CN105802898A - 一种解淀粉芽孢杆菌菌株及生物有机肥 - Google Patents

一种解淀粉芽孢杆菌菌株及生物有机肥 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物肥料技术领域，特别涉及一种解淀粉芽孢杆菌菌株及生物有机肥。该解淀粉芽孢杆菌菌株的保藏编号为CGMCC No.12335。将保藏编号为CGMCC No.12335的解淀粉芽孢杆菌菌株加入到生物有机肥中，能够改善作物根系微生物群落结构，增加土壤中微生物数量，能够改良土壤结构，防止土壤板结，能够有效改善土壤酸化，提高种植作物的产量，增强作物抗病虫害能力。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌菌株及生物有机肥
技术领域
本发明涉及生物肥料技术领域，特别涉及一种解淀粉芽孢杆菌菌株及生物有机肥。
背景技术
随着我国农业的快速发展，化学肥料的施用逐渐增加，大量的施用化学肥料已对我国的环境质量、食物安全、公众健康和生态系统构成了严重威胁。大量施用化肥，造成土壤有机质下降，进一步影响了土壤中微生物的生存和繁殖。长期使用单一化学肥料不仅会造成了土壤中营养元素失衡，而且会提高土壤的酸性，造成土壤酸化，从而影响农作物的生产，使作物的产量下降、品质降低。同时，化学肥料的过量使用会使土壤的原有结构遭到破坏，导致土壤板结，不利于作物生长，导致作物生长缓慢。
生物有机肥是指特定功能微生物与主要以动植物残体(如畜禽粪便、农作物秸秆等)为来源并经无害化处理、腐熟的有机物料复合而成的一类兼具微生物肥料和有机肥效应的肥料。生物有机肥含有全面平衡的营养元素，能为作物提供生长所需的营养，促进作物生长。生物有机肥中富含有机质，施用生物有机肥能够增加土壤有机质，改善土壤结构，降低土壤容重，解决土壤酸化。同时，生物有机肥的施用能显著地提高土壤中各类微生物的数量，土壤微生物分泌的物质可以改善土壤理化性质，提高植株抗病虫害的能力，促进植株健康生长。
申请号为201310045294.5的中国专利中公开了一种生物有机肥，其制备方法为：将米糠、豆粕、花生麸和豆渣按比例混合均匀得混合物料，将混合物料平铺，用肌苷母液营养液浸泡平铺后的混合物料，添加酵母菌，于50～60℃下发酵，发酵过程中进行翻堆处理；发酵完成后，将混合物料的温度降至26～30℃，加入微生物营养液，微生物营养液中的微生物在混合物料中繁殖10～20天，得到生物有机肥，微生物营养液中含有解磷菌0.1～0.3亿cuf/ml、解钾菌0.1～0.3亿cuf/ml和固氮菌0.1～0.3亿cuf/ml。该生物有机肥肥效好，可有效促进蔬菜的生长，增产作用明显。虽然该生物有机肥的增产效果较好，但在改善土壤结构方面并不占优势。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌菌株及生物有机肥。将该解淀粉芽孢杆菌菌株加入到生物有机肥中，能够改善作物根系微生物群落结构，增加土壤中微生物数量，能够改良土壤结构，防止土壤板结，能够有效改善土壤酸化，提高种植作物的产量，增强作物抗病虫害能力。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌菌株，其保藏编号为CGMCCNo.12335。
本发明从土壤中分离得到一株解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciensKMK01)菌株，将该菌株加入到生物有机肥中，能够改善作物根系微生物群落结构，增加土壤中微生物数量，能够改良土壤结构，防止土壤板结，能够有效改善土壤酸化，提高种植作物的产量，增强作物抗病虫害能力。
在本发明提供的实施例中，保藏编号为CGMCCNo.12335的解淀粉芽孢杆菌菌株的制备方法为：将土壤稀释，涂布在牛肉膏蛋白胨培养基进行培养，获得单一菌落，纯化获得保藏编号为CGMCCNo.12335的解淀粉芽孢杆菌菌株。
在本发明提供的实施例中，保藏编号为CGMCCNo.12335的解淀粉芽孢杆菌菌株的制备方法中采用的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。在本发明提供的实施例中，牛肉膏蛋白胨培养基的配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15～20g，水1000mL；其pH为7.0～7.2，121℃灭菌20min。
在本发明提供的实施例中，培养采用的温度为37℃，时间为18h。
在本发明提供的实施例中，保藏编号为CGMCCNo.12335的解淀粉芽孢杆菌菌株的制备方法具体为：称取土壤，溶于无菌水中，80℃水浴15min后，将悬浮液制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6几种稀释度的溶液；取4个适当稀释梯度(10-3～10-6)的悬液涂布在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，每个稀释度至少4个平板，37℃培养18h，获得单一菌落，将单一菌落划线分离到纯菌落为止。
本发明还提供了一种生物有机肥，包括粪肥和保藏编号为CGMCCNo.12335的解淀粉芽孢杆菌菌株。
作为优选，保藏编号为CGMCCNo.12335的解淀粉芽孢杆菌菌株在生物有机肥中的活菌数大于0.2×109CFU/g。
作为优选，粪肥为秸秆肥和粪尿肥经厌氧发酵获得。
作为优选，粪尿肥与秸秆肥的重量百分比为10％～30％。
作为优选，厌氧发酵的天数为18～20天。
作为优选，生物有机肥的含水量为45％～55％。
在本发明提供的实施例中，该生物有机肥的制备方法为：将粪尿肥和秸秆肥通过沼气厌氧发酵所得的沼渣以及沼液混合，调控含水量在45％～55％，然后将分离得到的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciensKMK01)加入至粪肥中，使活菌数大于0.2×109CFU/g，每2天翻料1次，7～10天后即可完成生物有机肥的制备。
在本发明提供的实施例中，该生物有机肥的制备方法具体为：
(1)将秸秆草切断成10厘米长，分层堆于地面或坑内，每堆一层泼石灰水或草木灰水，外层糊以稀泥，夏季堆积8～10天，冬季堆积30天后加入沼气池，入池时，根据料水比例1:1适当增减水分；
(2)沼气发酵开始时，将选取的粪按秸秆重量10％～30％的比例加入发酵原料中，经过厌氧培养发酵18～20天，每2天翻料一次；发酵完成后，先在沼气池中存放10天后，沼渣和沼液转移至发酵池，将沼渣和沼液混合，调控含水量在45％～55％，再向粪肥加入保藏编号为CGMCCNo.12335的解淀粉芽孢杆菌菌株(B.amyloliquefaciensKMK01)，每2天翻料1次，7～10天后即可完成生物有机肥制备；其中，解淀粉芽孢杆菌的活菌数大于0.2×109CFU/g。
本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌菌株及生物有机肥。该解淀粉芽孢杆菌菌株的保藏编号为CGMCCNo.12335。本发明具有如下有益效果：
将保藏编号为CGMCCNo.12335的解淀粉芽孢杆菌菌株加入到生物有机肥中，能够改善作物根系微生物群落结构，增加土壤中微生物数量，能够改良土壤结构，防止土壤板结，能够有效改善土壤酸化，提高种植作物的产量，增强作物抗病虫害能力；
本发明提供的生物有机肥含有机质45％～48％、腐殖酸12％～15％、全氮1.4％～1.8％、全磷0.6％～0.8％、全钾1.1％～1.3％，总活菌的数量大于2.0×109CFU/g。实验表明，使用该生物有机肥的土壤与不使用肥料和使用化学肥料的土壤相比，细菌数量高出52.62％、62.12％，真菌数量高出16.72％、52.06％，放线菌数量高出43.36％、85.80％，土壤容重降低了3.71％、7.40％；该生物有机肥使酸性土壤pH提高0.9，更加接近中性，而使用化学肥料的土壤pH甚至略微下降；使用该生物有机肥与普通化学肥料相比较，作物产量提高21.4％，同时作物没有出现病虫害。所以表明该生物有机肥够改善作物根系微生物群落结构，增加土壤中微生物数量，能够改良土壤结构，防止土壤板结，能够有效改善土壤酸化，提高种植作物的产量，增强作物抗病虫害能力。
生物保藏说明
菌株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KMK01于2016年4月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.12335。
附图说明
图1是依据16SrDNA序列构建的菌株KMK01与相关种的系统发育树。
具体实施方式
本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌菌株及生物有机肥，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌菌株及生物有机肥中所用原料均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1解淀粉芽孢杆菌KMK01的分离与鉴定
解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciensKMK01)从土壤中分离得到，其具体的分离以及鉴定步骤如下：
培养基：牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15～20g，水1000mL，pH7.0～7.2，121℃20min灭菌)。
取6只干燥无菌试管，编号1、2、3、4、5、6，每支试管加入4.5ml无菌水。
称取10g土壤，溶于100mL无菌水中，80℃水浴15min后，吸取0.5mL悬浮液于1号试管，摇匀，从1号试管吸取0.5mL悬浮液于2号试管，类推依次制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6几种稀释度的溶液。
取4个适当稀释梯度(10-3～10-6)的悬液涂布在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，每个稀释度至少4个平板，37℃培养18h，获得单一菌落，将单一菌落划线分离到纯菌落为止，将此菌株命名为KMK01。
(1)形态和生理生化鉴定
在纯菌落菌株进行革兰氏染色后，将菌株划线分离、培养，采用光学显微镜进行革兰氏染色观察和芽胞染色观察，生理生化鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》。
形态特征：菌体呈长杆状，革兰氏染色为阳性，染色均匀，有鞭毛，鞭毛周生，具运动性，专性好氧，可形成内生芽孢，芽孢椭圆形，不膨大，位于菌体中央。菌落圆形，白色，表面粗糙，不透明，边缘不整齐，在多种培养基上均不产色素。
生理生化特征：生理生化鉴定结果如表1所示，根据菌株KMK01的生理生化特征，参照《伯杰细菌鉴定手册》初步鉴定菌株为芽孢杆菌属菌株。
表1菌株主要生理生化特征
注：+表示阳性，-表示阴性，F表示发酵型，O表示氧化型。
(2)16SrDNA序列鉴定
提取菌株基因组总DNA，采用16SrDNA通用引物进行PCR扩增，将扩增后的序列回收进行测序，测序完成后，将测序得到的16SrDNA基因序列数据在GenBank核酸数据库中进行Blast比较，以16SrDNA基因序列同源性>99％为鉴定标准。
所测得的序列与GenBank中的16SrDNA序列进行Blast相似性分析比较，菌株KMK01与解淀粉芽孢杆菌的16SrDNA序列的同源性达到了99％。根据16SrDNA序列分析结果，综合考虑菌株的细胞壁革兰氏染色、菌落形态特征、生理生化特征，鉴定菌株KMK01为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciensKMK01)。
(3)系统发育树构建
利用MEGA5.1软件，选择芽孢杆菌属8个种和短芽孢杆菌属2个种的16SrDNA序列进行同源性比对，绘制系统发育树，见图1。
实施例2生物有机肥制备
(1)将秸秆草切断成10厘米长，分层堆于地面或坑内，每堆一层泼石灰水或草木灰水，外层糊以稀泥，夏季堆积8～10天，冬季堆积30天后加入沼气池，入池时，根据料水比例1:1适当增减水分。
(2)沼气发酵开始时，将选取的猪粪按秸秆重量20％的比例加入发酵原料中，经过厌氧培养发酵20天，每2天翻料一次。发酵完成后，先在沼气池中存放10天后，沼渣和沼液转移至发酵池，将沼渣和沼液混合，调控含水量在50％，再向粪肥加入实施例1分离得到的菌种，每2天翻料1次，7天后即可完成生物有机肥制备。其中，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciensKMK01)的活菌数大于0.2×109CFU/g。
实施例3生物有机肥的效果测定
(1)土壤微生物活性的测定
该实验设3个施肥处理，分别为空白对照(不使用肥料)、实验组(使用实施例2制备的生物有机肥)、对照组(施用化学肥料：NP肥)。各处理重复3次。采用盆栽实验，每盆装5kg土，按每千克土壤含0.20g有效氮的比例加入各肥料，混匀后装盆。每盆栽种3株玉米。该实验共分两次进行，第1次实验在56天后收获，第2次实验在53天后收获。第1次收获后不再追加任何肥料，直接进行第2次实验。在第1次实验播种当天、15d、30d、45d，以及第2次实验播种当天、15d、30d、45d取土壤样品测定微生物数量。实验结果如下表所示：
表2不同处理中细菌的数量变化
表3不同处理中真菌的数量变化
表4不同处理中放线菌的数量变化
实验结果表明：盆栽过程中土壤细菌数量最多，真菌次之，放线菌数量最少。在两次实验中，不同处理组间比较，使用化肥的处理组的微生物数量均低于不使用肥与生物有机肥处理组，使用生物有机肥的可培养细菌、真菌和放线菌数量多于不施肥处理组，说明该生物有机肥施用有助于土壤微生物的生长，普通的化学肥料会抑制土壤中细菌、真菌、放线菌的生长繁殖。在第2次实验中，未二次施用生物有机肥的土壤微生物数量并未显著下降，仍然保持较高水平；而施用化学肥料的微生物数量有一定程度的降低。所以该生物有机肥能够有利于土壤中微生物繁殖生长，并且长期保持繁殖生存能力。
(2)改善土壤酸化效果测定
该实验设3个施肥处理，分别为空白对照(不使用肥料)、实验组(使用实施例2制备的生物有机肥)、对照组(施用化学肥料)。各处理重复3次。采用盆栽实验，每盆装5kg酸性土壤，按每千克土壤含0.20g有效氮的比例加入各肥料，混匀后装盆，测定土壤的pH值。然后每盆栽种3株玉米，在60天后收获，测定此时土壤pH值。实验结果如下：
表5不同处理栽种前后pH变化
处理 栽种前pH 栽种后pH pH差值
不施肥 5.7 5.6 -0.1
生物有机肥 5.7 6.6 0.9
化学肥料 5.6 5.4 -0.2
实验结果表明：使用生物有机肥的土壤在种植前后的pH变化最为明显，pH从酸性变为弱酸性，不使用任何肥料以及施用普通化学肥料的土壤在种植前后pH变化不明显，土壤pH甚至均略微变小。说明该生物有机肥改善土壤酸化效果较明显，而施用普通化学肥料会进一步导致土壤酸化。
(3)改善土壤板结效果测定
选择3块土质相同、面积为1亩种植地种植玉米，分别设置为空白对照(不使用肥料)、实验组(使用实施例2生物有机肥)、对照组(施用化学肥料)。在种植前在实验组和对照组分别按照3g/m2总氮含量施用生物有机肥和化学肥料一次，在种植期间不再施用任何肥料，然后种植玉米一季，在玉米收获后，采用环刀取土烘干称重法测定土壤容重，分0～10、10～20和20～30cm3层取样，各层取样100个，然后求平均值。实验结果如下：
表6不同处理在不同深度的土壤容重(g/cm3)
实验结果表明：施用生物有机肥的土壤容重均小于施用化学肥料和不施肥的土壤容重，而使用化学肥料的土壤容重大于不施肥的土壤容重，说明使用生物有机肥能够保持土壤疏松，而化学肥料的使用就会导致土壤板结。
(4)肥力以及抗病能力测定
选择3块面积为1亩种植地种植生姜，分别设置为空白对照(不使用肥料)、实验组(使用实施例2生物有机肥)、对照组(施用化学肥料)。在种植前在实验组和对照组分别按照3g/m2总氮含量施用生物有机肥和化学肥料一次，空白对照不施用任何肥料，然后种植生姜一季，在种植期间不使用任何农药，并记录植株发病情况。
实验结果表明，施用生物有机肥的实验组生姜平均每亩产2347kg，比对照组(2082kg)高出12.7％，比空白对照组(1830kg)高出28.3％，增产效果明显。在实验过程中，实验组的生姜没有出现黄叶、枯萎等症状，生姜生长旺盛，叶片厚，茎秆粗壮，生姜色泽好，大小均匀。相比于实验组，对照组生姜叶片小，个别出现黄叶，茎秆细，生姜大小参差不齐。同时，实验组生姜没有发生任何病虫害。实验证明：该生物有机肥具有较高肥力，能够促进作物生长，同时又能够减少作物发病率，提高作物抗病虫能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种解淀粉芽孢杆菌菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.12335。
2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述保藏编号为CGMCCNo.12335的解淀粉芽孢杆菌菌株的制备方法为：将土壤稀释，涂布在牛肉膏蛋白胨培养基进行培养，获得单一菌落，纯化获得保藏编号为CGMCCNo.12335的解淀粉芽孢杆菌菌株。
3.根据权利要求1或2所述的解淀粉芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述牛肉膏蛋白胨培养基的配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15～20g，水1000mL；其pH为7.0～7.2，121℃灭菌20min。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的解淀粉芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述培养采用的温度为37℃，时间为18h。
5.一种生物有机肥，其特征在于，包括粪肥和保藏编号为CGMCCNo.12335的解淀粉芽孢杆菌菌株。
6.根据权利要求5所述的生物有机肥，其特征在于，所述保藏编号为CGMCCNo.12335的解淀粉芽孢杆菌菌株在所述生物有机肥中的活菌数大于0.2×109CFU/g。
7.根据权利要求5或6所述的生物有机肥，其特征在于，所述粪肥为秸秆肥和粪尿肥经厌氧发酵获得。
8.根据权利要求7所述的生物有机肥，其特征在于，所述粪尿肥与所述秸秆肥的重量百分比为10％～30％。
9.根据权利要求7或8所述的生物有机肥，其特征在于，所述厌氧发酵的天数为18～20天。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的生物有机肥，其特征在于，所述生物有机肥的含水量为45％～55％。
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