。在光和空气中易分解，不耐贮存，对人、畜安全。
吲哚乙酸具有广谱多用途的特点，它诱导番茄单性结实和坐果，在盛花期以3000毫克/升药液浸泡花，形成无籽番茄果，提高坐果率；促进插枝生要是它应用最早的一个方面。还可促进作物不定根的形成，加快营养繁殖速度，促进秧苗生根，增加甜菜等的块根产量和含糖量。
实验方法：
将Plantibacter sp.WZW03接种于含有L－色氨酸(200mg·L-1)的LB液体培养基中，37℃，180r·min-1摇床中分别培养2、4、6、8、10d。用分光光度法测定菌悬液的OD600值，然后于10000r·min-1下离心10min，取上清液加入等体积的Salkowski比色液，避光静置30min，测定其OD530值。计算菌浓度OD600值为1时，单位体积发酵液中IAA的含量(μg/ml)。
实验结果：
实验结果如图4所示，结果表明Plantibacter sp.WZW03菌株具有吲哚乙酸的合成能力，且合成量量较高，在培养8天时，达到32.98±1.1mg/L，从而证明该菌株具有良好的应用前景。

Claims (3)

1.一株经分离获得的放线菌属细菌(Actinobacteria)，命名为Plantibactersp.WZW03，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其微生物保藏号是CCTCCNO.M 2014569，保藏日期为2014年11月18日。
2.权利要求1所述的放线菌属细菌在促进连作西瓜生长、缓解西瓜连作障碍中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的促进连作西瓜生长以及缓解西瓜连作障碍包括促进幼苗生长、促进连作西瓜根系生长、提高根长和须根数量。
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