CN107904191B - 根瘤菌v2-2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了根瘤菌(Rhizobium fabae)V2‑2及其应用，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017609。本发明的根瘤菌V2‑2是一株共生固氮能力强，对四川光叶紫花苕子增产明显，兼具有分泌IAA能力、具有溶有机磷、溶钾能力、抗逆性强的优良紫花苕子根瘤菌菌株。在不施氮肥、接种V2‑2使紫花苕子鲜草产量增产23.8％以上，鲜根产量增产128.8％。

Description

根瘤菌V2-2及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及根瘤菌V2-2及其应用。

背景技术

紫花苕子(Vicia villosaL.)是中国水稻区主要的豆科绿肥作物，是用作绿肥兼饲草栽培的主要苕子品种，是优质的有机肥(付云章，2017；曹卫东等，2010)。它具有茎汁柔嫩、叶量多、产量高、适口性好、营养丰富等特点，是优质的青绿饲料，也是精饲料的良好替代品和配合饲料原料，深受四川、云南、贵州等养殖业农民的喜爱(郭太雷，2013；施万青，2016)。紫花苕子在种植过程中一般施用化肥达到增加产量的目的，研究发现越西县农民在种植紫花苕子每亩施用农家土杂肥300kg、磷肥10kg能达到稳产增产的目的(王德猛，2006)。但化肥施用存在生产成本高、利用率低、污染生态环境等问题。而豆科作物因与根瘤菌共生固氮特性在生产过程中可以不施用化肥仅用高效根瘤菌接种就能达到作物增产。例如巴西种植大豆不施氮肥只接种有效根瘤菌，产量与每公顷施400kg化肥的相当，每年节约的氮肥价值达25亿美元。美国通过接种根瘤菌，每年生物固氮量约为620万t，占美国当年消耗氮肥总量的55％以上。因此，人工接种根瘤菌是促进豆科植物生长、提高豆科作物产量，改善生态环境的一项重要农业措施。

目前关于高效根瘤菌筛选应用研究多集中于大豆等经济价值较高的豆科作物中，应用于紫花苕子高效根瘤菌的研究报道很少。中国科学院南京土壤研究所根瘤菌组(1974)1971年和1973年间在江苏省进行了苕子根瘤菌优良菌株的筛选，从分离出的162株根瘤菌中筛选出7株生长快、结瘤早、固氮能力强的7株根瘤菌株；1972年9月在江苏铜山县张集公社进行了苕子接种根瘤菌试验，发现同等施肥条件下接种苕子根瘤菌能提高苕子初蕾期的鲜草产量，增产6.2％-39.1％。但根瘤菌的群体分布具有地理局限性，在高效根瘤菌的筛选中，需要注意根瘤菌对应用地区环境的适应能力(陈文新等，2004)。一般来说，在某个区域内最为有效的根瘤菌往往来自本地区或者与本地区条件相似地区的菌株(Jiaetal，2008；陈文新等，2011)。目前适合四川生态环境高效紫花苕子根瘤菌的研究几乎是空白。

现有研究表明极少数根瘤菌还具有溶磷、分泌生长激素(IAA)等促生特性。师尚礼(2007)等对730余株苜蓿根瘤菌进行研究初筛到29株具有较好促生能力的根瘤菌，仅从这29株根瘤菌筛选到10株分泌IAA能力强的根瘤菌，对这29株菌进行溶解有机磷和无机磷能力的测定，发现全部菌株没有溶解无机磷的能力，这29个苜蓿根瘤菌都能够溶解有机磷，但溶磷能力差异较大，仅8个菌株有较强的溶解有机磷的能力，其余菌株有弱或微弱的溶有机磷的能力。

由此可见，根瘤菌的实际使用效果与豆科植物的种类和豆科植物的生长地区环境密切相关，在一种豆科植物上效果好的根瘤菌在另一种豆科植物上效果未必就很好，在某地效果好的根瘤菌在另外的地域效果未必好。

因此筛选适合特定地域和特定植物的优质高效多功能促生根瘤菌株尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种适应四川地区紫花苕子种植的优质高效的根瘤菌。

本发明的技术方案为：根瘤菌(Rhizobium fabae)V2-2，于2017年10月23日保藏于中国湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2017609。

根瘤菌(Rhizobium fabae)V2-2在四川地区光叶紫花苕子种植上的应用。

本发明从野生紫花苕子根瘤中分离和纯化根瘤菌，选择具有典型的根瘤菌菌落特点，革兰氏染色结果为细胞呈小杆状、革兰氏阴性的菌株。

对初选菌株用光叶紫花苕子品种进行水培回接试验，筛选出能结瘤且结瘤能力强、共生固氮效果好的菌株为目标根瘤菌V2-2。相比于不接种根瘤菌，紫花苕子植株干重提高42.7％。

对根瘤菌V2-2提取总DNA，对多个持家基因进行测序，构建系统发育树，明确目标菌株根瘤菌V2-2的分类地位。表明根瘤菌V2-2属于Rhizobium fabae。

根瘤菌V2-2进行耐酸碱、耐盐、生长温度范围等抗逆性试验，以及分泌IAA能力、溶磷能力的促生性试验，及田间接种试验。结果表明：根瘤菌V2-2耐酸碱能力较强，能在pH4～11的平板上生长，但过酸或过碱的平板上菌落直径小于pH7的阳性对照，说明过酸过碱对其生长有一定的抑制作用；耐盐能力也较强，在NaCl 0.2％-4％的YMA平板均能生长；生长温度范围较广，能在20～28℃温度范围内生长。根瘤菌V2-2分泌IAA 6.43mg/L，表明根瘤菌V2-2兼具分泌IAA的能力。根瘤菌V2-2对有机磷源物质和磷酸钙具有一定的溶解能力，在磷酸铝与磷酸铁培养基上不生长。卵磷脂、磷酸钙平板上测定的溶磷圈直径与菌落直径比值分别为1.3、1.03，表明根瘤菌V2-2具有一定溶有机磷和溶磷酸钙的能力。根瘤菌V2-2溶解钾2.08mg/L，表明根瘤菌V2-2兼具溶钾的能力。田间接种表明接种根瘤菌V2-2相比于不接种根瘤菌，能使紫花苕子的鲜草产量增产23.8％，鲜根产量增产128.8％。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的根瘤菌V2-2是一株共生固氮能力强，对四川紫花苕子增产明显，兼具有分泌IAA能力、具有溶有机磷、溶钾能力、抗逆性强的优良紫花苕子根瘤菌菌株。在不施氮肥、接种V2-2使紫花苕子鲜草产量增产23.8％以上。

保藏说明：

根瘤菌(Rhizobium fabae)V2-2，于2017年10月23日保藏于中国湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2017609。

附图说明

图1为根瘤菌V2-2在YMA培养基上的菌落形态；

图2为根瘤菌V2-2的16 rRNA基因序列的系统发育图；

图3为根瘤菌V2-2的recA、atpD、glnII三个持家基因联合构建的系统发育图。

具体实施方式

实施例1根瘤菌V2-2的分离、纯化和保存

从四川省成都市蒲江县复兴镇采集的野生紫花苕子中，选择健壮植株主根上大且饱满红色根瘤，根瘤洗净，带部分根皮采下，进行表面消毒：用乙醇(95％)浸泡5min左右，倒掉，再用升汞(0.1％)浸泡5min左右，最后用无菌水冲洗6-8次。在超净工作台内将根瘤放入灭菌后的白瓷板上，用竹签夹破根瘤涂抹在YMA培养基的平板上，进行划线纯化，在28℃的恒温箱中培养。YMA培养基配方：KH₂PO₄ 0.25g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CaCl₂·6H₂O 0.1g，NaCl0.1g，钼酸铵(1％)2mL，硼酸(1％)2mL，刚果红(1％)2.5mL，甘露醇10g，酵母粉0.8g，琼脂18～20g，水1000mL，pH6.8-7.0。

待平板长出菌落后，从平板上挑选形态上像根瘤菌的不吸红单菌落在平板上进行稀释划线培养。3d左右观察菌落形态，一直观察到10d左右，因慢生根瘤菌需6～10d出现菌落。稀释划线平板分离法进行纯化。初步判定菌落是否为根瘤菌则根据以下两方面进行：(1)YMA培养基上的菌落形态：乳白色、不吸红、菌落圆形、隆起、边缘整齐不蔓延、表面光滑、较湿润、较粘稠。培养3d～5d长出菌落的为快生根瘤菌，培养6d～10d长出菌落的为慢生根瘤菌。(2)细胞形态：对确认的根瘤菌菌落作标记，制片进行革兰氏染色，根瘤菌的镜检结果为细胞呈小杆状且形态一致，无芽孢，细胞内常含β-羟基丁酸而呈环节状，革兰氏阴性(G^-)。如果上述标记菌落具有上述两方面特征，则将该菌落接入YMA培养基的试管斜面培养保存。

本实施例的分离纯化得到的菌株V2-2为快生根瘤菌，在加刚果红的YMA培养基上培养，菌体不吸红，乳白色、菌落较小、圆形、粘稠、隆起度较高、稍透明，2-3d长出菌落。经革兰氏染色镜检为G^-，呈小杆状。

实施例2根瘤菌的回接试验

根瘤菌的回接试验用砂培法，试验中用的紫花苕子品种是光叶紫花苕子，购于成都绿草园种业有限责任公司。在光照室(控温22～24℃，光照强度2800勒克斯左右，日照时间14h)进行，种植46d收获。定期补充灭菌无氮营养液，将根瘤菌V2-2接种到砂培器中，砂培器采用300mL的塑料杯，基质选用蛭石，以不接种根瘤菌V2-2的同品种植株为对照CK，各处理均重复三次。收获后用紫花苕子植株的根瘤数及植株干重来评价根瘤菌V2-2的接种效果。

(1)菌液培养：将根瘤菌V2-2接种于YMA液体培养基中，放置摇床上用120rpm/min转速，28℃培养至对数生长期(约3d左右)。

(2)种子的催芽：选择粒大、饱满的无损伤的紫花苕子种子，用95％酒精浸5min，倒去酒精，加入升汞(0.1％)浸泡表面消毒5min。最后用无菌水清洗6～8次，每次5min。最后将种子撒在灭菌后的木屑里进行催芽，催芽温度28℃，待主根长到2～3cm左右，须根未长出时播种。

(3)砂培器的制作：选用300mL的塑料杯作砂培器，先将灭菌后的蛭石加入灭菌过的塑料杯中体积占整个杯子的3/4，再加入无菌无氮营养液保持蛭石湿润即可，塑料杯和蛭石分别灭菌，选择粒径为2-4mm的石英砂铺面用来隔断霉菌污染，石英砂也需灭菌。

(4)无氮营养液配方：0.46g硫酸钙，0.136g磷酸氢二钾，0.075g氯化钾，0.075g柠檬酸铁，0.06g硫酸镁，0.03g硝酸钙，1000mL蒸馏水，1mL微量元素溶液。

(5)微量元素溶液配方：2.86g硼酸，1.81g硫酸锰，，0.8g硫酸铜，0.22g硫酸锌，0.02g钼酸加蒸馏水至1000mL。

(6)种植及测定指标：将催芽种子栽入装好蛭石的塑料杯中，用移液枪吸取菌液2mL轻轻打在紫花苕子根部附近。另设不接种处理的同品种植株为对照(CK)。种植时先种CK避免接菌污染。各处理重复3次。水培试验结果列于表1。

表1结果表明，根瘤菌V2-2与供试光叶紫花苕子表现出较好的结瘤能力；与不接种根瘤菌V2-2的对照相比，V2-2能提高光叶紫花苕子的植株干重，比不接种根瘤菌的对照提高42.7％。可见，根瘤菌V2-2是与光叶紫花苕子匹配好的优良高效菌株。

表1 根瘤菌V2-2的水培试验结果

注：数据为三次重复的平均值

实施例3根瘤菌V2-2的抗逆能力

对根瘤菌V2-2的抗逆能力主要进行了耐盐、耐酸碱的测定。以YMA培养基为基础培养基，均以pH7、28℃培养7d的YMA平板为阳性对照(CK)。将上述的根瘤菌V2-2的YMA斜面培养物用无菌水刮洗制作为菌悬液待用。采用点接种方法，每个处理重复3次。耐酸碱、耐盐试验、适宜生长温度范围测定的平板均在28℃培养4d后观察记载结果。

(1)耐酸碱测定用培养基配方：以YMA培养基为基础培养基，用HC1和NaOH调节pH值，使培养基的pH值依次为4.0、5.0、6.0、8.0、9.0、10.0、11.0。

(2)耐盐性测定用培养基配方：以除去NaCl的YMA培养基为基础培养基，设定NaCl的浓度，使培养基的NaCl0.2％、0.5％、1.0％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％和4％。

试验结果表明根瘤菌V2-2耐酸碱能力较强，能在pH4～11的平板上生长，但过酸或过碱的平板上菌落直径小于pH7的阳性对照，说明过酸过碱对其生长有一定的抑制作用；耐盐能力也较强，在NaCl 0.2％-4％的YMA平板均能生长。

实施例4根瘤菌V2-2的促生能力

所述的根瘤菌V2-2的促生能力主要考察了分泌植物生长素(IAA)、溶磷能力。

(1)分泌植物生长素能力的测定

采用比色法测定根瘤菌分泌植物生长素(IAA)的能力，测定培养基采用改良的刚果红液体培养基，培养基组成：10g甘露醇、1g酵母膏、1g NH₄NO₃、0.5g K₂HPO₄·3H₂O、0.2gMgSO₄·7H₂O、0.1g NaCl、10mL刚果红(0.25％)、100mg L-色氨酸、1000mL蒸馏水、pH＝7.0。比色液配方：0.5M FeCl₃1mL、浓H₂SO₄ 30mL、蒸馏水50mL。

将菌株接种于盛有50mL培养基的三角瓶中，置于转速160rpm/min，温度28℃的摇床培养，3次重复，培养7d后，8000rpm/min离心10min，取菌液10mL，加入10mL比色液，避光30min后在紫外分光光度计上选择波长530nm测定OD值。根据标曲换算IAA含量。标曲的制作：用IAA储备液配成0、5、10、20、40mg/L的系列标准液作工作液。比色结果测定，根瘤菌V2-2分泌IAA 6.43mg/L，表明根瘤菌V2-2兼具分泌IAA的能力。

(2)溶有机磷和无机磷的能力

选用溶磷圈法测定菌株溶有机磷和无机磷的能力。有机磷源为卵磷脂，无机磷源为Ca₃(PO₄)₂、AlPO₄·2H₂O、FePO₄·2H₂O，以上试剂均为市售分析纯试剂。将蒙金娜培养基和PKO培养基制好平板，菌种制备及点接种方法同实施例3抗逆性试验，各处理重复3次。在28℃培养箱里培养7d后观察菌株是否生长及是否有溶磷圈出现。

①溶解有机磷能力的培养基用蒙金娜培养基配方(g/L)：10g葡萄糖，5g CaCO₃，0.5g (NH₄)₂SO₄，0.4g酵母粉，0.3g KCl，0.2g卵磷脂，0.3g NaCl，0.03g MnSO₄·4H₂O，0.03gFeSO₄·7H₂O，20g琼脂，1000mL蒸馏水，pH值6.8～7.0。其中卵磷脂用75％酒精加热溶解，单独灭菌，与灭菌冷却至60℃左右的培养基混合后倒平板。

②溶解无机磷能力的培养基用PKO培养基配方(g/L)：10g葡萄糖，3.0g上述无机磷源物质(Ca₃(PO₄)₂、AlPO₄·2H₂O、FePO₄·2H₂O)，0.5g(NH₄)₂SO₄，0.2g KCl，0.2g NaCl，0.03gMnSO₄，0.03g MgSO₄·7H₂O，0.003g FeSO₄·7H₂O，0.5g酵母粉，20g琼脂，1000mL蒸馏水，pH值6.8～7.0。其中磷酸钙、磷酸铝、磷酸铁用研钵碾碎过300目筛并单独干热灭菌后，与灭菌温度降至60℃左右的培养基混合倒平板。

结果表明根瘤菌V2-2对有机磷源物质和磷酸钙具有一定的溶解能力，在磷酸铝与磷酸铁培养基上不生长。卵磷脂、磷酸钙平板上测定的溶磷圈直径与菌落直径比值分别为1.3、1.03，表明根瘤菌V2-2具有一定溶有机磷和溶磷酸钙的能力。

(3)溶钾的能力

用火焰光度法测定溶钾能力。钾源选择水洗钾长石矿粉(300目)。无钾培养液(1L)：蔗糖10g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.1g，酵母膏0.5g，pH7.2-7.4。

使用250mL三角瓶做摇瓶，装入无钾基础液体培养基100mL，添加钾长石矿粉(800目)0.5g，接种5mLV2-2的菌悬液，对照接等量无菌水，设置3个重复，28℃160rpm/min培养7d，取10mL培养液，8000r/min离心10min，取上清液，用火焰光度计法测上清液中可溶性钾的含量。根瘤菌V2-2溶解钾2.08mg/L，表明根瘤菌V2-2兼具溶钾的能力。

实施例5根瘤菌V2-2的16S rRNA基因及其他持家基因recA、glnII、atpD的扩增及系统发育分析

提取菌株V2-2的总DNA，用表2所示引物分别对16S rRNA基因和recA、glnII、atpD这三个持家基因进行PCR扩增，PCR反应用Bio-RAD MyCyclerTM仪器，PCR扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳上检测后，送到成都擎科梓熙生物技术有限公司进行序列的测定。用软件DNAman 6.0进行基因序列相似度的计算。

表2 本试验中所用PCR引物

注：Y＝C or T,H＝A,C or T,R＝A or G,S＝C or G,K＝G or T,N＝A,C,G or T,I＝inosine,M＝A or C,N＝any base.

(1)16S rRNA基因的扩增及系统发育树的构建

以总DNA为模板，用表2中16S rRNA基因通用引物P1和P6进行扩增。PCR反应体系(50μl)包括2×PCR Mix 25μl，引物P1和P6(10μM)各1μl，DNA模板1μl，加超纯水补足至50μl。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃最终延伸10min。扩增产物按上述方法检测后成都擎科梓熙生物技术有限公司测序的结果如SEQID No.1。

将所得的序列结果在EzTaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)进行比对，发现与根瘤菌V2-2的16S rRNA基因序列相似度最高的模式菌株是Rhizobiumfabae CCBAU33202^T，相似度为99.74％。运用序列在EzTaxon上比对的结果，选择相似度高的模式菌株6株作为参比菌株，构建系统发育树。用Mega7软件中的邻接法(Neighbor-joining)进行16SrRNA基因系统发育树的构建，自展值(bootstrap)1000，其系统发育树见图2。

(2)多位点基因序列的联合系统发育树的构建

为进一步更准确地确定根瘤菌V2-2的分类地位，另选择3个位点的持家基因recA、glnII和atpD序列进行联合系统发育树的构建。

扩增recA用引物recAF2、recAR2，glnII用引物GSII-5和GSII-6，atpD用引物atpDF1和atpDR，引物序列如表2所示。反应体系为30μl，反应液组成如下：反应体系(30μl)为：2×PCR Mix 15μl；10mM的正向引物和反向引物各0.5μl；DNA模板1μl；ddH₂O 13μl。(1)recA扩增条件：95℃预变性3min；95℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次；72℃最终延伸2min。(2)glnII扩增条件：95℃预变性3min；95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次；72℃最终延伸7min。(3)atpD的PCR扩增反应程序相同：95℃预变性5min；94℃变性45s，57.5℃退火1min，74℃延伸1.5min，循环30次；74℃最终延伸5min。

扩增产物按上述方法扩增检测后送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，对每个基因进行两向测序(正、反引物的序列)，然后将正、反引物序列用DNAman 6.0软件拼接，去掉正、反引物的序列后分别获得atpD序列大小为496nt、序列结果如SEQID No.2，glnII序列大小为637nt、序列结果如SEQID No.3，recA序列大小为493nt、序列结果如SEQID No.4。

将所得的序列结果在美国国立生物信息中心(NCBI)进行比对，发现与根瘤菌V2-2的atpD、glnII和recA三个位点持家基因的序列相似度最高的模式菌株均是Rhizobiumfabae CCBAU 33202^T，与该模式菌株的相似度分别为99.56％、99.67％、100％。应用每个基因序列在NCBI上比对结果，选择与3个基因相似度高的模式菌株作为建树的参比菌株。

3个基因(atpD、glnII和recA)联合系统发育树的构建：先将atpD、glnII、recA 3个持家基因的序列分别与参比菌株的相应基因序列，用MEGA7比对，以最小长度为标准剪齐，将剪齐后的序列保存为FASTA格式，剪齐后三个基因序列长度分别为350nt、460nt、342nt，用WORD打开将3个序列拼接在一起，用MEGA7软件中的邻接法(Neighbor-joining)进行联合系统发育树的构建，自展值(bootstrap)1000，atpD、glnII、recA联合系统发育树如图3所示。

图2和图3显示，V2-2的16S rRNA基因，以及atpD、glnII、recA 3个持家基因联合序列与模式菌株Rhizobium fabae CCBAU 33202^T在同一分支节点上。又如前分析，所述菌株与该模式菌株Rhizobium fabae CCBAU 33202^T的这4个基因的相似度很高，atpD、glnII、recA的相似度分别为99.56％、99.67％、100％，表明菌株V2-2属于Rhizobium fabae。

实施例6田间接种效果

所述菌株的田间接种效果试验选择四川崇州市桤泉镇四川农业大学现代农业基地进行。

本试验共设两个处理，接种根瘤菌V2-2和不接种对照处理(CK)，豆种选择四川紫花苕子主栽品种“光叶紫花苕子”，未施用任何化学肥料和有机肥。采用田间随机区组排列。试验于2016年9月30日～2017年4月22日进行。将制备好的根瘤菌V2-2菌剂(活菌数2.1×10⁸CFU/g菌剂)与紫花苕子拌种，阴干后撒播。小区面积7m²，播种时先播CK，以避免CK处理受接种根瘤菌的影响。在植株盛花期(生育期204d)采样，测定植株根瘤数、地上部分植株鲜重、地下部分根鲜重、鲜草产量。期间的管理按农户种植紫花苕子的常规管理执行。

表3 紫花苕子接种根瘤菌V2-2的田间接种效果

注：数据为三次重复的平均值

接种根瘤菌V2-2的处理，在盛花期的有效瘤数、总根瘤数、鲜草产量均比不接种对照高，鲜草产量增加23.8％。鲜根产量比CK增产128.8％。可见，接种的优良根瘤菌对紫花苕子产量增产作用明显。所述根瘤菌V2-2是适合四川光叶紫花苕子生产的优良根瘤菌。

在四川崇州市桤泉镇的田间接种试验研究发现，接种根瘤菌V2-2后，植株有效瘤数、总根瘤数和鲜草产量均高于不接种对照，鲜草产量增产23.8％，鲜根产量高于不接种对照处理，增产128.8％，地上地下部分生物量的增加说明根瘤菌V2-2促进了紫花苕子的生长。可见，本发明分离获得的根瘤菌V2-2可以用于四川紫花苕子生产中大面积的推广应用。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (2)

1.根瘤菌Rhizobium fabae V2-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M 2017609。

2.权利要求1所述的根瘤菌Rhizobium fabae V2-2在四川地区光叶紫花苕子种植上的应用。

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